Methodenartikel

Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen

770 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

19 december 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een op flow cytometrie gebaseerde methode om levensvatbare alveolaire type II epitheelcellen (AECII) te isoleren uit neonatale, juveniele of volwassen muislongen (geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd). Deze aanpak maakt downstream moleculaire en/of functionele studies van AECII mogelijk om hun rol tijdens longontsteking en infectie te identificeren.

Samenvatting

Alveolaire type II epitheelcellen (AECII) dragen cruciaal bij aan immuunregulatie in de longen en zijn daardoor sleutelcomponenten die de pulmonale homeostase orkestreren. Deze functies maken AECII bijzonder relevant in de context van infectie met luchtwegvirussen, die het onderste luchtwegepitiheel aantasten en de integriteit van de alveolaire darm verstoren. Preklinische muismodellen zijn essentiële hulpmiddelen om de rollen van AECII in de context van longontsteking en/of infectie te verduidelijken. Dit protocol biedt een gedetailleerde en reproduceerbare pijplijn voor het isoleren van levensvatbare en sterk gezuiverde AECII uit muislongen in neonatale, juveniele en volwassen stadia. De methodologie combineert mechanische dissociatie, enzymatische vertering en daaropvolgende fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om sterk verrijkte AECII-populaties te verkrijgen die geschikt zijn voor downstream moleculaire en functionele analyses. Voor toepassingen met pathogene virussen bevat het protocol een optionele fixatiestap voor paraformaldehyde (PFA), die veilige behandeling onder lagere bioveiligheidsomstandigheden mogelijk maakt zonder de integriteit van het RNA in gevaar te brengen. Met geoptimaliseerde celherstel over ontwikkelingsstadia, met tot 1,0 × 10 à6 AECII-cellen per volwassen long, ondersteunt dit protocol preklinische studies zoals virale pathogenese, epitheelfunctie en regeneratieve capaciteit.

Inleiding

Vanwege hun veelzijdige rollen in de longontwikkeling, fysiologie, immuniteit en herstelprocessen, dragen alveolaire type II epitheelcellen (AECII) vitaal bij aan het onderhoud en aan het herstel van homeostase na longletsel. Aangezien AECII primaire cellulaire doelwitten zijn van pandemische virussen zoals influenza A-virus (IAV) of SARS-CoV-2, staan hun lot en functies in de schijnwerpers van infectiebiologisch onderzoek. In deze context rapporteerden eerdere studies dat intrinsieke (bijv. genetische status1, leeftijd 2,3) evenals extrinsieke (bijv. microbiële prikkels4) signalen een grote invloed hebben op AECII-fenotypen en hun responsiviteit op omgevingstriggers zoals luchtgedragen pathogenen. Opmerkelijk is aangetoond dat pulmonale ontsteking blijvende veranderingen achterlaat in transcriptomie, proteomische en epigenetische status van AECII 5,6. De complexe cellulaire interacties van AECII in de long, evenals de bijdrage van diverse biotische en abiotische factoren aan de AECII-biologie, benadrukken het belang van geschikte in vivo modellen die het mogelijk maken deze cellen in meer detail te onderzoeken.

FACS vertegenwoordigt de huidige goudstandaardtechniek voor de verrijking en zuivering van primaire cellen uit menselijk en dierlijk weefsel, omdat het de gelijktijdige implementatie van multiparametrische selectie (of uitsluiting) mogelijk maakt en de enige methode is waarin cel-intrinsieke eigenschappen zoals grootte, granulariteit of autofluorescentie betrouwbaar kunnen worden geïntegreerd in de selectie-/uitsluitingsworkflow. Tot nu toe bieden enkele gepubliceerde protocollen methodologieën voor FACS-gebaseerde isolatie van primaire muis AECII. Sinha en Lowell rapporteerden een methode voor AECII-isolatie van volwassen muizen die vergelijkbare weefselverwerking en flowcytometrie bevat en verrijking van AECII vóór FACS door kraalgebaseerde magnetische depletie op niet-doelcellen7 omvatte. Een ander protocol beschrijft het gebruik van magnetische kralen-gebaseerde isolatie van EpCAM-positieve longcellen of het gebruik van transgene muizen die FACS-gebaseerde isolatie van AECII mogelijk maakten op basis van identificatie van SPC-positieve (GFP+) cellen met behulp van een conditioneel rapportagemuismodel8. Hoewel SPC-expressie AECII betrouwbaar identificeert in muislongen, is deze methodologie alleen toepasbaar in combinatie met een speciale muisreporterstam en sluit AECII-isolatie uit van bijvoorbeeld wildtype-muizen. Belangrijk is dat, hoewel vergelijkbare opbrengsten en zuiverheid van AECII werden gerapporteerd, geen van deze protocollen aanpassingen bood voor de isolatie van AECII van neonatale, juveniele of geïnfecteerde gastheren.

Daartoe omvat het huidige protocol een reeks aangepaste workflows voor de isolatie van zeer zuivere en levensvatbare AECII uit muizen met behulp van enzymatische vertering in combinatie met FACS. Deze geavanceerde methodologie is gebaseerd op een eerder ontwikkeld FACS-gebaseerd AECII-isolatieprotocol9 en bevat belangrijke verfijningen die de zuiverheid van AECII verbeteren door de toevoeging van extra identificatie- en uitsluitingsmarkers. Belangrijk is dat dit bijgewerkte protocol AECII-opvraging bevat via zowel "aangeraakte" als "onaangeraakte" sorteerstrategieën. Bovendien omvat dit protocol, aangezien postnatale longontwikkeling geassocieerd is met grote veranderingen in cellulaire samenstelling en structurele reorganisatie, aanpassingen om de AECII-terugtrekking uit neonatale, juveniele en volwassen longen te optimaliseren. Dit stelt in staat om AECII-biologie tijdens de ontogenese te onderzoeken, bijvoorbeeld in de context van longrijpings- of infectiebiologische studies. Deze benadering kan worden gebruikt om levensvatbare AECII te verkrijgen voor latere ex vivo kweek en infectie met IAV. Daarnaast omvat dit protocol een fixatieprocedure met behulp van het chemische fixatiemiddel paraformaldehyde (PFA). Deze stap rechtvaardigt de inactivatie van verschillende respiratorische pathogenen (bijv. SARS-CoV-2, IAV) in longcelsuspensies, wat op zijn beurt het mogelijk maakt om vervolgens monsterbehandeling te verwerken (inclusief FACS-gebaseerde AECII-isolatie) in faciliteiten met lagere biocontainmentvoorzorgsmaatregelen. Hoewel de PFA-gebaseerde fixatie latere ex-vivo AECII-kweek voor functionele studies uitsluit, maakt het het mogelijk om aanzienlijke hoeveelheden intact RNA terug te halen voor transcriptomische profilering van AECII om hun biologische rol in de context van luchtweginfecties te verduidelijken.

Protocol

Alle dieren werden gefokt en gehuisvest in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre for Infection Research onder specifieke-pathogene vrije (SPF) omstandigheden en volgens nationale en institutionele richtlijnen. Euthanasie van naïeve muizen voor latere AECII-isolatie werd uitgevoerd volgens nationale richtlijnen van de Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Mannelijke muizen met een C57BL/6 genetische achtergrond op een leeftijd van 2 dagen (neonataal), 3 weken (juveniel) of 8-12 weken (volwassen) werden gebruikt. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de muizenlong

  1. Offer de muis (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen):
    1. Voor volwassen en jonge muizen: geef een anesthesie-overdosis (bijv. ketamine/xylazine) via intraperitoneale injectie.
    2. Voor neonatale muizen: onthoofd.
      OPMERKING: Vermijd een ontwrichting van de baarmoederhals bij volwassen en jonge muizen, omdat deze procedure de luchtpijp kan beschadigen.
  2. Steriliseer de muizenvacht met 70% (v/v) ethanol.
    WAARSCHUWING: Brandbare vloeistof. Oogirritant. Blijf uit de buurt van hitte. Houd de container stevig gesloten en maak een ventrale middenlijnincisie om de inwendige organen bloot te leggen.
  3. Verwijder voorzichtig de huid en het buikvliezen.
  4. Bloed de muis uit door zowel de halsslagaders als de vena cava door te snijden, zodat het bloed uit het lichaam kan weglopen.
  5. Verwijder voorzichtig het middenrif om het hart en de longen bloot te leggen.
    OPMERKING: Let erop dat je de longen niet beschadigt. Perforatie van longweefsel zou de efficiëntie van de daaropvolgende enzymgemedieerde vertering van longweefsel aanzienlijk belemmeren.
  6. Open de ribbenkast met een schaar.
  7. Plaats een canule in de rechterventrikel van het hart en perfusie met koud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) totdat het resterende bloed uit de long is verwijderd en het longweefsel bleek wordt:
    1. Voor volwassen muizen: gebruik een 26 G canule en perfusie de long met 10 mL PBS.
    2. Voor neonatale muizen: gebruik een 30 G canule en perfusie de long met 1 mL PBS.
      OPMERKING: Laat de longen van jonge muizen niet doorbloeden om een breuk van de alveolaire structuur door te hoge druk in de longbloedvaten te voorkomen. Perfusie kan minder effectief zijn bij ontstoken longen, en de kleurverandering in longweefsel kan minder uitgesproken zijn. Indien nodig kan een bronchoalveolaire lavage worden uitgevoerd voorafgaand aan de volgende stap bij volwassen en jonge muizen.

2. Enzymatische vertering van longweefsel

  1. Volwassen en jonge muizen:
    1. Maak de luchtpijp bloot door de speekselklieren en de omliggende spieren te verwijderen.
    2. Plaats een 22 G inwoningskanule in de luchtpijp, verwijder de naald en breng de plastic katheter naar de longen.
    3. Bind een stuk garen stevig om zowel luchtpijp als katheter om het op zijn plaats te houden.
    4. Bereid het longweefsel voor door dispase te stimuleren.
      VOORZICHTIG: Kan allergie- of astmaklachten of ademhalingsproblemen veroorzaken als je het inademt. Vermijd het inademen van stof. Draag ademhalingsbescherming. Voer de inhoud/container af bij een goedgekeurde afvalverwerkingsinstallatie.) via de katheter die in de luchtpijp wordt ingebracht:
      1. Voor volwassen muizen: Voeg 2 mL dispase in.
      2. Voor jonge muizen: Voeg 500 μL dispase in.
        OPMERKING: Gebruik een spuit met een luer slip-verbinding om het uitwisselen van spuiten tussen stappen 2.1.4 en 2.1.5 te vergemakkelijken. Om een efficiënte enzymatische vertering van het longweefsel te garanderen, is het essentieel om een volledige enzymvulling van bronchoalveolaire ruimtes te garanderen.
    5. Vervang de spuit en herhaal met agarose met een lage smelt (1% (w/v), 45 °C) om de structuur tijdens de verwerking te behouden.
      1. Voor volwassen muizen: gebruik 500 μL agarose met een lage smelt.
      2. Voor jonge muizen: Gebruik 200 μL agarose met een lage smelt.
        OPMERKING: Om terugstroming van de vloeistoffen te voorkomen, laat je de spuit eraan zitten.
        OPMERKING: Voor gebruik: los agarose met een lage smelt op met warmte (95 °C), laat de agaroseoplossing afkoelen tot 45 °C, bijvoorbeeld in een thermoblok.
    6. Bedek de long met laboratoriumtissue en voeg ijs toe zodat de agarose 2 minuten kan stollen.
    7. Verwijder ijs, vloeipapier, spuit en katheter.
    8. Bind het garen om de luchtpijp te sluiten zodat het enzym in de onderste luchtwegen blijft.
    9. Verwijder hart en thymus.
    10. Knip de luchtpijp boven het garen door en verwijder de intacte long uit de borst.
    11. Breng de long over in een 15 mL buis met voorverwarmde dispase (37 °C) en incubeer het longweefsel in dispase gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (20-25 °C).
      1. Voor volwassen muizen: incubeer de long in 2 mL dispase.
      2. Voor jonge muizen: incubeer de long in 1,5 mL dispase.
  2. Neonatale muizen
    1. Verzamel en maal enkele longlobben met fijne schaar in het deksel van een 2 mL buis.
    2. Voeg 500 μL dispase toe, sluit het deksel en draai de buis om zodat het hele weefsel bedekt is met dispase.
    3. Incubeer het longweefsel in dispase bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.

3. Voorbereiding van het longweefsel

  1. Voor volwassen en jonge muizen:
    1. Verwijder de long uit de dispase en ontleed de longkwabben van de bronchiale stengel.
    2. Plaats de longlobben in een petrischaal (diameter: 8,5 cm) met 7 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (eindconcentratie) anti-CD16/32 blokkerende antilichamen en 100 μL DNAse (eindconcentratie ~600 Kunitz-eenheden).
      VOORZICHTIG: Kan allergie- of astmaklachten of ademhalingsproblemen veroorzaken als je het inademt. Vermijd het inademen van stof. Draag ademhalingsbescherming. Voer de inhoud/container af bij een goedgekeurde afvalverwerkingsinstallatie.
    3. Het longweefsel wordt opgesplitst met een tang.
      OPMERKING: Om een efficiënte enzymatische vertering van het longweefsel te garanderen, is het essentieel om een grondige mechanische weefseldesintegratie te waarborgen.
    4. Incubeer 10 minuten op kamertemperatuur terwijl je zachtjes wiegt op 200 rpm.
      OPMERKING: Celsuspensie kan worden opgeslagen bij 4 °C tot de volgende stap, indien nodig.
  2. Voor neonatale muizen:
    1. Breng de dispase, inclusief het verteerde weefsel, over naar een petrischaal (diameter: 5,4 cm) met 3 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (eindconcentratie) anti-CD16/32 blokkerende antilichamen en 100 μL DNAse (eindconcentratie ~ 600 Kunitz-eenheden).
    2. Incubeer 10 minuten op kamertemperatuur terwijl je zachtjes wiegt op 200 rpm.
      OPMERKING: Celsuspensie kan worden opgeslagen bij 4 °C tot de volgende stap, indien nodig.
  3. Ga door voor alle leeftijdsgroepen:
    1. Filter de celsuspensie door een reeks nylon celstrainers met afnemende poriegrootte (100 μm - 70 μm - 40 μm) om vuil en grote aggregaten te verwijderen.
    2. Spoel de celfilters en buizen zorgvuldig af om het verlies van cellen te minimaliseren. In geval dat monsters worden samengevoegd, kunnen celsuspensies van muizen uit dezelfde groep door dezelfde celstrainers worden geleid.
      OPMERKING: In geval van verstopping, vervang dan de celfilters.
    3. Afhankelijk van het volume wordt de gefilterde celsuspensie overgebracht naar een of meer 15 mL buizen en de celsuspensie 12 minuten centrifugeerd bij 140 x g bij 4 °C.
    4. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in de erytrocyte lysis buffer (ACK-buffer).
      1. Voor volwassen en jonge muizen: Gebruik 2 ml erythrozytenlysebuffer en incubeer 2 minuten.
      2. Voor neonatale muizen: Gebruik 3 ml erytrocytenlysebuffer en incubeer 3 minuten.
    5. Stop erytrocytenlyse door de 15 mL buis te vullen met DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS en centrifugeer opnieuw 12 minuten bij 140 x g bij 4 °C.

4. Antilichaamkleuring voor fluorescentie-geactiveerde celsortering

  1. Sussief de cellen opnieuw in een antilichaamkleuringsoplossing met anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 en anti-CD326 fluorochroomgekoppelde antilichamen, bereid in DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    OPMERKING: Voor optimale kleuringsresultaten gebruik je alleen voorgetitreerde antistoffen. Als AECII onaangeroerd moeten blijven voor celsortering, voeg dan geen anti-CD326 toe aan de antistofkleuringsoplossing.
    1. Voor volwassen muizen: Gebruik 600 μL antistofoplossing per long.
    2. Voor jonge muizen: Gebruik 400 μL antistofoplossing per long.
    3. Voor neonatale muizen: Gebruik 200 μL antistofoplossing per long.
  2. Incubeer de celsuspensie met de antilichamen gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker.
  3. Na de incubatie was je de cellen door de buis te vullen met DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Centrifugeer 12 minuten op 140 x g bij 4 °C.
  5. Suspensie de cellen DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Voor volwassen muizen: Opnieuw suspensieren in 300 μL per long.
    2. Voor jonge muizen: Suspensie in 200 μL per long.
    3. Voor neonatale muizen: Opnieuw ophangen in 100 μL per long.

5. Sortering van AECII

OPMERKING: Instrumentvoorbereiding: installeer een 100 μm nozzle voor het sorteren van AECII met behulp van een FACS-apparaat.

  1. Direct voor het sorteren filtert u cellen door een 50 μm celzeef. Spoel de celfilter af met DMEM aangevuld met HEPES en 10% (v/v) FBS om overmatig celverlies te voorkomen:
    1. Volwassen muizen: Spoel de celfilter af met 300 μL per long.
    2. Jonge muizen: Spoel de celzeef af met 200 μL per long.
    3. Neonatale muizen: Spoel de celzeef uit met 100 μL per long.
  2. Sussen de cellen opnieuw door direct voor sortering te vortexen.
  3. Gate voor AECII door gebeurtenissen te identificeren die I) hoge zijverstrooiing (SSChoog), II) negatief zijn voor de fluorochromen van de lijn, en III) positief zijn voor het CD326-fluorchroom gekoppeld aan het anti-CD326-antilichaam.
    OPMERKING: Gebruik fluorochromen met hoge tot zeer hoge helderheidsindices (zoals APC, PE en BV785) om onderscheid tussen niet-AECII en AECII te vergemakkelijken. Voor een onaangeroerde sorteermethode (uitsluiting van anti-CD326 in de kleuringsoplossing) worden AECII geïdentificeerd als lineage-negatief, SSChoog en autofluorescentie-positief/hoog cellen. AECII-autofluorescentie kan worden geïdentificeerd in groenlichtdetectoren, bijvoorbeeld FITC- of GFP-detectoren.
  4. Sluit doublets of aggregates uit met behulp van voorste verstrooiingshoogte versus gebied (FSC-H vs. FSC-A) en zijwaartse verstrooiingshoogte versus gebied (SSC-H vs. SSC-A).
  5. Verzamel de gesorteerde cellen in een buis met DMEM, aangevuld met HEPES en 10% (v/v) FBS en centrifuge voor verdere analyse of kweek.

6. RNA-isolatie van PFA-gefixeerde AECII (optioneel)

OPMERKING: Indien AECII wordt geïsoleerd van muizen die zijn geïnfecteerd met, bijvoorbeeld respiratorische virale pathogenen, moet AECII-isolatie worden uitgevoerd onder BSL2- of BSL3-omstandigheden, afhankelijk van de ziekteverwekker. Als de experimentator geen toegang heeft tot celsortering onder de juiste veiligheidsomstandigheden, kan AECII, geïsoleerd met het hierboven beschreven protocol, worden gecorrigeerd met PFA na antistofkleuring. Deze stap inactiveert pathogenen10,11 en daardoor kan daaropvolgende flowcytometrische AECII-sortering plaatsvinden onder BSL1-omstandigheden. Hoewel de cellen niet langer kunnen worden ingezet voor functionele assays vanwege het fixatieproces, zijn ze geschikt voor moleculaire analyses.

  1. Voor inactivatie van virussen wordt antilichaam-gelabelde singlecell-suspenties vastgesteld in 500 μL van 4% (w/v) PFA.
    VOORZICHTIG: Brandbaar vaste stof. Schadelijk als je het doorslikt of inademt. Veroorzaakt huidirritatie, ernstige oogschade. Kan een allergische huidreactie, ademhalingsirritatie en kanker veroorzaken. Vermoedelijk van het veroorzaken van genetische defecten. Blijf uit de buurt van hitte. ALS JE HET DOORSLIKT: BEL EEN GIFCENTRUM/ARTS ALS JE JE NIET GOED VOELT. ALS JE HET INADEMT: BRENG DE PERSOON NAAR FRISSE LUCHT EN HOUD HEM COMFORTABEL OM IN TE ADEMEN. Bel een POISON CENTER/arts als je je niet goed voelt. ALS HET IN DE OGEN ZIT: SPOEL VOORZICHTIG ENKELE MINUTEN MET WATER. Verwijder contactlenzen, als ze aanwezig zijn en makkelijk te doen. Blijf spoelen. ALS JE BLOOTGESTELD BENT OF JE ZORGEN MAAKT: VRAAG MEDISCH ADVIES/AANDACHT.
    OPMERKING: In overeenstemming met de 3R-richtlijnen werden AECII van niet-geïnfecteerde muizen gebruikt in deze studie. AECII waren 10 minuten bij kamertemperatuur vastgelegd. De duur van de fixatie moet individueel worden getest voor elke pathogeen die een potentieel risico vormt voor mensen en het milieu. Vervolg sorteren onder S1-omstandigheden vereist voorafgaande verificatie in een BSL2- of BSL3-laboratorium dat er geen repliceerbaar virus aanwezig is na PFA-fixatie.
  2. Na fixatie was je cellen met DMEM en centrifugeer je 15 minuten op 140 x g.
  3. Sussief de cellen opnieuw in 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS en laat de celsuspensie door een 100 μm celzeef gaan.
  4. Spoel de celzeef met een extra 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS-medium om overmatig celverlies te voorkomen.
  5. Sorteer cellen zoals beschreven in stap 5. "Sortering van AECII".
    OPMERKING: Na verplichte experimentele verificatie dat een virus is geïnactiveerd door behandeling met 4% (w/v) PFA, kan AECII worden gesorteerd onder BSL1-omstandigheden.
  6. Voor RNA-isolatie uit PFA-gefixeerde cellen gebruik je de RNeasy FFPE Kit.
    WAARSCHUWING: Deze kit bevat gevaarlijke chemicaliën. Volg de instructies van de fabrikant. Let op het bijgevoegde veiligheidsgegevensblad, met de volgende aanpassingen:
    1. Na het sorteren centrifugeer je de cellen 15 minuten op 140 x g bij 4 °C.
    2. Sussen de cellen opnieuw in 150 μL Buffer PKD en overbrengen in een 1,5 mL buis.
    3. Voeg 10 μL Proteinase K toe en incubeer bij 56 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door incubatie bij 80 °C tot 15 minuten, afhankelijk van het celaantal (zie Tabel 1).
  7. Ga door met het RNA-isolatieproces volgens het protocol, inclusief DNase-behandeling, wasstappen en uiteindelijke eluatie in 30 μL RNase-vrij water.

Resultaten

Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een geoptimaliseerde en gedetailleerde methode om AECII te isoleren en te analyseren uit muizenlongweefsel in verschillende ontwikkelingsstadia, variërend van neonatale tot juveniele en volwassen muizen. De methodologie omvat mechanische en enzymatische longdissociatie, gecombineerd met een geoptimaliseerde flowcytometrische celsorteerworkflow, waarbij aangepaste protocollen worden gebruikt die geschikt zijn voor het verwerken van monsters van geïnfecteerde dieren voor latere Flow Sorting onder BSL1-omstandigheden.

De experimentele gegevens toonden een hoge effectiviteit van deze isolatieprocedure (samengevat in Figuur 1) bij de productie van levensvatbare en zeer zuivere (>95%) AECII-populaties. Flow-sorting genereerde pure AECII-populaties, waarbij post-sorteeranalyse bijna 100% specificiteit voor gevestigde cellulaire markers valideerde (Figuur 2). Kwantificering van postsorteercelmonsters gaf hoge opbrengsten aan tussen 0,15 × 106 levensvatbare AECII uit neonatale longen en 1,0 × 106cellen uit volwassen monsters per hele longpreparaat (Figuur 3A). Geïsoleerde AECII behielden de typische morfologie (Figuur 3B) en cellulaire integriteit gedurende het isolatieproces (Figuur 3C). Daarnaast werd de toepasbaarheid van het protocol voor functionele studies bevestigd door succesvolle ex vivo infectie met behulp van een muis-aangepaste IAV (H1N1, stam A/Puerto Rico/8/34) die het mCherry reporter-eiwit (IAV-mCherry12) tot expressie bracht, met een demonstratie van het vermogen van de cellen om virale replicatie te ondersteunen (Figuur 4).

Om experimentele workflows te ondersteunen die monsterfixatie vereisen, bevat het protocol een gespecialiseerde RNA-extractiemethode met PFA-fixatie. Grondig onderzoek van de RNA-kwaliteit van PFA-gefixeerde AECII op verschillende verwerkingstijden gaf aan dat hoogwaardig RNA dat geschikt is voor downstream moleculaire analyses betrouwbaar uit gefixeerde monsters kan worden geëxtraheerd (Tabel 1). De kwaliteit van het geëxtraheerde RNA vertoonde een direct verband met de duur van de thermische behandeling bij 80 °C tijdens de extractieprocedure, wat duidelijke optimalisatierichtlijnen bood op basis van specifieke experimentele behoeften (Tabel 1, Figuur 5). Validatie door kwantitatieve reverse transcription PCR (qRT-PCR) analyse toonde succesvolle amplificatie van zowel housekeeping-genen (ribosomaal eiwit S9, Rps9) als AECII-specifieke markers (oppervlakteactieve eiwit C, Sftpc) met PFA-gefixeerde monsters en verse controlepreparaten (Figuur 6).

figure-results-1
Figuur 1: Schematische workflow voor AECII-isolatie uit neonatale, juveniele en volwassen muizenlongen met behulp van enzymatische weefseldigestie en flowcytometrische celsortering. Het diagram illustreert de systematische verwerking van muizenlongen uit verschillende leeftijdsgroepen. Euthanasie van muizen en longextractie wordt gevolgd door meerstaps-enzymatische vertering met dispase voor weefseldesintegratie. Na mechanische verstoring worden cellen gezuiverd via een reeks filtratiestappen met afnemende poriegroottes. Vervolgens worden erytrocyten gelyseerd. Specifieke verrijking van AECII wordt bereikt door negatieve selectie met antilichaamlabeling tegen hematopoëtische markers (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), endotheelmarker CD31, bloedplaatmarker CD93 en bronchiale epitheelcelmarker CD24, positieve selectie van epitheelcellen met behulp van een antilichaamlabeling tegen CD326 en daaropvolgende flowcytometrische sortering op basis van de karakteristiekeSSC-hoge profiel van granulaire AECII. Dit protocol maakt de isolatie mogelijk van zeer zuivere (≥ 95%), levensvatbare primaire AECII voor downstream functionele en moleculaire analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve gatingstrategie gebruikt voor de isolatie van AECII uit volwassen muizen. (A) Long-eencelsuspensies werden gekleurd met antilichamen tegen de volgende antigenen: F4/80, CD93, CD11c (gekoppeld aan APC), en CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (gekoppeld aan PE) en CD326 (gekoppeld aan BV785). (B) Heranalyse (A) voor zuiverheidsanalyse. Gesorteerde AECII werden opnieuw geanalyseerd om de 97,2% zuiverheid van AECII te bevestigen. (C) Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van AECII na sortering. De kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Intracellulaire kleuring werd uitgevoerd met een primair anti-SPC antilichaam (soort: konijn), en secundaire kleuring werd uitgevoerd met geiten-antikonijn IgG gekoppeld aan Alexa 594 (rood). AECII gekleurd met alleen DAPI en secundaire antistoffen, en splenocyten gekleurd met primaire en secundaire antilichamen dienden als relevante controles, wat wijst op specifieke binding van anti-SPC en anti-rabbitAlexa 594. Schaalbalken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Opbrengst, morfologie en vitaliteit van AECII na fluorescentie-geactiveerde celsortering. (A) Totaal aantal levensvatbare AECII per long verkregen van neonatale, juveniele en volwassen muizen. (B) Lichtmicroscopiebeeld van gesorteerde AECII na sortering. Schaalbalk: 75 μm. (C) AECII-levensvatbaarheid waargenomen door trypanblauwe kleuring na sortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Ex vivo infectie van gesorteerde AECII met IAV-mCherry. AECII-cellen geïsoleerd van volwassen muizen werden ex vivo gekweekt in matrigel-gecoate weefselkweekplaten om hechting mogelijk te maken. Vervolgens werden de cellen 8 uur lang geïnfecteerd met IAV-mCherry (meervoudige infectie 2). Er werd een tijdsafhankelijke toename van de mCherry-signaalintensiteit waargenomen. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: RNA-integriteit van 4% PFA-gefixeerde AECII. Representatieve RNA-profielen van PFA fixeerden en sorteerden AECII na RNA-isolatie met behulp van de Qiagen FFPE RNeasy Kit met aanpassingen. Specifieke pieken voor 18S en 28S rRNA, samen met het RNA kwaliteitsgetal (RQN), geven de RNA-integriteit en -kwaliteit weer voor intact geïsoleerd RNA van PFA-gefixeerde AECII. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Amplificatiecurves van het Rps9 housekeeping-gen en het AECII-specifieke gen Sftpc uit controle (onbehandeld) en 4% PFA fixeerde AECII. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VoorbeeldIncubatietijd bij 80 °C28S/18SRQNRNA conc. [ng/μ]
Regeling 0,5x106-2105.8
Controle 1x106-1.91012.3
PFA vast 0,5x106526.45.5
PFA vast 0,5x106101.98.13.7
PFA vast 0,5x106151.88.22.76
PFA vastgesteld 1 x106528.26.26
PFA vastgesteld 1 x106101.18.45.12
PFA vastgesteld 1 x106150.98.55

Tabel 1: Kwaliteit van RNA geïsoleerd uit 4% PFA vaste AECII - impact van verschillende fixatietijden. RNA van AECII werd geïsoleerd volgens het protocol van de fabrikant (FFPE RNeasy Kit) met aanpassingen beschreven in stap 6. De gefixeerde cellen werden geïncubeerd bij 80 °C gedurende 5 minuten, 10 minuten of 15 minuten om het RNA uit het monster te elueren. De integriteit van RNA werd bepaald met behulp van de Fragment Analyzer van Agilent

Discussie

Het hier beschreven geoptimaliseerde protocol biedt een betrouwbare en reproduceerbare aanpak voor de isolatie en analyse van AECII uit muizenlongweefsel op neonatale, juveniele en volwassen leeftijd. Bovendien biedt het een optionele PFA-fixatiestap vóór sortering, waardoor AECII onder BSL1-omstandigheden uit muizen kan worden gesorteerd, zelfs als ze eerder geïnfecteerd zijn met ademhalingspathogenen. Door de combinatie van zorgvuldig uitgevoerde longblootstelling en perfusie, gevolgd door intratracheale instillatie van enzymen en laagsmeltende agarose in de long, wordt de weefselstructuur behouden, waardoor hoogwaardige single-cell suspensies voor downstream analyse kunnen worden teruggewonnen. De toevoeging van flowcytometrische sortering op zijverstrooiingseigenschappen, lineage-negatieve gating en positieve selectie voor CD326-positieve cellen resulteerde in opmerkelijk zuivere populaties van AECII. Deze zuiverheid is van bijzonder belang om ervoor te zorgen dat moleculaire en functionele assays stroomafwaarts representatief zijn voor de intrinsieke AECII-biologie en niet worden verstoord door het besmetten van celtypen, wat de interpreteerbaarheid van genexpressie- en virus-gastheerinteractiestudies verbetert.

Het bovengenoemde protocol omvat uitsluiting van niet-AECII met behulp van een breed scala aan fluorescentief-gelabelde antilichamen gericht tegen leukocytaire en niet-leukocytaire antigenen en daaropvolgende positieve selectie van AECII via zijverstrooiingseigenschappen en expressie van het epitheelcellenspecifieke molecuul CD326. Hoewel is aangetoond dat deze methodologie resulteerde in zeer zuivere AECII-populaties (met SPC, een kenmerkende AECII-marker), kon de zuiverheid van de verkregen populaties tot nu toe alleen worden bevestigd met postsorteer-intracellulaire kleuring. Dit protocol kan worden toegepast om AECII te isoleren uit door SARS-CoV-2 en influenzavirus geïnfecteerde longen, waarbij AECII voornamelijk door het virus worden aangepakt en onderscheidende cellulaire aanpassingenvertonen 1. Deze methode is echter mogelijk niet geschikt om muis-AECII te isoleren in de context van longkankerbiologiestudies, aangezien EpCAM (CD326) ook tot expressie komt door longkankercellen bij muizen en mensen13. Voor deze studies kan het gebruik van transgene muisstammen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen onder de transcriptionele controle van de Spc-promotor een geschiktere benadering bieden voor de betrouwbare isolatie van primaire AECII.

Een opbrengst van 0,15 × 106 levensvatbare AECII per neonatale long en tot 1,0 × 106 cellen per volwassen long illustreert de efficiëntie en schaalbaarheid van het protocol. Een groot obstakel voor het succesvol isoleren van grote AECII-hoeveelheden is inefficiënte enzymatische vertering en mechanische desintegratie van het longweefsel. Het is daarom cruciaal om de bronchoalveolaire ruimtes volledig te vullen met het enzym in stap 2.1.4 en om in stap 3.1.3 zorgvuldig mechanische weefseldesintegratie uit te voeren. Effectieve enzymatische vertering levert een troebele celsuspensie op met minimale bijdrage van zichtbare aggregaten, die meestal met een zuiger kunnen worden gedesintegreerd in de volgende filterstappen. Grotere aggregaten die niet door de celzeef kunnen worden gelaten, ontstaan meestal als gevolg van onvoldoende enzymatische vertering. Let op dat het niet wordt aangeraden de enzymatische verteringstijden te verlengen, omdat dit de latere immunokleuring14 negatief kan beïnvloeden en daarmee de nauwkeurigheid van FACS-gebaseerde AECII-isolatie.

Naast de efficiëntie van enzymatische en mechanische weefseldesintegratie kan de genetische achtergrond invloed hebben op de opbrengst van AECII. Voor dit protocol werden muizen op een C57BL/6-achtergrond gebruikt. In lijn met gerapporteerde ontwikkelingsspecifieke verschillenvan 15, immunologisch16 en fysiologisch17, 18, 19, is het denkbaar dat het gebruik van andere laboratoriummuisstammen (bijv. BALB/c, DBA) kan leiden tot verschillende AECII-opbrengsten. Bovendien kan de opbrengst van AECII uit ontstoken longen (infectieus of niet-infectieueel) aanzienlijk worden verminderd. Dit kan het gevolg zijn van indirecte (inflammatoire) of directe (pathogeen-gemedieerde) celdood van AECII, die belangrijke doelwitten vormen voor bijvoorbeeld IAV20,21 en SARS-CoV-2 22,23,24.

Het behoud van cellulaire integriteit tijdens mechanische dissociatie, enzymatische vertering en stroomsortering is verder essentieel voor downstream moleculaire en/of functionele analyses. Daarom werden de levensvatbaarheid van AECII en cellulaire functie na sortering beoordeeld. AECII konden zich aan Matrigel houden en een karakteristieke, lamellaire, lichaamrijke morfologie behouden gedurende minstens 24 uur, wat wijst op functionele competentie na isolatie en geschiktheid voor ex vivo kweek (inclusief infectiemodellen).

De efficiënte infectie van gesorteerde AECII met IAV-mCherry reporter virus12 en de observatie van sterke virale replicatie valideren dit systeem als een robuust platform voor het ontrafelen van epitheliale-intrinsieke antivirale reacties. Aangezien AECII belangrijke processen reguleren die betrokken zijn bij de biosynthese van tensidenten, alveolaire regeneratie en aangeboren immuniteit25,26, zal het vermogen om IAV-replicatiekinetiek en transcriptieresponsen van de gastheer in gezuiverde AECII-populaties te onderzoeken inzichten bieden die niet verkregen zijn in gemengde celpreparaten.

Een belangrijke innovatie van dit protocol is de opname van een fixatieprocedure, waardoor een zij-aan-zij analyse van verse en geïnactiveerde monsters mogelijk is. De PFA-fixatie en aangepaste FFPE-RNA-extractieprocessen behouden de integriteit van RNA in een mate die compatibel is met downstream transcriptomische analyses, zoals blijkt uit succesvolle kwantitatieve reverse-transcriptie PCR (qPCR).

Fixatietijden voor PFA kunnen de kwaliteit van de kleuring beïnvloeden en daarmee het herstel van AECII door FACS. Bovendien worden de opbrengst en kwaliteit van RNA over het algemeen beïnvloed door fixatieprocessen. Afhankelijk van het in vivo infectiemodel dat wordt gebruikt, moeten deze aspecten worden meegenomen voor het experimentele ontwerp. Het wordt aanbevolen om uitgebreide fixatietijd te vermijden en in plaats daarvan de duur van de PFA-behandeling te optimaliseren zodat de minimaal noodzakelijke tijd wordt gebruikt, wat experimenteel is bewezen om volledige inactivatie van het betreffende virus te waarborgen.

De beoordeling van de hoeveelheid ribosomaal RNA (rRNA) met behulp van een microfluidica-instrument dient als een surrogaat om de mRNA-kwaliteit in biologische monsters te schatten. Het beschreven AECII-fixatie-/RNA-isolatieprotocol maakt het mogelijk om intact RNA met voldoende kwaliteit te isoleren voor downstream transcriptomische analyses, zoals blijkt uit 28S/18S rRNA-verhoudingen >1 en RNA-kwaliteitsgetal (RQN) waarden >8. Het is belangrijk op te merken dat de incubatiestap van 80 °C de RNA-opbrengst en kwaliteit kritisch vermindert. Aanpassing van thermische behandelingstijden kan optioneel worden toegepast om RNA-opbrengst en kwaliteit te verhogen voor downstream toepassingen.

Gezamenlijk bieden deze methodologische verbeteringen een uitgebreide toolkit voor de studie van AECII-biologie in de context van gezondheid, infectieziekten en ontwikkeling (van pasgeboren tot volwassene). De hoge opbrengst en zuiverheid van AECII die met deze methode worden geïsoleerd, maken multi-omic profilering mogelijk, waaronder transcriptomische, proteomische en chromatine toegankelijkheidsassays, evenals functionele assays (bijv. ex vivo infectie) om relevante mechanismen van AECII in vivo verder te ontleden.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Tatjana Hirsch en Friederike Kruse bedanken voor hun deskundige technische hulp, Lisa Hönicke en Justine Smout voor hun behulpzame discussies, en Yoshihiro Kawaoka voor het leveren van het IAV-mCherry reportervirus. Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting) - TRR 359 - Projectnummer 491676693 (aan D.B. en J.H.), het COVIPA-initiatief (KA1-Co-02, Helmholtz Vereniging; aan D.B.), en een subsidie van de Duitse Onderzoeksstichting (BO 7036/1-1; aan J.D.B.). Wij erkennen steun van het Open Access Publicatiefonds van de Medische Faculteit van de Otto-von-Guericke-Universiteit Magdeburg.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACK buffer--8.29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 µL van 0. 5 M EDTA, voeg 1000 mL Milli-Q toe, pas pH aan tot 7.2 tot 7.4
anti-mouse CD11beBioscience12-0112-83clone M1/70; PE gekoppeld
anti-mouse CD11cBiolegend117310clone N418; APC gekoppeld
anti-mouse CD16/32BD Biosciences553141clone 93; gezuiverd
anti-mouse CD16/32BD Biosciences561727clone 2.4G2; PE gekoppeld
anti-mouse CD19Biolegend115508clone 6D5; PE gekoppeld
anti-mouse CD24Biolegend101808clone M1/69; PE gekoppeld
anti-mouse CD31Biolegend102408clone 390; PE gekoppeld
anti-mouse CD326Biolegend118245clone G8.8; BV785 gekoppeld
anti-mouse CD45BD Biosciences553081clone 30-F11; PE gekoppeld
anti-mouse CD93eBioscience17-5892-82clone AA4-1; APC gekoppeld
anti-mouse F4/80Biolegend123116clone BM8; APC gekoppeld
anti-mouse SPC abcamab211326host soort: konijn; clone: EPR19839; gezuiverd
Aria-FusionBD BiosciencesCelsorteerder
Aria-II SORPBD BiosciencesCelsorteerder
Biozym Plaque AgaroseBiozym8401011 % (w/v) in H2O
Cell strainer (100 µm, 70 µm, 40 µm)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 µm)Sysmex04-004-2327
Deoxyribonuclease I uit runderenpancreas, 2000 Kunitz eenheden/flesjeSigma-AldrichD4263vers opgelost inhoud van 1 flesje in 330 µL DMEM
Dispase, 100 mL (5000 caseinolytische eenheden)Corning354235voer steriele filtratie uit (porengrootte 0.22 µm), bereid 4 mL aliquots in 15 mL buisjes, bewaar bij -20 °C
DMEMGibco31885-049lage glucose, met pyruvaat, voeg HEPES toe (eindconcentratie van 25 mM)
FACS DivaBD BiosciencesSorteersoftware
FlowJoEvaluatiesoftware voor FACS-gegevens
goat anti-rabbitAlexa 594 gekoppeld
Indwelling cannula Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitQiagen73504
Symphony S6 SEBD BiosciencesCelsorteerder

Referenties

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

Herprints en machtigingen

Tags

Alveolaire type II cellenisolatie van muizenlongenfluorescentie geactiveerde cel sorteringenzymatische digestiemechanische dissociatierespiratoire virusinfectiepulmonale homeostaseparaformaldehyde fixatiesurfactantprote ne Ckwantitatieve RT PCR
Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.