Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

846 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

30 december 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Samenvatting

Laagdrempelige mechanoreceptoren (LTMR's) zijn somatosensorische neuronen die onschuldige lichte aanrakingsprikkels detecteren, zoals vibratie, haarvervorming en druk. Ze vormen subtype-specifieke axonale terminalen in de randzone en projecteren axonen centraal op het ruggenmerg om tactiele informatie over te dragen. Het huidige begrip van LTMR-ontwikkeling en organisatie komt voort uit vaste weefsels die de dynamische en temporele processen van axonale bedrading en herstructurering niet kunnen onthullen. Hier wordt een tweefotonbeeldvormingsmethode gepresenteerd om LTMR-axonmorfologie in de muisvoorpoot tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen te visualiseren. Twee-fotonmicroscopie kan beeldvorming met hoge resolutie in intacte huid bereiken, waardoor herhaalde beeldvorming van dezelfde axonterminalen over postnatale tijdstippen mogelijk is. Twee-fotonbeeldvorming kan worden gecombineerd met nieuwe genetische instrumenten van muizen om axonontwikkeling met subtype-specificiteit te onthullen. Chronische beeldvorming van LTMR's maakt studies mogelijk van circuitassemblage en reparatie na een letsel. Deze benaderingen bieden een in vivo systeem dat nieuwe inzichten zal bieden in de cellulaire mechanismen die de ontwikkeling en regeneratie van somatosensorische axonen reguleren.

Inleiding

Aanraking is het vroegste zintuig dat zich ontwikkelt en speelt een centrale rol in hoe organismen de fysieke wereld ervaren en erop reageren. Aanraking wordt gedetecteerd door laag-drempel mechanoreceptoren (LTMR's), die subtypen zijn van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen die onschuldige mechanische prikkels detecteren, waaronder indruk, vibratie en haarafbuiging 1,2. LTMR's zijn pseudounipolair en breiden perifere axonen uit naar de perifere weefsels om subtype-specifieke terminalen te vormen. Hun centrale axonen geven tastbare informatie door aan het centrale zenuwstelsel door synaptische verbindingen te vormen met ruggenmergneuronen3. Hoe touchcircuits echter worden opgezet en onderhouden is slecht begrepen.

Eerdere fundamentele studies bij katten in de jaren zestig en zeventig identificeerden voor het eerst deze functioneel verschillende mechanoreceptoren en hun responseigenschappen in harige huid 4,5. LTMR-subtypes worden geclassificeerd op basis van hun unieke morfologie, geleidingssnelheid en responseigenschappen2. De belangrijkste LTMR-subtypes zijn Aβ die zich snel aanpassen (RA) en langzaam aanpassen (SA) LTMR's, Aδ-LTMR's en C-LTMR's 2,6,7. Aβ RA-LTMR's, Aδ-LTMR's en C-LTMR's vormen longitudinale lancetvormige complexen rond haarzakjes2. Aδ-LTMR's vormen gepolariseerde lanceolatende uiteinden rond haarzakjes aan de staartzijde, een kenmerk dat essentieel is voor hun richtingsselectieve respons op haarafbuiging7. Axonale uiteinden in de lancetvormige complexen zijn nauw uitgelijnd met haarschachten en worden omhuld door vingerachtige uitsteeksels van terminale Schwann-cellen, die trofische ondersteuning bieden en axonale morfogenesebeïnvloeden 8,9,10. In glabrous huid eindigen Aβ RA-LTMRs axonen in Meissner-corpuskelen, dat zijn ovaal gevormde structuren binnen dermale papillen die zijn afgestemd op beweging over de huid 2,11.

De organisatie van LTMR-axonale terminals wordt tijdens de ontwikkeling geregeld door zowel intrinsieke programma's als huidafhankelijke signalen12,13. Wanneer beschadigd, wordt LTMR-disfunctie geassocieerd met pathologische aandoeningen zoals mechanische allodynie12,14. Toch blijven de mechanismen voor de ontwikkeling en het onderhoud van LTMR in de intacte huid onduidelijk. Veel van wat bekend is over hun ontwikkeling komt voort uit vaste weefsels, die de dynamische processen die mogelijk in vivo plaatsvinden niet kunnen vastleggen. Zo vertonen Aβ RA-LTMR's en Aδ-LTMR's actieve innervaties rond haarzakjes en axonale snoei tijdens de vroege postnatale ontwikkeling19. Hoe innervatie en onderhoud van haarzakjes in vivo worden bereikt, is nog onbekend.

Twee-foton laserscanning microscopie, een geavanceerde beeldvormingstechniek die het mogelijk maakt fluorescerend gelabelde structuren in levend weefsel te visualiseren, heeft hogeresolutie in vivo beeldvorming van dynamische fysiologische processenmogelijk gemaakt 20,21. Tijdens twee-fotonbeeldvorming exciteren korte pulsen van nabij-infrarood licht fluoroforen alleen in het brandpuntsvlak, waardoor het signaal beperkt wordt tot een klein volume en de onscherpe fluorescentie21,22 wordt geminimaliseerd. Deze opsluiting vermindert de fototoxiciteit aanzienlijk en maakt driedimensionale, ruimtelijk opgeloste beeldvorming van structurenmogelijk 20,23,24. Bovendien verstrooien de langere excitatiegolflengten die in twee-fotonmicroscopie worden gebruikt minder binnen het weefsel, wat zorgt voor diepere penetratie en minder ruis in complexe omgevingen 20,25,26. Zo toonde tweefotonbeeldvorming structurele synaptische plasticiteit en neuronale activiteiten aan in dorsale hoornneuronenvan het ruggenmerg 27,28,29. Daarnaast onthulde chronische in vivo tweefotonenbeeldvorming van haarzakjes inzichten over hun homeostase inde huid van het muizenoor. Daarom is tweefotonmicroscopie zeer geschikt voor het bestuderen van LTMR-structuren in de huid in vivo, vooral wanneer herhaalde, langdurige beeldvorming nodig is om ontwikkelings- en chronische veranderingen te volgen.

Wanneer gecombineerd met genetisch gemodificeerde muislijnen die fluorescerende reporters tot expressie brengen, kan tweefotonenmicroscopie neuronale morfologie in de huid onthullen3. In het somatosensorische systeem labelt het gele fluorescerende eiwit (YFP), dat onder controle van de thy1-promotor (Thy1-YFP30) tot expressie komt, selectief Aβ-LTMR-lanceolaire complexen in harige huid en Meissner-corpuskels in glabroushuid 30,31. Bij Thy1-YFP-muizen zijn gelabelde axonen positief voor myeline-basiseiwit en neurofilament, die markers zijn voor gemyeliniseerde Aβ-axonen30,31. Daarnaast labelt TrkBCreER, waarbij tamoxifen-induceerbare Cre-recombinase (CreER) wordt aangedreven door de expressie van het TrkB (tropomyosine receptorkinase B) gen, selectief Aδ-LTMR's tijdens de ontwikkeling7. In de huid is twee-fotonmicroscopie het meest effectief voor het beelden van LTMR's bij verdoofde muizen, omdat beweging door de muis de beeldopname met hoge resolutie zou beïnvloeden. Het kost tijd om fluorescerende eiwitten aan de axonale uiteinden te visualiseren na CreER-geïnduceerde expressie, en de minimale wachttijd moet voor elke transgene lijn worden bepaald. In het algemeen kan deze methodologie worden toegepast op het visualiseren van LTMR's bij muizen van alle ontwikkelingsstadia en bij volwassenen.

Dit protocol legt de procedures uit voor het gebruik van tweefotonmicroscopie om LTMR-axonmorfologie te onderzoeken in de harige en glate huid van zich ontwikkelende en volwassen muizen in hoge resolutie. Het protocol bevat verschillende tips voor optimale beeldvorming met hoge resolutie en chronische beeldvorming. Deze integratieve benadering maakt het mogelijk om de cellulaire mechanismen te onderzoeken die de assemblage en plasticiteit van aanrakingssensorische axonen in vivo aansturen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele dierverzorgingsvoorschriften en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Vanderbilt University. Voor de veiligheid van de onderzoekers werden alle procedures uitgevoerd met labjassen, steriele handschoenen en maskers. Alle gereedschappen werden grondig gesteriliseerd voor gebruik, en alle experimentele oppervlakken werden voor en na elk experiment met 70% ethanol gereinigd. De muizen die in deze studie werden gebruikt, waren adolescenten en volwassen dieren van beide geslachten en waren afgeleid van stammen van Thy1-YFP, TrkBCreER en Ai140. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van instrumenten

  1. Zet de laser aan. Geef de laser voldoende tijd om op te warmen. In dit werk werd de Chameleon Discovery NX-laser gebruikt, die een pulsduur van 100 femtoseconden (fs) en een herhalingssnelheid van 80 ± 0,5 megahertz (MHz) heeft.
  2. Zet de twee-fotonmicroscoop aan en open de besturings- en acquisitiesoftware op de computer.
  3. Zet het verwarmingskussen aan en zet het op 37 °C om onderkoeling tijdens de narcose te voorkomen.

2. Voorbereiding van anesthesie en de voorpoot voor beeldvorming

  1. Om anesthesie op te wekken, plaats je de muis in de inductiekamer en zet je het systeem op 3,5% isoflurane totdat de muis haar rechtstaande reflex verliest en soepele, regelmatige ademhalingen vertoont (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Kamerlucht wordt gebruikt als drager en moet worden ingesteld op 1,0 liter per minuut (L/min).
  2. Plaats de muis op het verwarmingskussen op het beeldvormingsplatform en verlaag de isofluraan tot 1,5% en zuurstof tot 0,5 L/min. Isoflurane moet via de neuskegel worden toegediend. Voor muizen jonger dan postnatale dag 20 is isofluraan ingesteld op 2-4% om de anesthesie te behouden. Controleer de diepte van de anesthesie elke 10 minuten door het verlies van pedaal- en palpebrale reflexen, ademhalingsfrequentie en -diepte, en de algehele spiertonus te beoordelen.
  3. Om bewegingsartefacten tijdens de beeldvorming, inclusief ademhalingsgerelateerde bewegingen, te minimaliseren, moet de muis op een apart podium van de poot worden geplaatst. Voor dit protocol rust het muislichaam op een platform direct naast het beeldplatform waar de poot is gemonteerd, maar niet aanrakend.
  4. Breng oogzalf aan op de ogen om droogte tijdens de beeldvorming te voorkomen.
  5. Breng voorzichtig deharingscrème aan op de poot met een wattenstaafje om het haar te verwijderen. Na een minuut op de huid te hebben laten staan, verwijder je de crème en maak je de muizenpoot schoon met 70% ethanol en water.
  6. Rek de huid voorzichtig om het huidoppervlak te stabiliseren. Met een steriele naald van 30 G en zwarte inkt steek je voorzichtig de huid en tatoeage met twee aangrenzende stippen aan weerszijden van het bedoelde beeldgebied. Zorg ervoor dat de stippen ongeveer 2 millimeter (mm) uit elkaar staan. Na het tatoeëren moet je de naald correct weggooien in een spuitcontainer.
  7. Op een glazen microscoopglaasje plaats je vier stippen vacuümvet op de hoeken en plaats je een klein stukje klei (bijv. DAS Air-Hardening Modeling Clay) van ongeveer 1 mm dik in het midden van de glaas. Plaats de slide onder de objectieflens en centreer de poot van de muis direct op het stuk klei (Figuur 1A,B). Rol voorzichtig de poot van de muis over de glijbaan om hem plat te maken en druk hem in de klei. Leg voorzichtig een dekmantel van 22 mm x 60 mm bovenop de poot om de glijbaan vast te zetten. Pas de hoek van de muishuid aan door lichte druk uit te oefenen op elke hoek van de deklaag totdat het oppervlak van de deklaag en huid parallel aan het beeldvlak liggen. Het gebruik van zachte kracht tijdens beeldvorming helpt mogelijke huidbeschadiging te voorkomen.
  8. Voor het fotograferen van de gladde huid plaats je de glaasje onder de objectieflens en centreer je de poot van de muis op de dia, zoals beschreven in stap 2.7. Gebruik een pincet om de poot te draaien zodat de gladde huid naar boven wijst. Gebruik het platte uiteinde van de pincet om de poot voorzichtig in de klei te drukken. Zodra de poot plat is, leg je de coverslip erop en druk je naar beneden zoals beschreven in stap 2.7.

3. Twee-foton microscoopbeeldvorming van LTMR-morfologie

OPMERKING: De volgende parameters kunnen worden aangepast op basis van het specifieke experiment. Voor dit experiment werd een 20x water-immersie-objectief met een numerieke apertuur van 1 en een werkafstand van 2,00 mm gebruikt. Stappen 3.1-3.6 beschrijven de specifieke parameters die worden gebruikt voor de rechter voorpoot van de Thy1-YFP muizen, die als referentiegids kunnen dienen.

  1. Breng een druppel gedestilleerd water op de dekmantel, direct over de muizenpoot.
  2. Laat de objectieflens zakken totdat er een waterkolom is gevormd.
  3. Zodra de objectieflens boven de muispoot is gecentreerd, sluit je de microscoopdoos en gebruik je het LED-scherm om op het monster te focussen via de X-, Y- en Z-controllers. Het LED-scherm toont een live beeld, verlicht door de ingebouwde LED van de microscoop.
    OPMERKING: LED-modus wordt gebruikt om te bevestigen dat de objectieflens gecentreerd is op het interesseveld voordat wordt overgeschakeld naar twee-fotonmodus. De LED-afbeelding toont oppervlakkenmerken zoals bloedvaten en haarzakjes, en dient als visuele gids voor uitlijning en targeting. De tatoeages op de muispoot verschijnen als zwarte vlekken op het LED-scherm. Met behulp van deze herkenningspunten vind en focus je het gebied tussen de zwarte vlekken. Dit zorgt ervoor dat hetzelfde gebied van de muispoot herhaaldelijk wordt afgebeeld.
  4. Zodra het monster is gevonden, zet je het LED-scherm uit. Om tweefotonenbeeldvorming uit het weefsel uit te voeren, schakel je de microscoop van de spiegelinstelling naar de dichroïsche instelling door een hendel aan de rechterbovenkant van de microscoop te omdraaien.
  5. Sluit de verduisteringsgordijnen en zet de detector aan om YFP te visualiseren.
  6. Open de sluiter met Prairie View en zet de software op beeldvorming. Voor het beelden van Thy1-YFP zet u de instelbare laser aan die is ingesteld op 960 nanometer (nm) met een versterking van 700-800. Bij het afbeelden van GFP stel je de afstembare laser in op 920 nm.
    1. Voor postnatale muizen op dag 10 of jonger, stel je het initiële laservermogen in op 50, verhoog je totdat de gewenste signaalintensiteit is bereikt. Deze lagere initiële laserkracht minimaliseert lichtpenetratie en het risico op fotoschade. Nadat de lasergolflengte, versterking en kracht zijn ingesteld, begin je met scannen.
      OPMERKING: Voor het vastleggen van een hoge-resolutie 1,00x gezichtsveld of een afbeelding van Meissner-corpuskels met gla vingertoppen, wordt aanbevolen een beeldgrootte van 1024 x 1024 te gebruiken met een beeldveld van 601,9 μm x 601,9 μm en een pixelgrootte van 0,588 μm x 0,588 μm. Voor het beelden van lancetvormige uiteinden rond haarzakjes wordt aanbevolen een beeldgrootte van 1024 x 1024 bij 8,00x zoom, een beeldveld van 75,2 μm x 75,2 μm en een pixelgrootte van 0,147 μm x 0,147 μm. Het is belangrijk op te merken dat het beeldveld en de pixelgrootte veranderen met de zoominstelling.
  7. Gebruik de X-, Y- en Z-controllers om het beeldveld te vinden, pas de zoom aan indien nodig en start met het verkrijgen van beelden. Een optimaal beeld wordt doorgaans verkregen op een beginpositie ongeveer 10-20 μm onder het huidoppervlak.
    OPMERKING: Een afbeelding met hoge resolutie van de behaarde huid heeft doorgaans een stapmaat van 1 μm of 2 μm met ongeveer 40-120 plakjes. Een afbeelding met hoge resolutie van de glabroushuid heeft doorgaans een stapmaat van 2 μm tot 4 μm met ongeveer 80-100 sneden. Dit resulteert in een typisch z-bereik van 100-250 μm, en de totale maximale beelddiepte is ongeveer 300 μm.
  8. De beeldvormingssessie wordt beperkt tot 25 minuten om de duur van de blootstelling aan isofluraan te minimaliseren en het risico op anesthesiegerelateerde bijwerkingen voor het dier te verkleinen. De extra isofluraan wordt opgenomen door een anesthesiefilterbus, die in gewone afvalcontainer kan worden weggegooid.

4. Postoperatieve zorg

  1. Haal de muizenpoot van de glazen glijbaan en zet de muis terug in een herstelkooi.
  2. Houd de muizenkooi warm op een verwarmingskussen totdat de muis volledig hersteld is van de narcose.
  3. Plaats de muis terug in zijn thuiskooi en observeer hem nog eens 30 minuten om te zorgen dat de muis integreert met zijn kooigenoten.

5. In vivo chronische beeldvorming van LTMR-morfologie

  1. Plaats de muis onder de twee-foton microscoop door stappen 2.4-3.3 te volgen.
  2. Met behulp van het LED-scherm lokaliseer je de inktvlekken van de vorige beeldsessie. Oriënteer het scherm tussen de stippen om ervoor te zorgen dat het gewenste gebied wordt vastgelegd. Controleer tijdens de scanmodus op de microscoop op herkenningspunten, zoals grote zenuwen of haarfollikelpatronen, om hetzelfde gebied te lokaliseren.
  3. Zodra het beeldgebied is gevonden, volg je stappen 3.4-3.6 om de beeldvorming voort te zetten.
  4. Controleer de kwaliteit en intensiteit van beelden, evenals de morfologie van de belangrijkste axonen, verkregen door twee-foton-excitatie van het huidgebied. Zorg ervoor dat de beeldvelden vergelijkbaar zijn met die tijdens de vorige beeldsessie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit werk werd tweefotonmicroscopie gebruikt om Aβ RA-LTMR en Aδ-LTMR axonale structuren in de huid tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen te visualiseren. Volwassen lancetvormige uiteinden, die voorkomen bij muizen rond de postnatale dag 20 en ouder, zijn volledig ontwikkeld19,32. De algehele organisatie van axonterminalen in de harige huid van volwassen muizen werd afgebeeld, zoals weergegeven in de maximale intensiteitsprojectie (Fig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont het gebruik van tweefotonmicroscopie aan om LTMR-morfologie te onderzoeken in de intacte huid van neonatale en volwassen muizen. Deze longitudinale beeldvormingsmethode overwint de beperkingen van weefselfixatie en maakt realtime observatie van axonale structuren in intact weefsel mogelijk. De Aβ RA-LTMR en Aδ-LTMR axonale morfologieën die zijn gevisualiseerd via twee-foton beeldvorming komen overeen met waarnemingen van eerdere PFA-gefixeerde weefsels...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen relevante openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Hannah Elam, Dr. Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee en Dr. Tegy J. Vadakkan bedanken voor al hun steun en hulp tijdens dit onderzoek. Wij danken Ryan Michael Nuera voor zijn hulp bij het opzetten van het isofluranensysteem. Dit werk wordt ondersteund door de Howard Hughes Medical Institute Hanna Gray Fellowship (Subsidie # GT17518).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20x Objective Lens – Super NA 1.0Olympus1-U2B965Two-Photon Microscope Setup
22x60 Cover SlipVWR16004-330Two-Photon Microscope Setup
Air-Hardening Modeling ClayDASTwo-Photon Microscope Setup
Anesthesia Air Pump (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30Isoflurane System
Anesthesia Concentric MaskRWD Life Science Inc.R510-MIsoflurane System
Anesthesia Induction Chamber – Mouse and RatRWD Life Science Inc.V105Isoflurane System
Bruker Ultima Investigator Plus Laser Scanning MicroscopeBruker Nano, Inc. Two-Photon Microscope Setup
Butterfly NeedlesFisher Scientific1484041Two-Photon Microscope Setup
Chameleon Discovery NX with TPC: DualCoherent1385777Two-Photon Microscope Setup
Cone Mask with Tubing for Neonatal MiceRWD Life Science Inc.68680Isoflurane System
Dual emission filters (et525/70m and et595/50m) and t565lpxr  dichroic beam splitterNikonINVP-01Two-Photon Microscope Setup
Epi-Fluorescence Filter Set ET-GFP ET470/40x and ET252/50m; dichroic T495LPXR Nikon518065Two-Photon Microscope Setup
EthanolDecon Laboratories Inc.Two-Photon Microscope Setup
Far Infrared Warming Pad with Controller (AC power)Kent ScientificRT-0515Two-Photon Microscope Setup
GaAsp Detectors (2) Hamamatsu Photonics HED-UP-2 Two-Photon Microscope Setup
Gas Filter CanistersRWD Life Science Inc.R510-31-6Isoflurane System
High Vacuum GreaseSigma AldrichZ273554Imaging System
Isoflurane, USP (250 mL)Piramal Critical Care6679-017-25Isoflurane System
Laser Cover Box Teco TechnologyImaging System
Mice: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Mice: B6.Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Mice: B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JCharles River3709
Nair Hair Remover CreamAmazon28001Two-Photon Microscope Setup
Raw Data FilesZenodo10.5281/zenodo.17370834
Rigid Stand with Large Rectangular Insert HolderThorlabsMP15MTwo-Photon Microscope Setup
Small Animal Anesthesia Operation PlatformRWD Life Science Inc.R510-PGLIsoflurane System
Soothe Lubricant Eye OintmentBausch + LombTwo-Photon Microscope Setup
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15Two-Photon Microscope Setup

Referenties

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

somatosensorische axonenLTMR axonenin vivo imagingchronische imaginginnervatie van haarfollikelsaxonale ontwikkelingcorpuscula van Meissner
Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.