Method Article

Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een robuuste methode om axonale mRNA's te isoleren met poreuze membraaninserts, waardoor totale neuron- versus neurietscheiding en RNA-zuivering mogelijk zijn. In combinatie met RTddPCR maakt de aanpak absolute kwantificering van low-copy transcripts mogelijk, wat studies naar mRNA-transport en lokale translatie met hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en brede experimentele toepasbaarheid vergemakkelijkt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ruimtelijke dynamiek van mRNA-lokalisatie en -translatie binnen neuronen is essentieel voor verschillende mechanismen van neuronale functie, waaronder neuronale connectiviteit, synaptische plasticiteit en reactie op letsel. Door de extreme polariteit van neuronen zijn veel van deze functies afhankelijk van het vermogen van axonen om specifieke transcripten lokaal te vertalen. Het kwantificeren van deze subcellulaire RNA-populaties blijft echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we een reproduceerbare benadering om afzonderlijke somatische en axonaal verrijkte compartimenten te verkrijgen uit gekweekte knaagdierneuronen en voor het kwantificeren van compartimentspecifieke mRNA-expressie. Primaire embryonale of volwassen neuronen van knaagdieren werden gekweekt op inserts met een poreus membraan van grootte 1-3 μm. Deze membranen zijn alleen toegeeflijk voor axonen, waardoor fysieke scheiding van de somatische en axonale compartimenten mogelijk is. RNA werd vervolgens afzonderlijk geïsoleerd uit de hele neuron en axonverrijkte fracties, die vervolgens werden gebruikt voor reverse transcriptase droplet digital PCR (RTddPCR) met genspecifieke primers. Dit systeem biedt een absolute kwantitatieve vergelijking tussen subcellulaire compartimenten, waardoor gelokaliseerde transcripten met hoge gevoeligheid kunnen worden gedetecteerd. Deze benadering meet de constant-state RNA-abundantie en vergemakkelijkt het onderzoeken van axonale RNA-veranderingen in de loop van de tijd als reactie op neurotrofe factoren, stress of blessuremodellen. De combinatie van fysieke compartimentalisatie en RTddPCR-analyse vermindert kruisbesmetting en geeft exacte kopieaantallen van zeldzame transcripten, wat zorgt voor hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en detectie van mRNA's met een laag kopieaantal die axongroei en -regeneratie reguleren. Deze methode werkt ook met downstream tests, zoals het meten van eiwitsynthese, het bestuderen van RNA-stabiliteit en het uitvoeren van perturbatie-experimenten met siRNA of medicijnen die bepaalde eiwitten blokkeren. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast voor verschillende neuronale subtypes, ontwikkelingsstadia of blessuremodellen. In het algemeen is deze benadering een flexibele, gevoelige en reproduceerbare manier om de moleculaire basis van axonale mRNA-lokalisatie te bestuderen en hoe dit de neuronale functie en ziektemechanismen beïnvloedt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen zijn een van de meest structureel complexe en gepolariseerde cellen in de biologie. Ze hebben lange processen die soms afstanden van meer dan een meter kunnen bereiken. Deze polariteit bemoeilijkt de cellulaire communicatie en eiwithomeostase op verschillende manieren. Een verfijnde benadering om aan deze eisen te voldoen is het transporteren van mRNA's naar afgelegen compartimenten zoals axonen en dendrieten, waardoor hun translatie op een gereguleerde manier wordt vergemakkelijkt als reactie op gelokaliseerde signalen 1,2,3. Lokale translatie stelt axonen in staat eiwitten op ruimtelijke wijze te synthetiseren. Dit proces is cruciaal voor de axonale ontwikkeling, synaptische plasticiteit, regeneratie na letsel en reacties op ontwikkelings- en extracellulaire stimuli 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Het vermogen om de functies van gelokaliseerde mRNA's in axonen te analyseren is cruciaal om hun rol te begrijpen in zowel normale neuronale functie als in de context van pathofysiologie. Dysregulatie van axonale mRNA-translatie is in verband gebracht met diverse neurodegeneratieve ziekten16, zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS)17,18,19, spinale spieratrofie (SMA)20,21 en de ziekte van Alzheimer (AD)22. Axonale regeneratie na schade is sterk afhankelijk van de snelle, precieze translatie van cytoskeletale eiwitten, signaalmoleculen en receptoren 3,23,24,25,26,27,28. Ondanks deze nieuwe concepten blijft de discipline uitdagingen ondervinden bij het effectief kwantificeren en vastleggen van axonspecifieke mRNA-populaties.

Een van de uitdagingen bij axonale transcriptomics is het schoon laten scheiden van soma en axonen. Omdat de meeste mRNA's in het soma verrijkt zijn, kunnen zelfs kleine hoeveelheden besmetting uit het cellichaam de resultaten beïnvloeden bij het beoordelen van het axonale gehalte van een bepaald mRNA. Conventionele technieken, waaronder microfluidische kamers29, 30, 31, 32 of Campenotkamers33, bieden directionele axonale groei en een duidelijke scheiding tussen de twee compartimenten, maar de axonale opbrengst kan te laag zijn voor biochemische studies zoals bulk RNA-sequencing (RNA-seq), RNA co-immunoprecipitatie gevolgd door RNA-sequencing, of kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR). Bulk RNA-seq en qPCR, hoe nuttig ook, missen vaak de vereiste gevoeligheid om laag-kopie transcripties in axonen nauwkeurig te identificeren, wat leidt tot een onjuiste schatting van fysiologisch significante soorten.

Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben wij en anderen doorlatende membraaninserts gebruikt voor de fysieke scheiding van axonen en somata 34,35,36,37,38,39,40,41. Deze inserts laten neuronen zich ontwikkelen op een microporeus oppervlak, en axonen kunnen via deze cellen het onderste compartiment bereiken, maar niet het soma. Deze eenvoudige maar effectieve architectuur maakt het mogelijk om een groot aantal neuronen te cultiveren met een duidelijke fysieke scheiding van soma en axonen. De membraangebaseerde methode is belangrijk omdat deze de technische problemen die met microfludiïdische apparaten gepaard gaan vermijdt en grote hoeveelheden axonaal materiaal levert dat gebruikt kan worden voor moleculaire en biochemische studies. Het inzetsysteem is ook eenvoudig te gebruiken voor zaken als mechanisch letsel, wat het nuttig maakt in veel verschillende experimentele settings met betrekking tot neurale reparatie. De hier beschreven methode optimaliseert de neuronale opbrengst en zuiverheid verder door kweekcondities te verfijnen, membraanporiekenmerken aan te passen en Reverse transcriptase-druppeldruppels digitale PCR (RTddPCR)-gebaseerde validatie te integreren voor laag-opbrengst axonale RNA-monsters.

Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat axonale fracties zuiver zijn. We halen alleen axonen uit de onderste kamer nadat we zorgvuldig eventuele overgebleven somatische materialen van het bovenoppervlak hebben verwijderd. Primervalidatie toont een sterke verrijking van axonale markers en geen of verwaarloosbare somatische markers. Moleculaire bevestiging versterkt dit onderscheid: axonale fracties zijn verrijkt met erkende axonale mRNA's zoals Gap43, en lagere expressie van Actγ42. Dit toont aan dat het insertsysteem axonale monsters maakt met verwaarloosbare soma-inhoud, die goed zijn voor nader onderzoek.

Na het isoleren van verrijkte axonale fracties is de volgende uitdaging het meten van mRNA's die in extreem lage kopieaantallen voorkomen. Het geringe uitgangsmateriaal van axonale fracties en de aanwezigheid van mRNA's met een laag kopiegetal in de axonen drukken de gevoeligheidsgrenzen van conventionele reverse transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR), die standaardcurves gebruikt voor kwantificatie. Bovendien geeft RT-qPCR ook niet de absolute kopienummers van een specifiek transcript. RTddPCR daarentegen scheidt cDNA-monsters in duizenden druppels, wat helpt om een nauwkeurige transcripttelling te verkrijgen met behulp van Poisson-statistieken. Dit maakt het mogelijk om transcripten betrouwbaar te vinden, zelfs als slechts enkele kopieën van de transcripten aanwezig zijn in één nanogram van totaal RNA 5,6,7,43.

In dit manuscript bieden we een gestroomlijnde aanpak, die methoden omvat om verschillende volwassen of embryonale knaagdierneuronen op inserts te kweken, RNA uit hele neuronen versus axonale verrijkte compartimenten te isoleren, te controleren op axonale zuiverheid en RTddPCR-gebaseerde absolute kwantificatie van mRNA-kopieën. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de niveaus van specifieke mRNA's te bepalen, die onder basale omstandigheden op axonen plaatsvinden, en hoe deze veranderen bij axotomie of als reactie op groeifactorstimulatie of neurotoxische signalen. Door deze methode te combineren met eiwitco-immunoprecipitaties kan men ook de dynamiek van ribonucleaire eiwitcomplexen (RNP) in axonen beoordelen. Zo hebben we deze methode uitgebreid gebruikt om de mRNA's te bestuderen, die aanwezig zijn in de axonale Ras GTPase-activerende eiwitbindende eiwit 1 (G3BP1) granulaten. G3BP1 is een kerncomponent van stressgranules44, en onze eerdere studies hebben aangetoond dat het de synthese van axonale eiwitten remt en op zijn beurt zowel PNS- als CNS-axonregeneratieblokkeert. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de rol van axonale translatiedysregulatie bij diverse pathofysiologische aandoeningen te onderzoeken, waaronder ALS, SMA en AD.

Het doel van deze studie is het creëren en testen van een methode om axonale mRNA's te meten die gevoelig, reproduceerbaar en schaalbaar is. Door compartimenteerde, insert-gebaseerde culturen te combineren met RTddPCR-gebaseerde kwantificatie, bieden we het veld een oplossing voor de blijvende problemen van axonale transcriptomics. Deze methodologie zal niet alleen essentiële ontdekkingen over lokale translatie mogelijk maken, maar ook een basis leggen voor translationele onderzoeken gericht op therapeutische interventies in neurale reparatie en neurodegeneratie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het voorbereiden van de inserts voor celzaaiing

  1. Plaats de inserts met de juiste poriegrootte in een plaat met 6 putjes.
    OPMERKING: Gebruik een poriegrootte van 1 μm om axonen van de soma te scheiden en een poriegrootte van 3 μm om alle neurieten (axonen en dendrieten) van de soma te scheiden.
  2. Voeg 100 μg/mL poly-L-lysine (PLL) toe aan de 6-put plaat op een manier die de onderkant van de inserts raakt, en aan de bovenkant van de inserts (2 mL/put en 1 mL/insert).
  3. Broed 's nachts uit bij 37 °C.
  4. Was de putten (onderkant van de inzetstukken) en de bovenkant met steriel ultrazuiver water - 4 wasbeurten × 5 minuten.
  5. Voor alleen dorsale wortelganglion (DRG) neuronen, voeg 5 μg/mL laminine toe (2 mL/put en 1 mL/insert) en incubeer minimaal 1 uur bij 37 °C. Zorg ervoor dat zowel de boven- als de onderkant van de inzetplaat gelijkmatig bedekt zijn.
  6. Spoel met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) met 100 U/mL penicilline/streptomycine - 2 wasbeurten × 5 minuten.
  7. Ga verder met de dissectie en zaad rond 1 × 106 cellen/insert voor embryonale corticale5, hippocampale45 en basale voorhersenen cholinerge neuronen31,32. Voor volwassen ratten-DRG's, plaats 6-8 DRG's/insert 5,7 (Figuur 1).

2. Verzameling van neuronale subcellulaire fracties uit 6-well-inserts

  1. Aliquot 250 μL TRIzol elk in een 1,5 mL microcentrifugebuis per insert en één put/insert van een 6-well plaat. Leg het even opzij.
  2. Voeg in een andere 6-put plaat 2 mL/put steriel PBS toe. Het aantal putten/platen moet evenredig zijn met het aantal inserts.
  3. Aspiraat kweekmedia van de boven- en onderkant van de insert en breng de insert over op een 6-well plaat met PBS.
  4. Met een tang plaats je voorzichtig het inzetstuk en voeg 2 ml PBS bovenop het inzetstuk. Aspireer media van de boven- en onderkant van het inzetstuk en herhaal. In totaal was je het twee keer met PBS en laat het in verse PBS staan (respectievelijk 1 mL en 2 mL bovenaan en onderaan het inlegpunt).
  5. Isolatie van de hele neuronfractie
    1. Met een steriele celschraper schraap je de hele neuronfractie (bovenkant van de insert). Oefen net genoeg druk uit zodat de cellen beginnen los te komen, maar het membraan niet breekt (Figuur 1).
    2. Verzamel de hele neuron uit de insertie en breng deze over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL.
    3. Centrifugeer de buis op 10.000-15.000 g gedurende 2 minuten.
    4. Gooi het supernatant weg en suspendeer het lysaat opnieuw in 250 μL TRIzol.
    5. Label deze buis als de hele neuronfractie.
    6. Ga verder met het verzamelen van neurietfracties.
  6. Isolatie van de neurietfractie
    1. Neem een steriel wattenstaafje en beweeg met één uiteinde heel langzaam in een zigzagpatroon van boven naar beneden aan de hele neuronzijde. Draai het inzetstuk 90 graden en herhaal het proces met het andere uiteinde van het staafje (als je een dubbelzijdig staafje gebruikt, of gebruik een nieuw staafje voor een enkelzijdig). Gooi dit wattenstaafje weg (Figuur 1).
    2. Gebruik een nieuw swab en beweeg in concentrische cirkels, beginnend in het midden van het inzetstuk en naar buiten. Zorg er ook voor dat je de muren (omtrek) schoonmaakt.
    3. Draai het membraaninzetstuk om (neurietzijde naar boven) en snijd het membraan door met een nieuw steriel scalpelblad terwijl je het met een pincet vasthoudt. Zorg dat je ~2-3 mm in de rand laat.
    4. Plaats het gesneden membraan in de 6-wellplaat met TRIzol met de neurietzijde naar beneden. Zorg dat hij ondergedompeld is.
    5. Verzamel de Trizol met het neurietlysaat uit de 6-wellplaat en breng deze over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
  7. Voor zowel hele neuronen als neurietlysaten, ga je verder met RNA-isolatie of bewaar je de lysaten bij -80 °C voor latere verwerking.

3. RNA-isolatie en kwantificatie

  1. RNA-isolatie
    OPMERKING: Werk voor dit deel altijd in een RNase-vrije omgeving met toegewijde, steriele plasticwaren en handschoenen.
    1. Voeg 0,2 ml chloroform toe per 1 ml Trizol, schud krachtig gedurende 15 seconden en incubeer 2-3 minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om te scheiden in lagen: organisch, interfase en waterig (met RNA).
    2. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis, waarbij de interfase wordt vermeden. Om het RNA neer te slaan, voeg je 1 volume isopropanol toe en meng je voorzichtig. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur (of langer bij -20 °C voor een hogere opbrengst) om RNA neer te slaan. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om RNA te pelleten.
    3. Gooi het supernatant weg en was de pellet met 1 mL 75% ethanol. Kort vortexen en centrifugeren op 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. RNA oplosken: Verwijder voorzichtig de ethanolwasmiddel en laat de pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen, zodat je volledig droog wordt. Suspendeer de pellet opnieuw in een klein volume RNase-vrij water of 1x Tris-EDTA (TE) buffer, en incubeer bij 55-60 °C voor volledige oplossing. Bewaar gezuiverd RNA bij -80 °C.
  2. RNA-kwantificatie met behulp van de RiboGreen-assay
    OPMERKING: De RiboGreen-assay (hieronder) gebruikt een fluorescerende kleurstof die specifiek is voor nucleïnezuren, en biedt een hogere gevoeligheid, specificiteit en het vermogen om intact RNA te detecteren dan UV-absorptiemethoden. Overweeg een behandeling met DNase als DNA-besmetting een probleem is.
    1. Bereid 1x TE-buffer voor, verdun de meegeleverde 20x TE-buffer 20 keer met RNase-vrij water. Bereid RiboGreen werkoplossingen voor en bescherm de lichtgevoelige kleurstof met folie. Verdun de geconcentreerde kleurstof met 1:200 in 1x TE voor de high-range assay (10 ng/mL-1 μg/mL), of 1:2000 in 1x TE voor de low-range assay (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Bereid RNA-standaarden voor door seriële verdunning van de RNA-standaard van de kit in 1x TE om het verwachte monsterbereik te dekken. Voer standaarden in drievoud uit.
    2. Bereid monsters voor door RNA-monsters te verdunnen in 1x TE om binnen het dynamisch bereik van de assay te passen. Voer monsters uit in drievoud uit.
    3. Voeg gelijke volumes van RiboGreen werkoplossing en RNA-standaard of monster toe (bijv. 100 μL elk). Incubeer 2-5 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Meet fluorescentie met de juiste instellingen (excitatie ~500 nm, emissie ~525 nm). Meet en trek een reagens-blanco meting af (1x TE + RiboGreen kleurstof).
    4. Analyseren en kwantificeren: Plot een standaardcurve met behulp van de fluorescentiewaarden van de standaarden ten opzichte van hun concentraties. Gebruik deze curve om de RNA-concentratie in de monsters te bepalen (Figuur 2).

4. cDNA-synthese

  1. Ontdooi alle componenten op het ijs. Meng elke tube voorzichtig door te knippen en draai kort naar beneden voordat je het gebruikt. In een PCR-buis op ijs combineert u de volgende componenten voor elke reactie:
    RT mastermix (5x): 4 μL
    RNA-monster: variabel (tot 1 μg totaal RNA)
    Nucleasevrij water: tot 20 μL totaalvolume
    OPMERKING: Voor een no-template control (NTC) vervang het RNA-monster door nucleasevrij water.
  2. Meng voorzichtig en draai de buizen om de inhoud onderaan op te vangen en start het thermocycler-programma.
    Primer gloeien: 25 °C gedurende 2 minuten
    cDNA-synthese: 55 °C gedurende 10 minuten
    Warmte-inactivatie: 95 °C gedurende 1 minuut

5. Primerontwerp en validatie

OPMERKING: Het ontwerp van RTddPCR-primers volgt over het algemeen dezelfde principes als kwantitatieve qPCR, maar vereist extra aandacht om een duidelijke scheiding van positieve en negatieve druppels te waarborgen. Gebruik primerontwerptools van NEB, IDT of ThermoFisher om dit proces te vergemakkelijken. Een succesvolle RTddPCR-assay wordt gedefinieerd door hoge specificiteit en robuuste amplificatie, wat een duidelijke scheiding genereert tussen versterkte (positieve) en niet-versterkte (negatieve) druppels. De volgende NCBI RefSeq toelatings-ID's werden gebruikt voor het ontwerpen van PCR-primers:

Actg: NM_001127449.1
Aanvaller 1: CAGTCTAACAGGGTGGGAAAG
Keerzijde 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Ampliconlengte: 98
Forward 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Achterkant 2: GACTTTCCCACCCTGTTAGAC
Ampliconlengte: 118

Gap43: NM_017195,3
Forward 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Achterkant 1: GACTCCTCAGAACGGAACACAT
Ampliconlengte: 122
Forward 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Achterzijde 2: CATTGCACACACACACACTTGG
Ampliconlengte: 116

  1. Ontwerp een primer met de aanbevolen primerlengte van 18-30 basenparen en een GC-gehalte van 40-60%. Zorg ervoor dat de smelttemperatuur (Tm) tussen de 55-65 °C ligt, en dat de voor- en achteruitprimers binnen 2-5 °C van elkaar liggen. Verwerk een GC-klem, één of twee G- of C-basen binnen de laatste vijf basen aan het 3′-uiteinde, om de bindingsspecificiteit te verbeteren, maar vermijd lange periodes van G's of C's.
  2. Valideer de specificiteit van primers met behulp van uitlijningstools zoals de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) om ervoor te zorgen dat primers alleen binden aan de beoogde doelsequentie. Ontwerp amplicons tussen een grootte van 50-200 basenparen, waarbij ~100 basenparen optimaal zijn, omdat kortere producten efficiënter versterken terwijl ze toch onderscheidbaar blijven van primer-dimeren.
    OPMERKING: In deze studie worden de korte PCR-producten doorgaans met een hogere efficiëntie versterkt dan langere producten in RT-ddPCR.
  3. Minimaliseer primerdimers door primers te ontwerpen met 50-60% GC-inhoud, waarbij secundaire structuren en 3'-complementariteit worden vermeden. Gebruik tijdens primervalidatie agarosegelelektroforese en gebruik altijd een no-template control om primerdimeren te beoordelen.
  4. Vermijd het ontwerpen van primers in delen van de template met een hoge kans op het vormen van secundaire structuren, omdat dit de versterkingsefficiëntie kan verstoren.

6. RTddPCR

OPMERKING: Gebruik het QX200 ddPCR-systeem (Bio-Rad) om RTddPCR uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant en zoals eerder beschreven door Das et al. (2022)43, met enkele kleine aanpassingen om de reproduceerbaarheid van de assay te verbeteren.

  1. Bereid RTddPCR-reacties voor met ddPCR kant-en-klare universele mix en doelspecifieke primers met behulp van geschikt cDNA.
  2. Genereer de druppels met behulp van de druppelgenerator.
  3. Lees de eindfluorescentie met de druppellezer en analyseer de gegevens met de ingebouwde software.
  4. Pas de volgende kwaliteitscontrolemaatregelen toe om nauwkeurige kwantificering en reproduceerbare druppelvorming te waarborgen:
    1. Zet primer consistent in dezelfde rij of kolom om plaateffecten te minimaliseren.
    2. Bereid mastermixen voor om pipetten van kleine volumes te verminderen.
    3. Pipette met een lage debiet om bellen te voorkomen en gebruik multikanaals pipetten voor uniforme monsterdosering.
    4. Hanteer platen voorzichtig na druppelvorming en sluit onmiddellijk af om verdamping te voorkomen.
    5. Bereid alle reacties op ijs voor en vermijd herhaalde vries-dooicycli voor reagentia.
    6. Voeg voor elke primerset geen sjabloon toe, zodat je besmetting monitort.
    7. Sluit putten met minder dan 10.000 geaccepteerde druppels uit de analyse.
    8. Voer technische replicaties uit voor alle monsters om reproduceerbaarheid te waarborgen.
  5. Inspecteer handmatig de druppelfluorescentieamplitudeplots om de nauwkeurigheid van automatische drempeling te verifiëren.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire embryonale knaagdiercorticale neuronen, hippocampusneuronen en BFCN's die zijn geplaatst op PLL-gecoate 1 μm-inserts hechten stevig en verlengen neurieten over het membraan met 5-7 dagen in vitro (DIV). Tegen 11 DIV vertonen culturen dichte netwerken. Voor volwassen ratten-DRG's helpt het toevoegen van een laag laminine aan PLL-gecoate 3 μm-inserts om vergelijkbare axonale extensie met 5 DIV te bereiken. Deze waarnemingen bevestigen het vermogen van inserts om langdurige neuronale groei te ondersteunen en voldoende axonaal materiaal te leveren voor downstream RNA-extractie. In geval van schaal combineren we meerdere inserts om voldoende materiaal te krijgen.

TRIzol-extractie uit individuele inserts levert voldoende RNA op voor reverse transcriptie en daaropvolgende ddPCR. RiboGreen-kwantificatie bevestigt consistente RNA-opbrengsten van hele neuronfracties (212,85 ng/insert) en lagere opbrengsten van neurietfracties (42,75 ng/insert) (Figuur 2). We krijgen over het algemeen ~5-7 keer RNA uit de hele neuronfractie versus de neurietverrijkte fractie.

Alle primers worden gevalideerd vóór RTddPCR-experimenten. Voor elk doeltranscript worden ten minste twee primersets besteld en getest met conventionele PCR op cDNA dat uit dezelfde neuronale monsters is gegenereerd. Het primerpaar dat de sterkste en meest specifieke band produceert, wordt geselecteerd voor RTddPCR (Figuur 3A). We kozen bijvoorbeeld primer set 1 voor Gap43. In gevallen van ambigue resultaten, zoals die verkregen voor Actγ, voeren we een gradient PCR uit om de annealingtemperaturen te optimaliseren (Figuur 3B). Dit zorgt ervoor dat alleen goed gevalideerde primers worden gebruikt voor absolute kwantificering, waardoor de kans op artefacten bij druppelafscheiding afneemt.

De schrap- en uitstrijkprocedure scheidt somatische en neuritische compartimenten betrouwbaar. RNA dat uit de hele neuronfracties is geïsoleerd, vertoont verrijking van transcripten, zoals Actγ 46,47,48,49 (Figuur 4). Daarentegen leveren axon-/neurietfracties aanzienlijk lager totaal RNA op, wat consistent is met hun beperkte volume, maar vertonen ze verrijking van transcripten waarvan bekend is dat ze lokaliseren naar distale processen, zoals Gap43 (Figuur 4). Minimale kruisdetectie van soma-gestricteerde transcripten wijst op een hoge compartmentele zuiverheid wanneer inserts zorgvuldig worden behandeld en met optimale dichtheid worden verplat.

Positieve resultaten worden gekenmerkt door: (1) intacte neuronale morfologie met duidelijke axonale extensie, (2) een schone scheiding van compartimenten zonder scheuring van het membraan, (3) gevalideerde primers die een duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve druppels veroorzaken, en (4) sterke RTddPCR-signalen voor axonale transcripten. Suboptimale experimenten resulteren in een lage RNA-opbrengst, kruisbesmetting aangetoond door soma-markers in neurietfracties, of RTddPCR-artefacten zoals verhoogde druppel-"regen" door primerdimerisatie. Deze problemen worden meestal in verband gebracht met schade aan het inzetmembraan, overmatige schraapdruk of onvoldoende optimalisatie van de temperatuur van de primer-annealing.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van compartimentspecifieke RNA-isolatie met behulp van membraaninserts. Knaagdierneuronen werden gekweekt op semipermeabele inserts met een porie van 1-3 μm, wat neurietextensie mogelijk maakt terwijl het soma wordt beperkt. Voor de voorbereiding van hele neuronen werden cellen uit het bovenste compartiment afgeschraapt met een steriele celschraper, gepelleteerd en vervolgens gelyseerd in TRIzol voor RNA-isolatie, cDNA-synthese en RTddPCR. Resterende cellulaire resten werden verwijderd uit het insertmembraan met een steriel wattenstaafje. Voor neurietvoorbereiding werd het insertmembraan dat nu alleen neurieten bevat, omgekeerd en met een scalpelblad gesneden, en direct ondergedompeld in TRIzol, gevolgd door RNA-isolatie, cDNA-synthese en RTddPCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Standaard RNA-concentratiecurve met behulp van RiboGreen-assay. (A) Fluorescentieintensiteit werd gemeten met de RiboGreen RNA-kwantificatie-assay over een verdunningsreeks RNA-standaarden. Een lineaire regressieanalyse toonde een sterke correlatie aan tussen RNA-concentratie en fluorescentiesignaal (R² = 0,9956). De R²-waarde dicht bij één toont uitstekende lineariteit en betrouwbaarheid van de RiboGreen-assay voor nauwkeurige RNA-kwantificatie. (B) Met behulp van de vergelijking (y=19,738x + 14,905) voor de in A verkregen helling werd het totale RNA voor elke fractie berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Primervalidatie door PCR en agarosegelelektroforese. (A) PCR-amplificatieproducten met cDNA voor Actγ en Gap43 werden opgelost op een 2% agarosegel om de specificiteit van de primer te beoordelen. Voor elk gen werden twee onafhankelijke primersets (set 1 en set 2) getest. DNA-groottemarkers (ladders) worden weergegeven in aangrenzende banen met aangegeven molecuulgewichten (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Verschillende enkele banden van de verwachte grootte bevestigen succesvolle versterking en specificiteit van de geselecteerde primersets. (B) PCR-versterking werd uitgevoerd met Actγ-primer ingesteld 2 over een temperatuurgradiënt (55-65 °C) om de optimale annealingtemperatuur te bepalen. Geamplificeerde producten werden opgelost op een 2% agarosegel naast een DNA-ladder (baan 2, maten aangegeven). Consistente enkele banden van de verwachte grootte werden waargenomen over het geteste bereik, met de sterkste versterking gedetecteerd bij 55 °C, wat suggereert dat dit de optimale temperatuur is voor deze primerset. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: RTddPCR-analyse van geselecteerde transcripten en kwantificering van mRNA-kopieën. (A,B) Representatieve eendimensionale amplitudeplots die druppelafscheiding tonen voor (A) Actγ, en (B) Gap43. Elke stip vertegenwoordigt een enkele druppel, waarbij blauwe druppels positieve versterking aangeven en grijze druppels negatieve versterking. De Y-as geeft de amplitude weer en de X-as geeft de positie van het putje in de ddPCR-plaat aan. Een duidelijke scheiding tussen positieve (blauwe) en negatieve (grijze) druppels bevestigt robuuste detectie van de doeltranscripten met de aangegeven primersets. (C) Tabel die het aantal kopieën/μL en kopieën per ng van het totale RNA voor Actγ- en Gap43-transcripten samenvat in hele neuron- en neurietfracties. Schattingen van het kopieeraantal werden verkregen uit absolute kwantificatie met ddPCR-druppeltellingen (weergegeven in panelen A,B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende stappen zijn cruciaal voor reproduceerbaarheid. De inzetlaag moet uniform zijn om neuronale adhesie te bevorderen; Onvolledige coating leidt tot slechte neuriet-/axonale groei. Celplatingdichtheid is even belangrijk, omdat een hoge dichtheid de dendritische kruising verhoogt, terwijl spaarzame plating onvoldoende axonaal RNA oplevert. De schrap-swabbingsequentie moet met precisie worden uitgevoerd: te weinig druk veroorzaakt somatische besmetting, terwijl te veel druk het risico op beschadiging van het inzetstuk veroorzaakt.

Primervalidatie is een andere cruciale stap. Door twee onafhankelijke primersets per transcript te draaien, kun je het meest betrouwbare paar selecteren, terwijl gradient PCR de annealingtemperaturen verder kan verfijnen. Deze praktijk vermindert de vorming van primer-dimeren, verhoogt de druppelhelderheid en zorgt voor reproduceerbare kwantificering over biologische replicata. Hoewel deze aanpak een hoge compartimentzuiverheid bereikt, kan sporenverontreiniging van somatisch materiaal niet volledig worden uitgesloten. Axonale RNA-opbrengsten zijn van nature laag, waardoor de reikwijdte van analyses die hoge input vereisen, zoals volledige transcriptoomsequencing, beperkt wordt. Een cruciale beperking van deze methode is het onvermogen om transcriptlokalisatie binnen distale versus proximale axonen aan te pakken. Hoewel gliale of endotheliale extensies door membraanporiën onder bepaalde omstandigheden zijn gerapporteerd, minimaliseert ons kweeksysteem deze mogelijkheid. In volwassen DRG-culturen beperkt de toevoeging van cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)5,7 en het gebruik van serumvrije media voor andere neuronale culturen (corticale, hippocampale en BFCN's)5,45 effectief de proliferatie van gliale en endotheliale cellen. Daarnaast zijn de starre polycarbonaat- of polyethyreltephthalaatmembranen (PC/PET) die hier worden gebruikt niet-elastisch en niet tolerant voor actieve celmigratie. Bovendien gebruiken we 3 μm poriegrootte-inserts voor DRG-culturen om de passage van axonen met een grote diameter mogelijk te maken. Daarentegen gebruiken we voor corticale of BFCN-culturen 1 μm poriegrootte-inserts, wat de migratie van glia verder beperkt. Deze eigenschappen onderscheiden onze opstelling van PDMS-gebaseerde microapparaten die endotheelmigratie via flexibele poriën ondersteunen. In overeenstemming met eerdere rapporten 34,35,36,40 bevestigt de moleculaire validatie in deze studie een sterke verrijking van axonale transcripten (bijv. Gap43) en verwaarloosbare detectie van somatische markers (bijv. Actγ), wat de neuronale specificiteit van het materiaal dat het membraan doorkruist ondersteunt. Aangezien de fysieke beperking gliamigratie niet volledig afschafft, zouden onderzoekers Gfap ook als negatieve marker moeten gebruiken.

In vergelijking met microfluidische apparaten is het insertsysteem eenvoudiger, schaalbaarder en compatibel met routinematige kweekworkflows. Het vermijdt gespecialiseerde apparatuur, terwijl het toch reproduceerbare axon-soma scheiding mogelijk maakt. Door inserts te koppelen aan RTddPCR biedt deze methode zowel toegankelijkheid als hoge gevoeligheid, waardoor absolute kwantificering van transcripten mogelijk is die vaak onder qPCR-detectiedrempels liggen. Dit protocol is goed geschikt voor het onderzoeken van veranderingen in de lokalisatie van axonale transcripten, het beoordelen van lokale translatie als reactie op ontwikkelings-, neurotoxische of letselstimuli, en het bestuderen van RNA-transportdefecten die verband houden met neurodegeneratieve ziekten of neuro-ontwikkelingsstoornissen. Toekomstige verfijningen kunnen gemultiplexeerde RTddPCR omvatten voor gelijktijdige kwantificatie van meerdere mRNA's, of integratie met low-input RNA-sequencingbenaderingen om de transcriptoomdekking uit te breiden. Daarnaast kan het aanpassen van dit systeem voor menselijke iPSC-afgeleide neuronen de toepassingen ervan uitbreiden naar ziektemodellering en regeneratieve studies.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PKS bezit Amerikaanse patenten op het gebruik van het G3BP1-celpermeabele peptide voor axonregeneratie en neurodegeneratie. De andere auteurs geven geen belangenconflicten op.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (aan P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture Inserts for 6-well plate, 1.0 μm Pore Size, SterileCorning353102Consumables
Cell culture Inserts for 6-well plate, 3.0 μm Pore Size, SterileCELLTREAT230603Consumables
Cell Lifter with Narrow BladeVWR76036-006Consumables
CELLSTAR 6-well Tissue culture platesVWR82050-842Consumables
ddPCR 96-Well Plates Bio-rad12001925Consumables
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-rad1863004Reagents
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio-rad1864008Consumables
LamininGibco/Fisher Scientific23017-015Reagents
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LReagents
Microplates for Fluorescence-based, 96-well, blackThermo FisherM33089Consumables
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceableBio-rad1814040Consumables
Poly-LysineSigmaP1274Reagents
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio-rad12015382Equipment
QuantaSoft softwareBio-RadPCR data analysis software
Quant-it RiboGreen Reagent and RNA Assay KitThermo FisherR11490Reagents
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-rad1864034Reagents
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreenBio-rad1864005Reagents
QX200 Droplet GeneratorBio-rad17005227Equipment
QX200 Droplet ReaderBio-rad17005228Equipment
TRIzol ReagentInvitrogen15-596-026Reagents

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).">Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).">Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).">Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).">Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).">Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).">Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).">Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).">Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).">Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).">Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).">Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).">Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).">Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).">Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).">Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).">Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).">Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).">Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).">Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).">Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).">Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).">Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).">Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).">Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).">Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).">Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).">Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).">Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).">Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).">Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).">Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).">Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).">Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).">Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).">Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).">Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).">Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).">Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).">Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).">Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).">Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).">Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).">Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).">Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).">Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).">Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).">Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).">Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).">Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles