Transcriptomische analyse gebaseerd op bulk RNA-seq gegevens

Summary

Het huidige protocol stelt een volledige pijplijn vast voor het analyseren van het proces van bulk RNA-seq van ruwe data tot functionele verrijkingsanalyse.

Abstract

Niet-alcoholische vettige lever (NAFL) wordt meestal beschouwd als een goedaardige aandoening; echter, zodra het overgaat naar niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), lopen patiënten een aanzienlijk verhoogd risico op het ontwikkelen van leverziekte in het eindstadium. Veel studies proberen het moleculaire mechanisme achter de overgang van NAFL naar NASH te verduidelijken. High-throughput sequencingtechnologieën (zoals bulk RNA-seq) hebben onderzoekers een dieper inzicht gegeven door het transcriptoom te onderzoeken, wat de expressie van moleculen, activatie van signaalroutes en andere factoren die samenhangen met ziekteprogressie onthult. Er is een schat aan open source data beschikbaar voor onderzoekers om te analyseren om potentiële doelwitten voor ziektebehandeling te identificeren. Gerelateerd onderzoek wordt echter beperkt door het ontbreken van een efficiënt en betrouwbaar proces voor upstream-analyse van het transcriptoom. Hier wordt een zeer reproduceerbare en gebruiksvriendelijke upstream-analyse en daaropvolgende gerelateerde differentiële genanalysepijplijn aangeboden om gestandaardiseerde verwerking en diepgaande parsing van private of publieke data te bereiken. De pijplijn is verdeeld in vier stappen: (1) kwaliteitscontrole van data; (2) genmapping; (3) differentiële genanalyse; en (4) functionaalanalyse. Dit proces heeft als doel de moleculaire mechanismen van ziektetransformatie te onthullen en onderzoekers te helpen potentiële geneesmiddeldoelen en therapeutische benaderingen te screenen via de analyse van Bulk RNA-seq data.

Introduction

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is wereldwijd de meest voorkomende chronische leverziekte en treft meer dan een kwart van de bevolking. De incidentie is de afgelopen decennia dramatisch toegenomen met ^1,2,3. De groeiende ziektelast, vooral de meer gevorderde vorm, niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), vormt een grote wereldwijde gezondheidsuitdaging en een zware economische last⁴. De eerste fase van NAFLD is niet-alcoholische levervetting (NAFL), die gepaard gaat met ontstekingen en fibrose die kunnen ove....

Protocol

Voor demonstratiedoeleinden werd de publiek beschikbare dataset PRJNA1023502 gegenereerd door Lan Bai et al. gebruikt om elke stap van zowel upstream- als downstream-analyses te illustreren²⁰. Omdat deze dataset afkomstig is uit de open-access NCBI SRA-database, zijn geen extra toestemmingen of ethische goedkeuringen vereist. Zie de Materiaaltabel om alle vereiste software- en R-pakketversies te verifiëren. De publiek beschikbare dataset bestaat PRJNA1023502 uit 6 niet-NASH, 6 NAFL- en 6 NASH-lever-RNA-seq monsters. In dit protocol werd de dataset gebruikt om alle stappen van de bulk RNA-seq wo....

Results

De upstream analyseworkflow voor bulk RNA-seq wordt geïllustreerd in Figuur 1A. Deze workflow voert sequentieel de volgende belangrijke stappen uit op een Linux-platform: ten eerste wordt rigoureuze kwaliteitscontrole van ruwe sequencinggegevens uitgevoerd met behulp van fastp om laagwaardige reads en adaptersequenties te verwijderen; vervolgens lijnt HISAT2 hoogwaardige leesopdrachten uit op het referentiegenoom, waarbij Samtools de uitlijningsbestanden con.......

Discussion

Bulk RNA-seq data-analyse wordt gekenmerkt als een interdisciplinaire taak die genomica, bio-informatica, statistiek en informatica integreert. Een volledige analytische workflow omvat meerdere upstream- en downstreamstappen, waaronder preprocessing van ruwe data, kwaliteitscontrole, sequentie-uitlijning, kwantificatie op genniveau, datanormalisatie, differentiële expressie-analyse en biologische interpretatie. Van deze stappen is het nauwkeurig omzetten van ruwe sequencing-reads naar ee.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioconductor	2.64.0	Gene annotation from Ensembl
clusterProfiler	Bioconductor	4.16.0	Functional enrichment analysis
DESeq2	Bioconductor	1.48.1	Differential expression analysis
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	PCA and multivariate analysis
fastp	OpenGene	1.0.1	Quality control and filtering of FASTQ data
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Count the number of reads mapped to each gene for gene expression quantification
ggplot2	Posit	3.5.2	Data visualization
ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Non-overlapping text labels
ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Create ridgeline plots
HISAT2	Johns Hopkins University	2.2.1	Align the filtered high-quality reads to the reference genome
R	R Core Team	4.5.0	An environment for data computation, analysis, and visualization
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Color palettes for plotting
samtools	Large Scale Genomics work stream	1.22.0	Convert and process SAM files for efficient retrieval and access
SRA Toolkit	National Center for Biotechnology Information	3.2.1	Obtain and preprocess raw sequencing data from the NCBI SRA database