Gestandaardiseerde door instabiliteit geïnduceerde diermodellen voor preklinische studies van artrose

Samenvatting

Dit protocol heeft als doel geschikte diermodellen te ontwikkelen voor onderzoek naar artrose.

Samenvatting

Als de meest voorkomende gewrichtsaandoening wereldwijd vormt knieartrose (OA) een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast, wat heeft geleid tot uitgebreid onderzoek naar de pathogenese en behandelstrategieën ervan. Ondanks talrijke studies ontbreken gestandaardiseerde methodologieën voor modelopbouw. Om deze kloof te overbruggen, presenteren we daarom uitgebreide, reproduceerbare protocollen voor het ontwikkelen van door instabiliteit geïnduceerde diermodellen van artrose, specifiek het Destabilization of the Medial Meniscus (DMM)-model bij muizen en het Medial Meniscus Tear (MMT)-model bij ratten. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige en gemakkelijk uitvoerbare procedure voor het beoordelen van postoperatieve pijndrempels en ruimtelijke loopstabiliteit, gericht op het bevorderen van methodologische consistentie in preklinisch OA-onderzoek. Histologische en gedragsvalidatie bevestigde het succes van beide modellen, aangezien de Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-scores duidelijk verhoogd waren, de paslengte significant veranderde en de mechanische pijndrempels aanzienlijk verlaagd waren in de DMM- en MMT-groepen vergeleken met de controlegroepen, wat wijst op uitgesproken gewrichtsdegeneratie en overgevoeligheid. Deze validatieresultaten benadrukken de reproduceerbaarheid en translationele relevantie van de twee modellen. Door gedetailleerde videodocumentatie te bieden, bevordert dit werk procedurele standaardisatie en faciliteert het consistentie tussen laboratoria, waardoor de betrouwbaarheid en vergelijkbaarheid van OA-onderzoeksresultaten worden verbeterd.

Inleiding

Artrose (OA) is een zeer voorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening en een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit wereldwijd ^1,2. Ondanks uitgebreid onderzoek is de ontwikkeling van effectieve ziekte-modificerende OA-geneesmiddelen (DMOAD's)^{relatief traag} verlopen. Het is nu algemeen erkend dat OA een multifactoriële ziekte is die complexe pathologische veranderingen omvat over meerdere peri-articulaire weefsels, waaronder gewrichtskraakbeen, subchondrale boten, pezen en synovium ^4,5. Effectief preklinisch onderzoek naar de diverse pathologische processen van OA vereist het gebruik van goed gedefinieerde en geschikte diermodellen. Hoewel er verschillende OA-diermodellen zijn vastgesteld en gerapporteerd 6,7,8,9,10,11, blijven veel studies ongeschikte diermodellen gebruiken, waardoor de translationele relevantie van hun bevindingen wordt beperkt. Om dit probleem aan te pakken, presenteren we gestandaardiseerde, door instabiliteit veroorzaakte OA-modellen, waaronder reproduceerbare destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) en mediale meniscusscheur (MMT), in videoformaat als praktische referentie voor preklinisch OA-onderzoek en modelstandaardisatie.

Zoals gerapporteerd in eerdere studies, is menisculaire instabiliteit een belangrijke factor die bijdraagt aan kniegewrichtsdegeneratie in klinische gevallen. Daarom dient chirurgisch geïnduceerde meniscule instabiliteit bij muizen en ratten als een effectieve methode voor de experimentele inductie van OA. In deze context presenteren we twee representatieve door instabiliteit geïnduceerde OA-modellen, waaronder het DMM-model bij muizen en het MMT-model bij ratten. Het DMM-model bij muizen is bijzonder waardevol voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van OA, omdat muizen vatbaar zijn voor transgene manipulatie, en dit model vertoont een geleidelijke en langdurige ziekteprogressie, waarbij het de menselijke OA nauw nabootst. Het is echter belangrijk op te merken dat het DMM-model minder geschikt is voor studies die zich richten op pathologische veranderingen in het subchondrale bot, waar alternatieve modellen mogelijk een betere translationele relevantie bieden.

Bovendien hebben we het MMT-model bij ratten opgesteld ter aanvulling op het muis DMM-model. De MMT-procedure veroorzaakt meer uitgebreide structurele schade aan zowel het gewrichtskraakbeen als het subchondrale bot, waardoor de geavanceerde pathologische kenmerken van OA die in klinische omgevingen worden waargenomen, beter weerspiegelen. Dit maakt het ratten-MMT-model bijzonder geschikt voor bio-engineering en translationeel onderzoek, waaronder de evaluatie van biomaterialen, regeneratieve therapieën en geneesmiddelafgiftesystemen gericht op gewrichtsherstel. Hoewel de MMT- en DMM-chirurgische technieken in eerdere studies zijn beschreven, blijft er een gebrek aan een uitgebreid, stapsgewijs visueel protocol dat standaardisatie, reproduceerbaarheid en technische precisie in onderzoekslaboratoria waarborgt. Om deze kloof te overbruggen, hebben we daarom een gedetailleerde video-gebaseerde demonstratie ontwikkeld die elke cruciale stap van modelopbouw illustreert, van de voorbereiding van dieren tot postoperatieve zorg. Daarnaast introduceren we twee veelgebruikte gedragsevaluatiemethoden, één voor het beoordelen van pijndrempel en een andere voor het analyseren van ruimtelijke loopstabiliteit, om een consistent kader te bieden voor functionele beoordeling na OA-inductie. Door chirurgische en gedragsprotocollen te integreren, streeft dit manuscript ernaar methodologische standaardisatie in preklinisch OA-onderzoek te bevorderen, waardoor de gegevensvergelijkbaarheid en translationele relevantie tussen studies worden verbeterd.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Animal Ethical and Welfare Committee van de Zhejiang Chinese Medical University en werden goedgekeurd onder het protocolnummer IACUC-20251020-11. Voor de DMM-operatie werden mannelijke C57BL/6 muizen van 10-12 weken gebruikt, terwijl mannelijke Sprague-Dawley-ratten van 200-225 g werden geselecteerd voor de MMT-procedure. Alle dieren werden gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden en kregen een acclimatisatieperiode van een week voordat de experimenten begonnen. Standaard verzorgingsomstandigheden werden gehandhaafd, waarbij voedsel, water en bodembedekking minstens twee keer per week werden vervangen om dierenwelzijn en experimentele consistentie te waarborgen.

1. Diervoorbereiding

1. Dien passende analgesie toe (bijv. buprenorfine) vóór de operatie volgens de richtlijnen van de instelling. Verdoof het dier met een inhalatieverdoving (bijvoorbeeld 2% isofluraan bij 0,4 L/min met een vers gasstroom van 4 L/min in een inductiekamer) en houd de verdoving gedurende de procedure via een neuskegel. Bevestig de diepte van de anesthesie door te controleren op het ontbreken van een terugtrekkingsreflex van het pedaal.
2. Breng een strook smeermiddel van 2-3 mm smeerend oogzalf aan in de conjunctivale zak van het onderste ooglid en masseer het ooglid voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de zalf over het oogoppervlak te garanderen.
3. Scheer de vacht rond het rechter kniegewricht en desinfecteer de operatieplek met een driestapsreiniging met povidonjodium, gevolgd door 70% ethanol. Plaats het dier op een steriele operatietafel.

2. DMM-operatie bij muizen

OPMERKING: Deze procedure veroorzaakt gewrichtsdestabilisatie door het doorsnijden van het mediale meniscotibialigament (MMTL), rood gemarkeerd in Figuur 1, dat normaal gesproken de mediale meniscus aan het tibiaplateau verankert.

1. Plaats de verdoofde muis in rugligging en maak een kleine mediale parapatellaire huidincisie (ongeveer 3-5 mm) over de rechterknie.
2. Ontleed voorzichtig de daarbovenliggende zachte weefsels om de gewrichtscapsule bloot te leggen. Maak een incisie mediaal van de patellapees en verplaats de patella voorzichtig lateraal om het kniegewricht zichtbaar te maken. Bevestig dat de MMTL verschijnt als een dunne, ligamenteuze band die de voorste hoorn van de mediale meniscus verbindt met het tibiaplateau. Gebruik een stereomicroscoop om de visualisatie te verbeteren en het risico op beschadiging van het gewrichtskraakbeen te minimaliseren.
3. Snijd voorzichtig de tibiale aanhechting van de MMTL door met een microschaar, een #11 scalpelblad of een gebogen spuitnaald. Bij gebruik van een gebogen spuitnaald helpt de stompe rand het onderliggende gewrichtskraakbeen te beschermen. Bevestig succesvolle doorsnijding door de resulterende destabilisatie van de mediale meniscus te observeren.
4. Sluit de ingesneden gewrichtscapsule met 8-0 Oplosbare hechtingen, gevolgd door het sluiten van de huidincisie met wondklemmen of 6-0 hechtingen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat je het gewrichtskraakbeen tijdens het hechten niet doorboort of beschadigt en zorg ervoor dat de gewrichtsstrak gewricht goed wordt gehandhaafd tijdens het sluiten van de incisie.
5. Laat het dier herstellen op een warmtekussen en houd het nauwlettend in de gaten totdat volledige mobiliteit is hersteld.

3. MMT-operatie bij de rat

OPMERKING: Deze procedure induceert OA door een volledige scheur van de mediale meniscus te veroorzaken na doorsnijding van het mediale collaterale ligament (MCL), waardoor gewrichtsinstabiliteit en progressieve kraakbeendegeneratie ontstaan.

1. Plaats de verdoofde rat op de juiste manier en maak een mediale parapatellaire incisie, ongeveer 6-8 mm lang, over de rechterknie.
2. Voer een stomp dissectie uit om de spierlagen te scheiden en de MCL duidelijk bloot te leggen (Figuur 2).
3. Met een chirurgische schaar snijd je het MCL volledig door in het midden.
4. Trek voorzichtig het doorgesneden MCL terug om de onderliggende mediale meniscus bloot te leggen. Met fijne pincetten grijpt u de meniscus vast en voert u een volledige doorsnijding uit op het smalste gebied om een volledige scheur te creëren.
5. Herpositioneer de zachte weefsels en sluit de incisie in lagen, met 5-0 absorberbare hechtingen voor de spier en fascia, gevolgd door wondklemmen of 5-0 niet-absorberbare hechtingen voor het sluiten van de huid.
6. Laat het dier herstellen door dezelfde procedure te volgen die in stap 2.5 wordt beschreven.

4. Gedragsbeoordelingen

1. Voer baseline-beoordelingen uit voorafgaand aan de operatie en herhaal evaluaties op aangewezen postoperatieve tijdstippen (bijv. 2, 4 en 8 weken).
   OPMERKING: Om de variabiliteit tussen de interoperatoren te minimaliseren, werden gedragstests uitgevoerd door dezelfde getrainde operator die blind was voor de experimentele groepering. Elke meting werd drie keer per dier herhaald, en de gemiddelde waarde werd gebruikt voor de analyse.
   1. Vereenvoudigde mechanische terugtrekkingsdrempeltest
      1. Plaats de muizen in individuele compartimenten op een verhoogd draadgaasplatform en laat ze minstens 30 minuten acclimatiseren voordat je het test. De mechanische pijngevoeligheid wordt vervolgens beoordeeld met een elektronische von Frey-anesthesiometer.
      2. Met een Von Frey-filament breng je de sonde aan op het plantaire oppervlak van de rechterachterpoot van de muis en verhoog je geleidelijk de kracht^{met 12}.
      3. Noteer de reactie en merk op dat een positieve reactie wordt aangegeven door plotselinge pootterugtrekking, schrikken of likken. Beoordeel de aanwezigheid of afwezigheid van een consistente respons om veranderingen in gevoeligheid in de loop van de tijd te beoordelen.
   2. Ganganalyse
      1. Gebruik een geautomatiseerd ganganalysesysteem voor de beoordeling.
      2. Laat het dier vrijwillig over de glazen loopbrug van het apparaat lopen. Definieer een geldige proef als een waarbij het dier in een gestaag tempo beweegt zonder te pauzeren. Wacht tot de systeemsoftware automatisch pootafdrukken identificeert en meerdere gangparameters berekent. Analyseer belangrijke statistieken voor het rechter (geopereerde) achterpoot, waaronder de duur van de standfase, zwaaisnelheid en pootdruk, en vergelijk deze met die van de contralaterale ledemaat en de schijnbediende controles.
         OPMERKING: Alle dieren werden gewend aan het testapparaat met dagelijkse trainingssessies voorafgaand aan de basisbeoordeling. Voor elk dier werden per tijdstip drie runs geregistreerd, en alleen proeven waarin het dier een constante snelheid aanhield zonder pauze werden als geldig beschouwd. Alle metingen werden uitgevoerd door getrainde operators onder een dubbelblind ontwerp om de variabiliteit tussen operators te minimaliseren, en herhaalde runs werden gemiddeld om de reproduceerbaarheid van de gegevens te waarborgen.

Resultaten

Karakterisering en validatie van het DMM OA-muismodel
Na een acclimatisatieperiode van 1 week werd het DMM-geïnduceerde artrose (OA)-model bij muizen opgesteld volgens de procedure zoals geïllustreerd in Figuur 1. Twee weken na de operatie werden pathologische en gedragsmatige beoordelingen uitgevoerd. Zoals te zien is in Figuur 2A, waren de meest uitgesproken degeneratieve veranderingen gelokaliseerd in het mediale femorotibiale gewricht. De...

Discussie

Dit protocol biedt een gestandaardiseerd kader voor de inductie en evaluatie van twee veelgebruikte chirurgische OA-modellen. Deze modellen zijn bijzonder waardevol omdat ze de pathofysiologische kenmerken van menselijke posttraumatische OA nauw nabootsen, waardoor ze een sterke translationele relevantie bieden. Het DMM-model omvat doorsnijding van het mediale meniscotibialigament, terwijl het MMT-model een directe scheur van de mediale meniscus inhoudt. In ons laboratorium wordt de DMM-...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gait analysis systeem	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposic			oftalmische zalf
Muizen	Nanjing Institute of Model Animals	c57/bl6
Pijntestsysteem	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	elektronische von Frey anesthesiometre
Ratten	Nanjing Institute of Model Animals	S/D