Karakterisering van huidmondjes en epidermale kenmerken met behulp van peelings, clearing en AI-gebaseerde beeldanalyse

Liisa Kübarsepp; Mait Rungi; Ülo Niinemets; Vivian Kuusk; Riccardo Scodeller; Tiina Tosens

doi:10.3791/69615

Methodenartikel

Karakterisering van huidmondjes en epidermale kenmerken met behulp van peelings, clearing en AI-gebaseerde beeldanalyse

DOI:

10.3791/69615

⸱

27 maart 2026

Liisa Kübarsepp¹ , Mait Rungi² , Ülo Niinemets²^,³ , Vivian Kuusk² , Riccardo Scodeller² , Tiina Tosens²

¹Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, ²Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, ³Estonian Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een vergelijkende methode om huidmondjes- en epidermale kenmerken bij twee verschillende soorten te beoordelen met behulp van epidermale peelings, clearingtechnieken en AI-ondersteunde beeldanalyse. Het doel is om een hoog-doorvoerbare, reproduceerbare kwantificatie van cellulaire structuren die ten grondslag liggen aan de functie van huidmondjes mogelijk te maken voor landbouwtoepassingen en breed plantenonderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige karakterisering van de huidmondjesmorfologie en omliggende epidermale kenmerken is essentieel voor het begrijpen van de functie van huidmondjes. Een vergelijkend protocol wordt gepresenteerd met behulp van twee complementaire technieken – epidermale schillen en bladverwijdering – om de grootte, vorm en dichtheid van huidmondjes en epidermale cellen te beoordelen in twee ecologisch verschillende dicot-soorten, Fraxinus excelsior en Taraxacum officinale. Het protocol bevat gedetailleerde stappen voor monstervoorbereiding, beeldvorming en kwantificering van eigenschappen met behulp van kosten- en arbeidsefficiënte handmatige metingen (weefselverwijdering en -afpelen), en AI-ondersteunde beeldanalyse met het potentieel om toepassingen met hoge doorvoer mogelijk te maken. Drie segmentatietools – een op YOLOv8 gebaseerd huidmonddetectiemodel, een generalistisch deep learning-instrument voor celsegmentatie en een pixelgebaseerde classifier – werden geëvalueerd op hun nauwkeurigheid en geschiktheid over verschillende methoden heen. Significante verschillen in huidmondjes en epidermale eigenschappen worden consequent waargenomen tussen peeling- en clearingtechnieken in zowel handmatige als AI-analyses. AI-tools maakten reproduceerbare kwantificatie mogelijk, waarbij het op YOLOv8 gebaseerde huidmonddetectiemodel (StoManager1) het beste presteerde voor huidmondjeskenmerken en een generalistisch deep learning-instrument voor celsegmentatie (Cellpose) voor epidermale segmentatie. AI-gebaseerde eigenschapsdetectie was zeer consistent bij T. officinale , maar beperkt bij F. excelsior; de resultaten weken nog steeds af van handmatige metingen, wat illustreert hoe soortspecifieke anatomie en beeldkwaliteit de geschiktheid van de methode beïnvloeden. Deze bevindingen suggereren dat hoewel AI-ondersteunde analyse een nuttig kader biedt voor kwantificatie van huidmondjes en epidermale eigenschappen, deskundige validatie en pilottesten essentieel blijven voor bredere of hoog-doorzettingstoepassing.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidmondjes zijn microscopische poriën in de epidermis die een essentiële rol spelen bij het reguleren van de gasuitwisseling en transpiratie van planten. Daarom is het begrijpen van de morfologische basis van de werking van huidmondjes essentieel om de gewasprestaties^{te verbeteren 1}. Hoewel de meeste studies naar huidmondjesstructuur en -functie zich uitsluitend richten op huidmondjesmorfologie, vereist een volledig begrip van de responsiviteit van huidmondjes ook karakterisering van de grootte en vorm van omliggende epidermiscellen. Nauwkeurige kwantificering van deze eigenschappen is fundamenteel voor het begrijpen van de structuur-functierelaties die ten grondslag liggen aan gasuitwisseling en gewasverbetering.

Nu de verbetering van gewassen steeds meer afhankelijk is van geavanceerde genbewerkingsmethoden, is het cruciaal om de belangrijkste morfologische eigenschappen – zoals huidmondjes – te begrijpen die de fotosynthese, de intrinsieke watergebruiksefficiëntie en de koolstofwinst beïnvloeden. Deze behoefte is vooral urgent onder voortdurende milieuveranderingen, aangezien de vraag naar veerkrachtige gewassen die zowel fotosynthetische capaciteit als opbrengst behouden, toeneemt door frequentere droogtes en hittegolven ^2,3. Daarom is er een grote behoefte aan gestandaardiseerde beeldvormings- en analyseprotocollen. Huidmondjes afpellen met lak/nagellak is de eenvoudigste methode om afdrukken van bladoppervlakken te verkrijgen om de grootte, vorm en dichtheid van huidmondjes en epidermal te meten ^4,5,6. De procedure is snel, niet-destructief en maakt een snelle verwerking van monsters mogelijk. De weefselreinigingsmethode is een alternatieve aanpak die gelijktijdige karakterisering van het venennetwerk mogelijk maakt en mogelijk een uitgebreidere karakterisering van bladhydraulica mogelijk maakt.

Chemische clearing maakt weefsels optisch transparant en verzacht, waardoor in situ beeldvorming van huidmondjes en epidermiscellen mogelijk is zonder mechanische verstoring. Clearing is breed toepasbaar op verschillende weefseltypen, waaronder gedroogde of gevoelige monsters, en kan niet alleen worden gebruikt voor huidmondjesbeeldvorming maar ook voor visualisatie van venatienetwerken, fluorescentiebeeldvorming en interne anatomische structuren 7,8,9,10,11,12 , waardoor huidmondjeskenmerken samen met andere functionele kenmerken kunnen worden geanalyseerd. Er bestaan verschillende reinigingsmethoden, waaronder organische oplosmiddelen, waterige oplossingen, hyperhydratatie of hydrogel-inbedding 13,14,15. Deze verschillen in duur, beeldvormingscompatibiliteit en beschikbaarheid van reagentia. Het hier gebruikte protocol is eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde vaardigheden. Beide technieken zijn goedkoop en snel vergeleken met meer arbeidsintensieve methoden zoals lichtmicroscopie of scanning-elektronenmicroscopie, die chemische fixatie, inbedding en sectie van monsters vereisen.

Traditionele methoden voor het analyseren van huidmondjes- en epidermale kenmerken zijn vaak afhankelijk van handmatige segmentatie van microscopiebeelden, wat arbeidsintensief, tijdrovend en onderhevig is aan waarnemersbias, wat de doorvoer beperkt en de efficiëntie van de analysepijplijn¹⁶ vermindert. Bovendien vormen anatomische kenmerken zoals trichomen en onregelmatige celwanden extra uitdagingen voor consistente kwantificatie van eigenschappen. Hoewel geautomatiseerde beeldanalysetools veelbelovend zijn voor het extraheren van hoge doorvoerdata, zijn ze geoptimaliseerd voor specifieke plantweefsels en zijn ze niet gemakkelijk over te dragen tussen bladtypes en bereidingsmethoden. Zo biedt StoManager1 (Aanvullende Figuur 1) hoge nauwkeurigheid bij huidmonddetectie met behulp van een op YOLOv8 gebaseerd objectdetectiemodel, maar is specifiek getraind voor huidmondjeskenmerken. Cellpose (Aanvullende Figuur 2) is een groot, vooraf getraind, generalistisch segmentatiemodel dat goed presteert wanneer de invoergegevens lijken op de vooraf getrainde modellen (bijv. cyto, cyto2), oorspronkelijk gebaseerd op dierlijke cellen en organellen. Ilastik (Aanvullende Figuur 3) is een op pixels gebaseerde classificatietool die gebruikmaakt van door de gebruiker gedefinieerde annotaties. Zowel Cellpose als Ilastik zijn gebruiksvriendelijk, maar elk kan hertraining of fijnafstelling vereisen om variaties in beeldkwaliteit, achtergrondartefacten en weefselspecifieke kenmerken te accommoderen.

Bovendien vertonen de morfologie van huidmondjes en epidermale een hoge variabiliteit tussen soorten¹⁷. Eigenschappen zoals de dichtheid en grootte van de huidmondjes zijn bijzonder variabel, maar zijn doorgaans omgekeerd verwant en bepalen samen soortverschillen in huidmondjeskinetiek. Grotere huidmondjes kunnen deels compenseren voor een lagere dichtheid, maar vertonen over het algemeen een tragere kinetiek⁵, wat nadelig kan zijn bij steeds frequentere hittegolven, waarbij snelle huidmondjes van cruciaal belang zijn voor het behouden van koolstofassimilatie en het voorkomen van overmatig waterverlies. Al met al bemoeilijkt deze variabiliteit de meting van huidmondjeskenmerken en kan het de geldigheid van het geselecteerde protocol en de robuustheid van AI-gebaseerde resultaten aantasten.

Dit protocol integreert twee klassieke voorbereidingstechnieken – epidermale peelings en chemische clearings – met moderne kunstmatige intelligentie (AI) en machine learning (ML) tools voor eigenschapssegmentatie en -meting. Met behulp van twee veelvoorkomende lichteisende tweelingsoorten met contrasterende ecologische strategieën (F. excelsior en T. officinale), onderzochten we variabiliteit in huidmond- en epidermale kenmerken om te beoordelen hoe drie methoden zich verhouden en waar mogelijke onnauwkeurigheden kunnen optreden. De prestaties van drie AI-tools: StoManager1 (een YOLOv8-gebaseerd deep learning-model voor huidmonddetectie), Cellpose (een generalistisch deep learning-segmentatietool) en ilastik (een pixel-gebaseerde classifier voor epidermale weefsels) werden beoordeeld. Deze integratieve benadering maakt reproduceerbare, hoogdoorvoerkwantificering van huidmond- en epidermale kenmerken mogelijk, en biedt een robuust en schaalbaar kader voor fenotypische analyse in zowel ecologisch als landbouwonderzoek. Anatomische kenmerken zoals dichte trichomen, dikke nagelriemen of laag contrast tussen de celgrens kunnen echter de segmentatienauwkeurigheid verminderen en moeten worden meegenomen bij het kiezen tussen peeling- en clearing-methoden en bij het toepassen van AI-gebaseerde kwantificatie.

Voor zover wij weten is dit het eerste stapsgewijze protocol dat direct epidermale peeling en chemische clearing-methoden vergelijkt in combinatie met meerdere AI-gebaseerde segmentatietools voor zowel de kwantificatie van huidmondjes als epidermale kenmerken. Door klassieke microscopietechnieken te combineren met toegankelijke ML-workflows vermindert het protocol gebruikersbias, verhoogt het de doorvoer en faciliteert het reproduceerbare fenotypering tussen soorten. Dit maakt de aanpak breed toepasbaar voor ecologie, gewasverbetering en klimaatverandering, en biedt een basis voor voortdurende uitbreiding van tools via modelhertraining of transfer learning.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Voor het verzamelen van bladeren van T. officinale en F. excelsior waren geen specifieke vergunningen of goedkeuringen vereist, aangezien deze niet-beschermde soorten werden bemonsterd uit openbaar toegankelijke tuinen. Alle monsters werden verzameld volgens institutionele en lokale richtlijnen.

1. Verzameling van plantmateriaal

Selecteer gezonde bladeren voor vergelijkende analyse. Voor het huidige experiment werden gezonde, door de zon blootgestelde volwassen bladeren van twee tweedelige soorten met een contrasterende huidmondverdeling geselecteerd: de hypo-stomateuze boom F. excelsior, die alleen huidmondjes op het onderste bladoppervlak heeft, en de amphistomatische meerjarige plant T. officinale.
Neem voor elk monstertype/locatie 3-5 replicatiebladeren.
Maak het blad los met een schone schaar of een scheermesje. Doe het gesneden blad direct in water om uitdroging te voorkomen.
Na het verzamelen dompel je de bladsteel volledig onder in water en bewaar je ze op 4°C.
Ga binnen 48 uur door met protocolsecties 2 of 3.

2. Bereiding en bezichtiging van huidmondafdrukken schillen

OPMERKING: Al het chemisch afval dat tijdens het opruimingsprotocol is ontstaan, is afgehandeld volgens institutionele en lokale veiligheidsvoorschriften. Glutaraldehydehoudende oplossingen werden afzonderlijk verzameld en als gevaarlijk chemisch afval afgevoerd. Natriumhydroxide (NaOH) oplossingen werden vóór verwijdering geneutraliseerd tot pH 6-8, waar toegestaan. Verdunde bleekmiddel en ethanoloplossingen werden in de gootsteen gegooid met grote hoeveelheden koud water op plaatsen waar het door institutionele en gemeentelijke regelgeving was toegestaan. TBO-oplossingen werden verzameld en als chemisch afval verwijderd volgens lokale richtlijnen. Gebruikers dienen hun institutionele veiligheidsbureau te raadplegen voor goedgekeurde verwijderingsprocedures.

Spoel indien nodig het geselecteerde bladoppervlak voorzichtig af met water om stof of vuil te verwijderen. Dep het bladoppervlak direct droog met filterpapier of een zacht papieren handdoekje om overtollig vocht te verwijderen. Laat het niet aan de lucht drogen, omdat dit kan leiden tot krimp van het weefsel, wat leidt tot onnauwkeurige afmetingen van huidmondjes en epidermiscellen.
Label de microscoopglaas met monsterdetails (bijv. soort, bladzijde en voorbereidingsdatum) met een permanente marker om traceerbaarheid van elk monster te waarborgen tijdens beeldvorming, analyse en data-interpretatie, en om een juiste opslag van het monster voor toekomstig gebruik mogelijk te maken.
Voor soorten met niet-kliervormige (harige) trichomen verwijder je de trichomen van het bladoppervlak met een scheermesje vóór de peelingvoorbereiding, omdat hun aanwezigheid cellgrenzen kan verhullen en de beeldkwaliteit kan verminderen (Figuur 1).
Breng met een klein penseel een dunne, gelijkmatige laag transparante, niet-uitschuifbare nagellak aan (vermijd "stretch" of "peel-off" formules) op het doelgebied. Kies altijd het centrale deel van het blad voor de schilvoorbereiding, waarbij je de punt en basis vermijdt.
Laat de nagellak volledig drogen (meestal 2-5 minuten op kamertemperatuur). Langdurige blootstelling kan verkleuring van het weefsel veroorzaken (bijvoorbeeld rode tint op zachtere bladeren), wat zichtbaar kan zijn in de uiteindelijke peeling en de latere analyses die uniforme kleuring vereisen in de weg kunnen staan.
Zodra het droog is, breng je een strook transparant tape aan op het gecoate gebied. Begin bij één rand van de nagellak en leg het tape geleidelijk over het oppervlak, waarbij je zachtjes drukt om een goede hechting te garanderen en luchtbellen of vouwen te voorkomen. Draag nitril handschoenen om vingerafdrukken te vermijden.
Haal voorzichtig de tape samen met de nagellakfilm (epidermale afdruk) weg.
Leg de tape (met de plakkant naar beneden) op een schoon microscoopglaasje, waarbij je vouwen of overlappingen vermijdt.
Bewaar voorbereide preparaten op kamertemperatuur, beschermd tegen stof en direct zonlicht.
Bekijk de preparaat onder een compound light microscoop met 400x vergroting. Sla afbeeldingen op volgens de softwaregids, samen met de relevante schaal.

3. Voorbereiden en bekijken van gezuiverde secties

Snijd bladstukken van ongeveer 1 cm². Voer alle stappen uit met nitrilhandschoenen en werk onder een afzuigkap.
Breng de monsters over in een gelabeld flesje, bedek ze met fixatieoplossing (4% glutarische aldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH = 6,9) (VOORZICHTIG), en bewaar bij 4°C gedurende 24 uur (Tabel 1, voor de bereiding van een fixatieoplossing).
Verwijder de fixatieoplossing met een pipet en bedek de monsters met gedestilleerd water. Laat het 30 minuten gaan. Herhaal drie keer (Figuur 2A-C).
Verwijder het water en bedek de monsters met 1 M NaOH-oplossing (los 20 g NaOH op in 0,5 L gedestilleerd water).
Tijdens het verwijderen van bladeren wordt de NaOH-oplossing groen. Vervang de NaOH-oplossing één keer per dag door een verse oplossing. Ga 3 tot 4 dagen door, of totdat de monsters bleekgeel worden en de NaOH-oplossing helder blijft (Figuur 2D-F).
Verwijder de NaOH-oplossing en bedek de monsters met bleekmiddel (5% NaClO). Commerciële huishoudelijke bleekmiddel met deze concentratie is geschikt.
Incubeer de monsters 1-2 minuten in bleekmiddel. De monsters worden wit en doorschijnend (Figuur 2G-I).
Verwijder de vorige oplossing en bedek de monsters 2 minuten met gedestilleerd water. Dehydrateer de monsters via een gegradueerde gedestilleerde water-ethanolreeks als volgt: 75:25, 50:50, 25:75 en 100% ethanol.
Verwijder de ethanol en bedek de monsters met een 3% alcoholische oplossing van toluidine blue O (TBO, los 3 g TBO op in 100 mL 100% ethanol). Vertrek 's nachts.
Verwijder de kleuroplossing en bedek de monsters 2 minuten met 100% ethanol. Herhaal deze stap met een gegradueerde serie gedestilleerd water-ethanol als volgt: 25:75, 50:50, 75:25, en tenslotte gedestilleerd water (Figuur 2J-L). Zie Figuur 3 voor veelvoorkomende fouten en stappen voor probleemoplossing die samenhangen met het clearingproces.
Houd de monsters in gedestilleerd water op 4°C tot ze het bekijken.
Breng de monsters over op een glazen glaasje, voeg een druppel gedestilleerd water toe en dek af met een glazen deklaag voor microscopisch bekijken en beelden.
Bekijk de preparaat onder een compound light microscoop met 400x vergroting. Sla afbeeldingen op volgens de softwaregids, samen met de relevante schaal. Zie de Tabel met materialen voor meer informatie.

4. Beeldanalyse en metingen

Gebruik Fiji²³ (ImageJ-distributie, versie 1.54p) voor beeldverwerking en analyse.
Met het lijngereedschap tekent u een lijn over de schaalbalk, selecteert u vervolgens Analyzen > Set Scale, past u de bekende afstand aan op de lengte van de schaalbalk en wijzigt u de lengte-eenheid naar μm.
Ga naar het analyseren van > set metingen. Zorg ervoor dat de opties voor de oppervlakte en de diameter van Feret zijn gecontroleerd.
Gebruik de Polygon Selection Tool om het object van interesse te omlijnen. Noteer de meting door op de M-toets te drukken.
Meet de volgende huidmondjes- en epidermale kenmerken in Fiji en bereken zowel vrijgemaakte monsters als huidmondjesschillen (Figuur 3).
Bereken het aantal huidmondjes (Ns).
1. Bepaal het gemiddelde huidmondjesoppervlak (As).
2. Bepaal de gemiddelde huidmondjesbreedte (Ws): met behulp van Feret's minimale diameter.
3. Bereken de huidmondjesdichtheid (SD) volgens de volgende formule:
  
  ; per eenheid Ia (het voor metingen geselecteerde bladoppervlak, mm²).
4. Bepaal de gemiddelde oppervlakte van de epidermale cel (Ae).
5. Bepaal de epidermale celdichtheid (ECD) met de volgende formule:

5. Statistieken

Gebruik de HSD post-hoc test van ANOVA en Tukey om verschillen tussen steekproefgroepen te testen.
Voer alle statistische analyses uit in R²¹.
Analyseer in totaal 3 replicatiebladeren per soort en bekijk 3 schillen van elk blad.

6. AI-ondersteunde analyse

Selecteer machine learning-tools voor segmentatie.
1. Selecteer geschikte segmentatietools gebaseerd op machine learning op basis van de doelstructuur (huidmondjes of epidermale cellen), beeldkwaliteit en analysedoelen.
2. Gebruik een huidmondje-specifiek deep learning-model voor geautomatiseerde detectie en meting van huidmondjeskenmerken en gebruik generalistische deep learning- of pixelgebaseerde segmentatietools voor epidermale celsegmentatie.
3. Raadpleeg de sectie Machine Learning Tools en Software voor specifieke software-implementaties (Supplementaire bestand).
4. Voer pilottests uit op een subset beelden voorafgaand aan grootschalige analyse om de segmentatieprestaties te evalueren en mogelijke bronnen van vals-positieven te identificeren.
Bereid de computeromgeving voor.
1. Gebruik een werkstation met een processor van 8-12 kernen, minimaal 32 GB RAM en een NVIDIA CUDA-compatibele GPU met minimaal 24 GB VRAM.
2. Gebruik een hoge-resolutie display (bij voorkeur 4K) om annotatie en visuele inspectie te vergemakkelijken.
3. Installeer alle geselecteerde softwaretools volgens de instructies van de ontwikkelaars en registreer softwareversies om reproduceerbaarheid te garanderen.
Bereid afbeeldingen voor voor machine learning-analyse.
1. Importeer microscopiebeelden in TIFF- of PNG-formaat, waarbij je indien mogelijk 8- of 16-bits grijswaardenbeelden gebruikt.
2. Zorg ervoor dat elke afbeelding een zichtbare schaalbalk bevat of ruimtelijk is gekalibreerd vóór de analyse.
3. Selecteer interessegebieden met minimale vuil, plooien of luchtbellen, zelfs verlichting en duidelijk afgebakende celgrenzen.
4. Sluit beelden met wazige randen, sterke schaduwen of laag contrast uit, omdat deze de segmentatienauwkeurigheid verminderen.
Voer huidmondsegmentatie uit.
1. Laad afbeeldingen in het huidmondje-specifieke deep learning-model (Aanvullende bestandsectie 1).
2. Stel detectieparameters in, inclusief objectgroottelimieten en betrouwbaarheidsdrempels, volgens soort en beeldresolutie.
3. Voer geautomatiseerde detectie uit om huidmondjescomplexen te segmenteren en outputmetrieken te extraheren zoals huidmondjesaantal, oppervlakte en Feret-diameters.
4. Exporteer segmentatiemaskers en meettabellen voor downstream analyse. Inspecteer segmentatie-overlays visueel en sluit indien nodig foutief gedetecteerde objecten handmatig uit.
Voer epidermale celsegmentatie uit.
1. Laad afbeeldingen in een generalistische deep learning-segmentatietool of een pixel-gebaseerde classifier (aanvullende bestandsectie 2 - 4).
2. Train of verfijn het model met behulp van representatieve beelden met handmatig geannoteerde voorbeelden van epidermale cellen, celgrenzen en achtergrond.
3. Voer segmentatie uit om objectmaskers te genereren en exporteer de maskers voor nabewerking in ImageJ/Fiji of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
4. Pas grootte- of kwantielgebaseerde filtering toe om kleine vals-positieve objecten te verwijderen en de segmentatienauwkeurigheid te verifiëren door visuele inspectie voordat epidermale celmetrieken zoals celoppervlakte en celdichtheid worden geëxtraheerd.
Documenteer parameters en voer kwaliteitscontrole uit.
1. Noteer alle softwareversies, parameterinstellingen, filterdrempels en hardwarespecificaties die tijdens de analyse worden gebruikt.
2. Bebehoud representatieve segmentatie-overlays om de segmentatiekwaliteit te documenteren.
3. Valideer geautomatiseerde segmentatie-uitvoeren visueel voorafgaand aan statistische analyse of datarapportage.
Beeldvoorbereiding voor alle ML-verwerking
1. Monsterbeeldvorming
  OPMERKING: Omdat ML-gebaseerde segmentatie afhankelijk is van intensiteitsgradiënten, randcontinuïteit en consistente objectgeometrie in plaats van biologische context, bepalen beeldvoorbewerking en regiokeuze de modelprestaties en foutstructuur kritisch.
  1. Maak hoge-resolutie beelden van schoongemaakte of gepeelte bladoppervlakken met een zichtbare schaalbalk. Voor goede machine learning-workflows moet je ervoor zorgen dat de meetbare objecten scherp, continu en hoog contrast zijn door het hele beeld.
2. Regiokeuze en beeldkwaliteit
  OPMERKING: Na beeldverwerving in Sectie 6.7.1 worden beelden visueel geïnspecteerd en, waar de beeldschaal het toelaat, worden artefactvrije interessegebieden handmatig geselecteerd voor downstream segmentatie. Selecteer interessegebieden met minimale artefacten (bijv. puin, plooien, luchtbellen, ongelijkmatige verlichting). Voor huidmondjesmodellen (bijv. StoManager1) geef prioriteit aan duidelijke poriezichtbaarheid en een goed gedefinieerde guard-cell silhouet. Voor epidermale modellen (bijv. Cellpose, ilastik) zorg voor stabiele intensiteitsgradiënten langs celcontouren; Discontinue of laag-contrast randen verminderen de segmentatieprestaties aanzienlijk. Afbeeldingen met slecht gedefinieerde grenzen moeten worden uitgesloten of opnieuw verwerkt voordat ze segmenteren.
3. Bestandsformaat
  Bestanden opslaan in TIFF- of PNG-formaat (8- of 16-bit grijswaarden aanbevolen voor segmentatie).
4. Optionele beeldverbetering
  1. Verbeter het contrast of trek de achtergrond weg in ImageJ/Fiji als de grenzen zwak zijn.
  2. Focus op randgeometrie, want deze kunnen valse gradiënten creëren die als celgrenzen worden geïnterpreteerd.
  3. Pas dergelijke aanpassingen consequent toe op alle afbeeldingen binnen een dataset.
    OPMERKING: Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan randgeometrie, omdat schaduwen, halo's of ongelijke achtergrondgradiënten kunstmatige intensiteitsovergangen kunnen veroorzaken die ML-modellen mogelijk verkeerd interpreteren als celgrenzen.
StoManager1 (v1.0.0 GUI-versie)
OPMERKING: StoManager1 maakt geautomatiseerde, hoogdoorvoerde detectie, meting en analyse van bladhuidmondjes van planten mogelijk met behulp van convolutionele neurale netwerken (YOLOv8-seg-x). De tool kwantificeert belangrijke huidmondjesmetrieken (oppervlakte, dichtheid, porie/guard-celverhouding, aggregatie-indices, enz.) uit verschillende beeldtypes, vermindert handmatige inspanning en bias, en faciliteert grootschalige ecologische en fysiologische studies. Er is een gebruiksvriendelijke Windows-app beschikbaar, waarvoor geen programmeervaardigheden nodig zijn behalve optionele nabewerking (Aanvullende bestandsectie 1)²³.
1. StoManager1 draaien: installeren en configureren
  1. Toegang via GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) of de zelfstandige Windows-applicatie ((Aanvullende bestand sectie 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
  2. Zorg voor compatibele bibliotheekversies (Python-afhankelijkheden); conflicten kunnen optreden als andere ML/imagesoftware wordt geïnstalleerd.
2. Start StoManager1 via de GUI of de commandoregelinterface.
3. Kies je invoermap met bladafbeeldingen.
4. Modelkeuze; Bekijk het YOLOv8-seg-x model voor segmentatiegebaseerde, meer gedetailleerde metrics. Houd het niet aangevinkt voor het bounding box-model (YOLOv3), minder metrics.
5. Parameterafstemming; Pas detectiedrempels, beeldresolutie, maskerdilatatie en objectgroottelimieten aan zoals nodig voor je beeldvormingsmodaliteit/soort. Gebruik alstublieft standaardparameters, wanneer sommige huidmondjes onontdekt blijven, voornamelijk (1) verlaag de detectiebetrouwbaarheidsdrempel om meer echte huidmondjes terug te vinden terwijl wordt gecontroleerd op vals-positieve detectie; en (2) het verhogen van de beeldresolutie, omdat een grotere waarde de detectie van kleine huidmondjes kan verbeteren ten koste van een hogere rekenvraag.
6. Run-segmentatie:
  1. Klik op " Start Process" om huidmondjes en hele huidmondjes te detecteren, segmenteren en meten.
  2. Klik op " Statistische Analyse" om statistieken op groepsniveau te verwerken.
7. Verzamel resultaten. Output wordt opgeslagen in YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (segmentatiemodus) of direct in YOUR_OUTPUT_PATH (bounding box-modus). CSV-bestanden bevatten per-object- en samenvattingsmetrics; Maskers en resultaatafbeeldingen worden ook gegenereerd.
8. Start batchverwerking.
9. Na voltooiing verzamel je de output: segmentatiemaskers en per-afbeelding CSV-resultaatbestanden. Resultaten per afbeelding omvatten: aantal huidmondjes en huidmondjesgebied, Feret's diameter (max/min), guardcelmetrieken, aggregatie/gelijkheid/divergentie-indices en porie/guard-celverhoudingen.
10. Bekijk de output met Excel, R of Python voor verdere statistieken en visualisatie.
11. Kwaliteitscontrole; Bekijk maskers en overlays visueel. Verwijder uitschieters op basis van grootte, vorm of handmatige curatie indien nodig (zie hieronder).
  OPMERKING: Gedetailleerde protocollen en nabewerkingsstappen voor Cellpose en ilastik zijn opgenomen in het aanvullende bestand. Voor optimale prestaties met grote datasets en complexe afbeeldingen raden we een systeem aan met een processor van 8-12 kernen, minimaal 32 GB RAM en een NVIDIA CUDA-compatibele GPU met minimaal 24 GB VRAM. Een groot, hoogresolutiescherm (bij voorkeur 4K) wordt ook sterk aanbevolen voor efficiënte annotatie en visualisatie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergelijking van resultaten tussen peeling en clearing

Zowel T. officinale als F. excelsior vertoonden variabiliteit in huidmondjes en epidermale kenmerken, afhankelijk van of monsters waren verwijderd of gepeld (Figuur 4). Vrijgemaakte monsters gaven doorgaans scherpere celgrenzen en een duidelijkere visualisatie van de vorm en porieopening van de guardcellen, hoewel overlappende weefsellagen soms kleinere huidmondjes en biased size schattingen naar boven verduisterden. Bij F. excelsior waren de gemiddelde huidmondjesoppervlak en huidmondjesbreedte significant hoger in vrijgemaakte monsters dan in schillen, terwijl bij T. officinale geen significante verschillen werden waargenomen. De huidmonddichtheid was significant hoger in gepelde monsters van F. excelsior, terwijl er geen methode-effect werd vastgesteld bij T. officinale. Het epidermale celoppervlak verschilde niet tussen methoden in beide soorten, maar de epidermale celdichtheid was iets hoger in gepeelde monsters van F. excelsior.

Over het algemeen waren de methode-afhankelijke verschillen kenmerken- en soortspecifiek, wat suggereert dat schillen een betrouwbare optie biedt voor huidmondjesmetingen, vooral wanneer huidmondjes in grootte variëren (bijvoorbeeld in zich ontwikkelende bladeren), terwijl epidermale eigenschappen grotendeels onaangetast bleven (Figuur 5).

AI-resultaten en hoe ze resoneren met peeling- en clearing-methoden

Het huidmondjes-specifieke model StoManager1 detecteerde huidmondjes betrouwbaarder op gepeelte beelden (Figuur 6), terwijl de prestaties op gezuiverde monsters aanzienlijk daalden (Figuur 7). Om de prestaties van StoManager1 verder te evalueren over alle bereidingsmethoden heen, hebben we de detectie van huidmondjeskenmerken in T. officinale en F. excelsior vergeleken met behulp van zowel schillen als geclearde beelden (Figuur 8). Bij T. officinale detecteerde het model betrouwbaar de aanwezigheid en dichtheid van huidmondjes over de bereidingsmethoden. De resulterende waarden verschilden echter aanzienlijk van handmatige metingen (Tabel 2 en Figuren 5 en 8). De meeste huidmondjeskenmerken verschilden aanzienlijk (p < 0,05) tussen gepelde en gezuiverde monsters (Figuur 8), wat aangeeft dat AI-detectiepijplijnen zeer gevoelig zijn voor bereidingsmethoden en zorgvuldige validatie vereisen voordat grootschalige toepassing wordt toegepast. Daarentegen was de detectie bij F. excelsior beperkt tot het abaxiale oppervlak vanwege het ontbreken van adaxiale huidmondjes, en bij geclearde monsters was de detectie inconsistent, met frequente vals-positieven (Figuur 8). Deze resultaten benadrukken de sterke invloed van soortspecifieke anatomische kenmerken en beeldkwaliteit op de effectiviteit van AI-gebaseerde analyses. Generalistische ML-tools zoals Cellpose (Figuur 9A) en Ilastik (Figuur 9B) segmenteerden epidermale cellen effectiever op gepeelte dan op gezuiverde beelden. Beide tools leverden echter talrijke vals-positieven op bij beide voorbereidingstechnieken (peeling en clearing), vooral onder weinig contrast of wanneer celcontouren wazig waren. In zulke gevallen werden onduidelijke huidmondjes of epidermale contouren vaak overgesegmenteerd in meerdere kleine objecten die ten onrechte als individuele epidermale cellen werden geclassificeerd (zie Figuur 10). Daarom is nabewerking noodzakelijk, niet alleen het verwijderen van uitschieters maar ook filtering op hogere kwantielen, om betrouwbaar geïdentificeerde cellen te behouden.

figure-results-1
Figuur 1: Huidmondjesschillen van F. carica-bladeren voor en na het verwijderen van trichomen met een scheermesje. Grote trichomen kunnen afdrukken achterlaten op de peel, waardoor luchtbellen ontstaan die leiden tot ongelijke oppervlakken en consistente scherpstelling belemmeren (zichtbaar als grote grijze stippen). F. carica werd als uitzondering opgenomen om het protocol uit te breiden naar harige bladeren. (A) Bij 200x vergroting wordt beeld vóór trichomeverwijdering gedeeltelijk belemmerd door de trichome-afdrukken. (B) De beeldkwaliteit verbetert na het verwijderen van trichomes. (C) Bij een 400x vergroting wordt beeld vóór trichomeverwijdering grotendeels belemmerd door trichomeafdrukken. (D) Obstructie is minimaal in beeld na het verwijderen van trichomen met een scheermesje. Schaalbalken 100 μm (A, B) en 50 μm (C, D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Opeenvolgende stappen van het clearingprotocol. Representatieve afbeeldingen van T. officinale, F. excelsior en F. carica illustreren opeenvolgende fasen van het clearingprotocol. (A-C) Verse bladeren. (D-F) vertrekt na afklaring met NaOH. (G-I) vertrekt na het bleken met NaClO. (J-L) bladeren na het beitsen met toluidineblauw O. Deze visuele hulpmiddel toont het verwachte uiterlijk van het monster voordat het naar de volgende stap gaat en benadrukt de variabiliteit van het protocol tussen soorten. F. carica werd als een buitenbeentje opgenomen om de toepasbaarheid van het protocol aan te tonen over een breder scala aan blad- en venatiemorfologieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeeldmetingen van huidmondjes en epidermale kenmerken. Gemeten eigenschappen worden op de afbeelding als volgt weergegeven: As = huidmondjesgebied; Ls = huidmondjeslengte; Ws = huidmondjesbreedte; Ae = epidermale celoppervlakte. De dichtheid van huidmondjes en epidermale cellen werden berekend binnen het gemarkeerde gebied, zoals beschreven in het protocol. Afbeelding met 400x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vergelijking van beelden verkregen met clearing-protocol en peeling-protocol. Representatieve afbeeldingen van T. officinale en F. excelsior die opklarings- en huidmondjes-schelpbeelden vergelijken en de zichtbaarheid en variabiliteit van huidmondjes en epidermiscelgrootte en -dichtheid tonen. Schaalbalk 50 μm, en beelden worden genomen met 400x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Verschillen in handmatige eigenschappenmetingsresultaten tussen clearing- en peelingprotocol. Box-plots die verschillen tonen in huidmond- en epidermale kenmerken tussen clearing- en epidermale peelmethoden bij T. officinale en F. excelsior. (A) Gemiddelde huidmondjesoppervlak (B) gemiddelde huidmondjesbreedte (C), huidmondjesdichtheid (D), gemiddelde epidermale celoppervlakte, en (E) epidermale celdichtheid. Asterisken geven statistische significantieniveaus aan (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). De statistische significantie werd beoordeeld met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's HSD post-hoc test. Steekproefgrootte per groep: n = 3-5. Afkortingen: A s= huidmondjesgebied; Ws = huidmondjesbreedte; SD = huidmondjesdichtheid; Ae = epidermale celoppervlakte; ECD = epidermale celdichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Voorbeeld van segmentatieresultaten met behulp van een huidmondjedetectiemodel op een schilmonster. StoManager1-segmentatieresultaat voor een gepeld monster van T. officinale (onderzijde van een volwassen, in schaduw blootgesteld blad), wat een goede detectienauwkeurigheid laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Voorbeeld van segmentatieresultaat met behulp van een huidmonddetectiemodel op een vrijgemaakt monster. StoManager1-segmentatieresultaat voor een gezuiverd monster van T. officinale (onderkant van een volwassen schaduwblootgesteld blad), met een verminderde detectienauwkeurigheid vergeleken met gepelde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Verschillen in door AI ondersteunde eigenschappenmetingsresultaten tussen clearing- en peelingprotocol. Box-grafieken tonen AI-afgeleide metingen van huidmondjes anatomische kenmerken uit beelden verwerkt door StoManager1 in T. officinale en F. excelsior. Kenmerken zijn onder andere huidmondjesgebied (As), huidmondjesbreedte (Ws), huidmondjeslengte (Ls) en huidmondjesdichtheid (Ds). Eenheden zijn zoals in Figuur 5. De statistische significantie werd beoordeeld met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's HSD post-hoc test. Asterisken geven statistische significantieniveaus aan (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Steekproefgrootte per groep: n = 3-5. Afkortingen: A s= huidmondjesgebied; Ws = huidmondjesbreedte; Ls = huidmondjeslengte; Ds = huidmonddichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Screenshots die segmentatie tonen met een generalistische deep learning-tool en pixel-gebaseerde classifier. Gepeelte F. excelsior-monstersegmentaties (abaxial bladoppervlak) met (A) generalistische deep learning-tool (Cellpose (cyto2)), en (B) pixelgebaseerde classifier (ilastik). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Ilastik-segmentatiemasker voor een gepeld monster van F. excelsior (abaxiale zijde van een blad), met talrijke vals-positieven. Kleine stippen worden ten onrechte geclassificeerd als aparte epidermale cellen. Tijdens de nabewerking is handmatige (visuele) inspectie nodig om op grootte gebaseerde drempels in te stellen en zo valse positieven effectief te filteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Oplossing	Bereiding	Laatste deel
Basis voor buffer 1	7,12 g (Na₂HPO₄ *2H₂O) in 200 mL dist. H₂O	200 mL
Basis voor buffer 2	7,12 g Na₂HPO₄ *2H₂O) in 200 mL dist. H₂O	200 mL
Fosfaatbuffer	Meng 36 ml basis 1, 14 ml basis 2 + 50 ml dist. H₂O	100 mL
Fixatieve oplossing	Meng 9,25 ml 5% glutaraldehyde met 12,5 mL fosfaatbuffer en 28,25 mL dist. H₂O	50 mL

Tabel 1: Recept voor fixatieoplossing²⁴. Samenstelling van de oplossingen die in deze studie zijn gebruikt.

Soorten	Zijkant	Methode	Man (As)	AI (AS)	Man (Ws)	AI (Ws)	Man (Ls)	AI (Ls)
Fraxinus	Abaxial	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abaxial	Goedgekeurd	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abaxial	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaxial	Goedgekeurd	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaxial	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tabel 2: Aanduidende vergelijkingen van handmatige metingen en AI. ML (StoManager1) schaalde resultaten. Mens en AI geven overeenkomstig handmatige en AI (StoManager1) resultaten aan. Eenheden zijn zoals in Figuur 5. Handmatige en AI-metingen verschillen aanzienlijk. Sommige vergelijkingen zijn om verschillende redenen niet beschikbaar, waaronder ontbrekende huidmondjes (bijv. adaxiale F. excelsior) of mislukte detectie (bijvoorbeeld waren huidmondjes moeilijker te detecteren in vrijgemaakte monsters vanwege vagere celcontouren).

Aanvullende figuur 1: Voorbeelden van veelvoorkomende fouten tijdens het verwijderen van bladeren die de resultaten beïnvloeden. Afbeeldingen getoond voor probleemoplossing: (A) ongelijkmatige kleuring door onvolledige rehydratatie van het monster tijdens sectie 3.10; (B) mechanische schade als gevolg van het verkeerd hanteren van het chemisch verwerkte, zeer fragiele monster; (C) groene tint in het midden van het monster door onvolledige verwijdering van chlorofyl tijdens sectie 3.5. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Voorbeeld van de StoManager1-gebruikersinterface. Screenshot van de StoManager1-gebruikersinterface met de invoeropstelling en resultaattabel (links), en micrografische weergaven met originele afbeeldingen (rechtsboven) en huidmonddetectie-overlay (rechtsonder, adaxiale oppervlak van een T. officinale gepeelt monster). Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Voorbeeld van een Cellpose-gebruikersinterface. Screenshot van Cellpose-segmentatie in uitvoering via de GUI met instelbare parameters (bijv. modelkeuze - aanbevolen voorgetraind cyto2-model of een op maat getraind model, drempels en celdiameterkalibratie). Onder toezicht gemaakte handmatige annotatie van epidermiscellen markeert elke cel in een unieke kleur om de modelkalibratie te begeleiden. Overlay toont segmentatie van een F. excelsior abaxiale epidermale peeling. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Ilastik-segmentatieproces. Overlay illustreert pixel-gebaseerde classificatie op een afbeelding van een F. excelsior abaxiale epidermale peel. (A) Screenshot van lopende ilastik-segmentatie die begeleide training toont met handmatig gelabelde klassen: epidermale cellen (geel), celcontouren (blauw) en niet-epidermale achtergrond zoals trichomen (rood). (B) Screenshot die alleen de epidermisklasse toont (geel), waarin wordt getoond hoe de classifier individuele epidermale cellen isoleert. Let op de aanwezigheid van meerdere vals-positieve "kleine" detecties, vooral in gebieden met laag contrast of ongelijkmatige verlichting. (C) Screenshot waarop alleen de contourklasse (blauw) wordt getoond, waarin wordt geïllustreerd hoe de classifier celgrenzen isoleert van het omliggende epidermale weefsel. Let op dat sommige contouren discontinu zijn en dat meerdere vals-positieve "kleine" detecties optreden, vooral in gebieden met laag contrast of ongelijkmatige verlichting. (D) Screenshot met de achtergrondklasse. Het masker benadrukt huidmondjescomplexen, kliertrihomen en diverse afvalresten (rood), terwijl epidermale cellichamen worden uitgesloten. Talrijke kleine vals-positieve "kleine" detecties zijn zichtbaar in de epidermale gebieden, voortkomend uit grijswaardenartefacten en textuurgebaseerde misclassificatie. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Cellpose-trainingsinstellingen. Voorbeeld van Cellpose-trainingsinstellingen (GUI) voor een gewiste T. officinale-sample (beide bladoppervlakken), waarbij standaardmodelparameters worden getoond vóór de aanpassing. Het vooraf getrainde cyto2-model wordt geselecteerd, met een leersnelheid van 0,1 en 100 trainingsepochs (standaardwaarden), die respectievelijk de updatesnelheid van modelgewichten en het aantal trainingspasses bepalen. Deze standaardwaarden worden vaak aangepast (bijv. leersnelheid = 0,15; epochs = 12) om de trainingstijd te verkorten en het model aan te passen aan de morfologie van de plantenepidermis; Lagere epochnummers kunnen echter de detectieprestaties verminderen en de vals-positieven verhogen. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Cellpose "labels" masker. Het aanbrengen van Cellpose "labels" masker voor een afgepeld F. excelsior-monster (abaxiale bladoppervlak), waarbij het resultaat van supervised training wordt getoond waarbij elk gesegmenteerd object een unieke identificatie krijgt. Epidermale cellen (aangeduid als e) domineren, terwijl ook huidmond-beschermcelparen (gemarkeerd als g) worden gedetecteerd. Vals-positieve resultaten zijn zichtbaar waar trichomen ten onrechte worden geclassificeerd als epidermale cellen (linksboven) of huidmondjes (onder in het midden), evenals vals-negatieve cellen waarbij epidermale cellen ongelabeld blijven over delen van de afbeelding. Dit maskertype wordt gebruikt voor downstream kwantificatie en verfijning van begeleide modellen. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Kwantificering van gesegmenteerde epidermale cellen in ImageJ/Fiji. Screenshots die segmentatie-kwantificatie van epidermale cellen tonen na de classificatie van ilastik-pixels voor een gepeelt F. excelsior-monster (abaxial bladoppervlak). (A) In het geëxporteerde masker komt elke gedetecteerde pixelcluster overeen met een individueel deeltje, waardoor geautomatiseerde extractie van objectniveaumetrieken mogelijk is (bijv. oppervlakte, omtrek, Feret-diameters). Het Resultatenvenster (onderaan) toont ruwe metingen voor duizenden objecten; Let op het uitzonderlijk hoge aantal kleine deeltjes dat ontstaat door "kleine" dotruis en fragmentaire contouren, wat wijst op de aanwezigheid van talrijke vals-positieven. Deze artefacten vereisen vervolgens biologisch geïnformeerde filtering om echte epidermiscellen te isoleren voordat er een downstream statistische analyse plaatsvindt. (B) Gebiedsgebaseerde filtering van ilastik-gesegmenteerde epidermale objecten in ImageJ/Fiji. Kleine fragmenten en ruis worden uitgesloten door een minimale gebiedsdrempel van 150-350 μm² toe te passen, waardoor het aantal gedetecteerde deeltjes met ongeveer een orde van grootte (tienvoudig) ten opzichte van het ongefilterde masker in paneel A wordt verminderd. Hoewel deze filterstap kleine vals-positieven aanzienlijk verwijdert, blijft de onvolmaakte classificatie bestaan: gefragmenteerde contouren en resterende niet-epidermale elementen blijven bestaan en vereisen extra verfijning, zoals circulariteitsdrempels of biologisch geïnformeerde post-screening. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Nabewerking van een Cellpose "labels" masker in ImageJ/Fiji. Door gebruik te maken van de Labels to ROIs-plugin voor een gepeelt F. excelsior-monster (abaxiale bladoppervlak), wordt elk gesegmenteerd object in het masker omgezet in een regio van belang (ROI), waardoor individuele inspectie en meting van epidermale cellen en huidmondbeschermcelcomplexen mogelijk is. ROI's worden over de originele micrografie (links) gelegd, terwijl het Resultatenvenster (rechtsonder) celniveau-metrieken toont (bijv. oppervlakte, Feret-diameters, omtrek). Deze stap maakt biologisch geïnformeerde curatie mogelijk, waardoor gebruikers kunnen verifiëren of elke ROI overeenkomt met een echte epidermale cel en artefacten zoals tricomen of verkeerd gesegmenteerde huidmondjes die na het filteren van de drempel blijven bestaan, kunnen verwijderen, waardoor latere analysestappen worden geïnformeerd. Klik hier om dit figuur te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor consistente maatmetingen van de huidmondjes moeten schillen worden genomen uit de centrale lamina voor de gestandaardiseerde resultaten, waarbij grote aders worden vermeden, aangezien de dichtheid van de huidmondjes een sterke variatie binnen het blad vertoont, afnemend richting de bladbasis, punt en randen^25,26. Verse bladeren leveren de meest betrouwbare peeling op, mits er niet-krimpende, transparante nagellak en hoogwaardige transparante tape worden gebruikt om vervorming of artefacten te voorkomen. Vertragingen na meer dan ~12 uur verminderen de contourhelderheid door uitdroging. Omdat peels tijdelijk worden gemonteerd en lucht kunnen vasthouden, wordt vroege beeldvorming aanbevolen, maar de kwaliteit blijft ook na een maand acceptabel.

Er bestaan verschillende clearingmethoden voor specifieke weefseltypen, beeldvormingsdoelen en veiligheidsoverwegingen 13,14,15. Chemische verwijdering werd uitgevoerd met een waterig NaOH-gebaseerd protocol vanwege de toegankelijkheid, lage toxiciteit en brede toepasbaarheid over bladtypen heen. Omdat weefselreacties per soort verschillen, is testen en optimalisatie nodig. Sclerofylle bladeren kunnen ≥2 weken nodig hebben, en achtergebleven groen weefsel kan de kleuring belemmeren en anatomische kenmerken verhullen (aanvullende figuur 1C). Voor snellere verwijdering kan de NaOH-concentratie worden verhoogd tot 2,5 M of 5 M. Zachte bladeren worden fragiel na het bleken (Sectie 3.7; Aanvullende figuur 1B), en overmatige blootstelling aan natriumhypochloriet (NaClO) kan weefsel afbreken of het scheiden van de epidermale laag veroorzaken. Terwijl 30 tot 2 minuten bleken voldoende is voor de meeste zachte bladeren, kunnen taaiere soorten tot 1 uur^{en 27} minuten nodig hebben. Hoewel het opruimen langzamer is dan de voorbereiding van de schil, met ~5 dagen en geen gespecialiseerde training, kan het worden aangepast voor diverse soorten. Vrijgemaakte en gekleurde monsters kunnen worden bewaard in gedestilleerd water bij 4°C, met permanente bevestiging aanbevolen voor langdurige conservering^15,27.

Stomata-specifieke StoManager1 detecteerde stomatale complexen betrouwbaar in de meeste beeldtypen (aanvullende figuur 2), met detectieresultaten die over het algemeen consistent waren met handmatige annotatie voor peel-gebaseerde methoden. Echter, metingen van huidmondoppervlakken verschilden systematisch van handmatige metingen (Tabel 2), waardoor kalibratie op basis van een kleine handmatig gemeten subset (bijv. 10-20 huidmondjes per soort) noodzakelijk was vóór grootschalige analyse. StoManager1 verhoogt de doorvoersnelheid aanzienlijk, waarbij handmatige verificatie vereist is in niet-standaard gevallen.

Gelijktijdige segmentatie van huidmondjes en epidermis is uitdagend omdat optimale scherpte verschilt, en heterogeniteit in morfologie en membraanhelderheid segmentatiefouten introduceert. Op dezelfde manier verliest training op grote beeldsets (bijv. adaxiale/abaxiale oppervlakken, afgepeld/gecleared) specificiteit. Er bestaat geen vooraf getraind Cellpose-model voor plantenepidermis; De standaard "Cyto"- en "Cyto2"-modellen, voornamelijk getraind op dierlijke cellen, presteren slechter op epidermale beelden. Daarom is op maat gemaakte training vereist voor betrouwbaarheid (Aanvullende sectie 2). Zelfs na training blijven oversegmentatie en vals-positieven veelvoorkomend, vooral bij beelden met weinig contrast of onduidelijke (aanvullende figuur 3).

In ilastik (aanvullende sectie 3, aanvullende figuur 4) moeten objectmaskers worden gegenereerd voor de doelcelklassen (bijv. klasse 1 voor de epidermis), terwijl klassemaskers behouden blijven voor auditing en handmatige correctie. Batchverwerking en daaropvolgende ImageJ/Fiji-workflows kunnen tijd besparen en handmatige fouten verminderen. Consistente filtering op gebied, standaarddeviatie of quantielen is essentieel om ruis en valse detecties te onderdrukken. Na filtering naderen mediane celoppervlakte en celtellingen handmatige waarden. Benchmarking met handmatige metingen en alternatieve ML-tools (Weka, RootPainter) blijft essentieel voor het afstemmen van parameters en het beoordelen van segmentatiekwaliteit. ML batchverwerking is veeleisend. Stabiele training en grootschalige batchsegmentatie vereisen een NVIDIA CUDA-compatibele GPU en ≥32 GB RAM. Op midrange systemen (bijvoorbeeld 16 GB RAM met geïntegreerde grafische kaart) vereist supervised training doorgaans ~5-10 minuten voor <10 afbeeldingen en crashte het vaak wanneer meerdere annotatieklassen of heterogene afbeeldingstypen werden gebruikt. CUDA verhoogde de verwerkingssnelheid met ~10-20x ten opzichte van CPU- of geïntegreerde GPU-uitvoering.

Verschillen in prestaties tussen Cellpose, ilastik en StoManager1 ontstaan door hun verschillende kenmerkrepresentaties. Cellpose voorspelt vectorstroomvelden richting objectcentra en is gevoelig voor optische halo's en abrupte brekingsgrenzen, die de stroming verstoren en clusters van vals-positieven genereren in de gezuiverde F. excelsior. Ilastik, als door mensen geleide pixelclassifier, oversegmenteert celwanden of halo's met hoog reliëf op het asfalt, tenzij expliciet als achtergrond is gelabeld. StoManager1 detecteert huidmondjescomplexen met behulp van objectniveau-vormpatronen (gepaarde beschermcellen met een centrale porie) en presteert goed bij peelpreparaten, waaronder F. excelsior²⁸; echter, halo-geïnduceerde vervaging beïnvloedt de zichtbaarheid van de porie bij het clearen en veroorzaakt vals-negatieve resultaten in plaats van een verkeerde classificatie (Aanvullende bestandensecties 1 en 3). Dienovereenkomstig werken Cellpose en StoManager1 als geautomatiseerde segmenteerders, terwijl ilastik functioneert als een door mensen geleide classifier (Aanvullende bestandsectie 1-3)²⁸^.

De soortspecifieke celarchitectuur moduleert de prestaties van AI. Bij T. officinale komen gladde, elliptische guard-celmarges overeen met de StoManager1-trainingsverdeling, waardoor detectie mogelijk is op gepeelte monsters (aanvullende figuur 2), terwijl generalistische instrumenten vaak guard- en pavementcellen verwarren. Bij F. excelsior leiden teruggetrokken huidmondjes en hoog-relief wegdekcellen tot valse negatieven op gezuiverde beelden. Deze afwijkingen weerspiegelen de soort- en voorbereidingsafhankelijke beeldvormingsgeometrie. Systematische verschillen tussen handmatige en AI-gebaseerde metingen komen voort uit twee bronnen: het ontbreken van schaalcodering uit beeld door AI en door voorbereiding geïnduceerde optische artefacten. Mitigatiestrategieën omvatten visuele triage van vage vlekken en halo's uit weefselvoorbereiding, voorkeursgebruik van peels onder hierboven beschreven omstandigheden, handmatige kalibratie met lineaire correctie op een kleine subset van huidmondjes (handmatig = a + b × AI). Aanvullende strategieën zijn taxonspecifieke augmentatie en het ontwerp van hulpklassen voor training (hoewel eigen getrainde modellen waarschijnlijk lager blijven dan voorgetrainde modellen op grote, diverse datasets), en postsegmentatie van hogere kwantielen.

Omdat AI-segmentatiefouten systematisch en niet-willekeurig zijn, is nabewerking essentieel. Beeldkwaliteitsdiagnostiek kan een eenvoudige beslissingsboom volgen. Begin met het controleren van epidermale contrast en scherpte: als het scherp is, ga dan over op vals-positieven; Als het wazig is, kun je kleine hoogfrequente artefacten verwachten en filters aanpassen. Als vals-positieven (bijv. stippen, puin) minimaal zijn, is ±2-3 SD-uitschieterfiltering meestal voldoende. Als kleine artefacten domineren, gebruik dan quantielgebaseerde filtering. Vergelijk vervolgens eigenschappenverdelingen (bijv. mediaan Ae) met biologische verwachtingen of handmatige data. Verfijn drempels waar nodig - het behouden van slechts de bovenste 10-50% kwantielen in artefactrijke datasets zorgt voor betekenisvolle output (aanvullendefiguren 7 en 8). Door de hoge vals-positieve percentages die door epidermale ML-instrumenten worden geproduceerd, konden betrouwbare schattingen van huidmondjesdichtheid niet automatisch worden afgeleid, terwijl StoManager1 nauwkeurige stomatale metingen²⁸ gaf wanneer grenzen duidelijk waren (zie Figuren 6 en 7). Voor epidermale mediaan bleek Ae robuust, omdat het minder gevoelig was voor kleine vals-positieven dan het gemiddelde.

Methodekeuze beïnvloedde de detectie van eigenschappen. Schillen presteerde beter dan het opruimen van de huidmondjes dichtheid door de huidmondjes volledig bloot te leggen (Figuur 3), terwijl het verwijderen vaak kleinere huidmondjes in gelaagde of gepigmenteerde weefsels verborgen hield, ondanks dat het soms beter behield van huidmondjesvorm²⁷. Onder AI-tools bood StoManager1 consequent robuuste huidmondmetingen met minimale curatie, vooral bij peelpreparaten²³, en peeling verbeterde ook de epidermale metingen door correct geïdentificeerde cellen en beelddekking te vergroten². Toekomstige winst zal waarschijnlijk voortkomen uit grote, taxonomisch diverse voorgetrainde modellen voor integratie in geautomatiseerde beeldvormingspijplijnen voor ecofysiologie en gewasverbetering.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen het H2020-programma van de Europese Unie (project GAIN4CROPS, GA nr. 862087). Het Centrum van Excellentie AgroCropFuture Agroecologie en nieuwe gewassen in toekomstige klimaten (Ests Ministerie van Onderwijs en Onderzoek), Estse Onderzoeksraad (PRG 3201 en PRG 2207 en TARISTU24-TK28).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Desinfecterende vloeibare reiniger NaClO <5%	Domestos, GB	H000023244	Huidverbranding
Dinatriumwaterstoffosfaatdihydraat (Na₂HPO₄^. 2H₂O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Ethanol, abs. 100% a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Zeer ontvlambaar
Glazen flacon 2 mL	VWR Life Science, US	548-0045
Glutaraldehyde 50% oplossing	VWR Life Science, US	23H2856331	Dodelijk bij inademing. Giftig indien ingeslikt. Draag beschermende handschoenen, kleding, bril.
Microscoopglaasjes	Normax, PT	5470308A	NA
Nagelverzorging topcoat sneldrogend	BK (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 en Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipetten en pipettentips	Thermo Scientific, FI	KJ16047	NA
Eenzijdige stalen messen	Oxford instruments	51-1625-0182	NA
Natriumdiwaterstoffosfaatdihydraat (NaH₂PO₄^. 2H₂O) puur	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Natriumhydroxide korrels (NaOH) puur	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Ernstige brandwonden.
Kantoorartikelen doorzichtige tape	FOROFIS, LV	91231	NA
Toluidineblauw, algemeen gebruik	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA