Methodenartikel

Serial Killing Assay met behulp van longitudinale impedantie-gebaseerde tumorcellevensvatbaarheidsmeting - Een nuttige methode om de prestaties van T-cellen te beoordelen

DOI:

10.3791/69623

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een impedantie-gebaseerde realtime assay om de seriemoordcapaciteit en persistentie van CAR T-cellen onder chronische antigeenstimulatie te kwantificeren, waarbij een plaatwasmethode wordt geïntegreerd voor kosteneffectief hergebruik van assayplaten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De therapie met chimere antigeenreceptor (CAR) heeft de behandeling van specifieke hematologische maligniteiten gerevolutioneerd. Echter, een aanzienlijk deel van de patiënten ervaart een terugval door antigeenverlies, antigeen-downregulatie of uitputting van T-cellen. Deze uitdagingen benadrukken de noodzaak van functionele assays die het dodelijke vermogen en de persistentie van CAR T-cellen onder chronische antigeenstimulatie kunnen evalueren. Seriële dodelijke assays, die het vermogen van CAR T-cellen meten om tumordoelen herhaaldelijk te elimineren, bieden waardevolle inzichten in de duurzaamheid en potentie van CAR T-celreacties.

Hier presenteren we een impedantie-gebaseerde assay met het Real-Time Cell Analysis (RTCA)-systeem om CAR T-cel-gemedieerde seriemoord in vitro te kwantificeren. Tumorcellen worden herhaaldelijk gezaaid en laten hechten aan assay-specifieke E-platen voordat CAR T-cellen worden toegevoegd bij gedefinieerde effector-doelverhouding (E:T). Het platform monitort continu de levensvatbaarheid van tumorcellen zonder labels en legt dynamische cytotoxiciteit vast met een hoge temporele resolutie. Kernmetingen omvatten de kinetiek van de celindex (CI), de sterfsnelheid van tumorcellen en de tijd tot het doelwit. De progressieve afname van het dodelijke vermogen dat wordt waargenomen bij herhaalde tumor-doelaanval dient als een marker voor verworven CAR T-celdysfunctie, vaak T-celuitputting genoemd. Samen maken deze metrics een nauwkeurige evaluatie van de functie van CAR T-cellen bij verschillende E:T-verhoudingen mogelijk en maken ze directe vergelijking mogelijk tussen verschillende CAR T-celconstructies of co-behandelingen in de loop van de tijd.

Om de kostenefficiëntie te vergroten, hebben we een plaatwasmethode ontwikkeld die het hergebruik van assay E-plates mogelijk maakt zonder de assayprestaties of gegevensintegriteit in gevaar te brengen. De geoptimaliseerde workflow verlaagt de assaykosten en behoudt tegelijkertijd de analytische robuustheid. Deze aanpak maakt betaalbare en schaalbare preklinische beoordeling van de functie van CAR T-cellen mogelijk, wat verbeteringen in het ontwerp van celtherapieën mogelijk maakt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chimerische antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie heeft de kankerimmunotherapie gerevolutioneerd met opmerkelijk klinisch succes bij meerdere hematologische maligniteiten zoals chronische lymfoïde leukemie, acute lymfoblastische leukemie, grote B-cellymfoom en multipel myeloom 1,2,3,4,5. Sinds de eerste goedkeuringen van de toezichthouders is het aantal CAR T-celproducten en behandelde patiënten gestaag toegenomentot 6. Afhankelijk van het specifieke product en de klinische indicatie variëren de typische infusiedoses van ongeveer 2 × 106tot 5 × 108CAR+ T-cellen per patiënt,7. Hoge infuusdoseringen zijn noodzakelijk om een effectieve tumorverwijdering en langdurige ziektebestrijding te bereiken, maar zijn gepaard gegaan met klinische en praktische uitdagingen. Grote celaantallen kunnen het risico op ernstige bijwerkingen zoals cytokine-release syndrome (CRS) en immuuneffectorcel-geassocieerd neurotoxiciteitssyndroom (ICANS) verhogen, die beide dosisafhankelijk kunnen zijn8. Daarnaast is het produceren van voldoende functionele CAR T-cellen een uitdaging bij zwaar voorbehandelde of lymfodeplete patiënten, en het proces kan logistiek veeleisend en kostbaar zijn voor behandelcentra9.

Ondanks deze uitdagingen bereiken CD19-gerichte CAR T-celtherapieën 70%-90% volledige remissie bij patiënten met terugvallende of refractaire B-celmaligniteiten, wat een transformerend klinisch effect aantoont 10,11,12. Echter, CAR T-celtherapie kent relevante uitdagingen die de langetermijneffectiviteit beperken. Belangrijke obstakels zijn antigeenverlies of -downregulatie, onvoldoende persistentie van CAR T-cellen en functionele uitputting9. CAR T-celuitputting – gekenmerkt door verminderde proliferatieve capaciteit, verminderde antitumoractiviteit en slechte persistentie – vormt een essentiële oorzaak van non-response en terugval13. Uitgeputte CAR T-cellen gaan gepaard met verminderde effectorfunctie, aanhoudende expressie van remmende receptoren en defecte cytokineproductie door chronische antigeenblootstelling en immunosuppressieve tumormicroomgevingen14. Klinische studies hebben aangetoond dat verlies van functionele CAR T-celpersistentie geassocieerd is met een verhoogd risico op terugval 11,15,16,17. Omdat langdurige in vivo activiteit een belangrijke voorspeller lijkt te zijn van therapeutisch succes, is het begrijpen van de duurzaamheid en het aanhoudende dodelijke vermogen van CAR T-celproducten een belangrijk doel in zowel preklinisch als translationeel onderzoek. Bijzonder interessant is het vermogen van CAR T-cellen om tumorcellen herhaaldelijk te herkennen en te lyseren gedurende langere periodes - de zogenaamde 'seriële moord' - omdat deze eigenschap een functionele maatstaf biedt voor persistentie en weerstand tegen uitputting18.

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van seriële dodende assays met behulp van het xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) impedantieplatform, inclusief een optionele wasprocedure die hergebruik van assayplaten, verder E-platen genoemd, mogelijk maakt, waardoor de kostenefficiëntie verbetert zonder de assayprestaties in te boet. De reden voor het ontwikkelen van zo'n protocol komt voort uit beperkingen in conventionele cytotoxiciteitstests, die doorgaans alleen statische eindpuntuitlezingen bieden. Veelvoorkomende benaderingen, zoals chroom-51-vrijgave, lactaatdehydrogenase (LDH)-assays of flowcytometrie-gebaseerde levensvatbaarheidsassays, vereisen labels, vereisen arbeidsintensieve workflows en zijn beperkt tot gedefinieerde tijdstip:18,19. Belangrijker nog, ze kunnen niet gemakkelijk dynamische dodelijke kinetiek vastleggen bij langdurige stimulatie of meerdere rondes antigeenblootstelling, een situatie die direct verband houdt met de persistentie van CAR T-cellen en functionele uitputting18.

Het xCELLigence RTCA-platform vult deze hiaten aan door labelvrije, realtime kinetische monitoring van de levensvatbaarheid van doelcellen via elektrische impedantie20 te bieden. Adherente tumordoelcellen worden gezaaid op gouden micro-elektrode gecoate E-platen, waar hun hechting en proliferatie de gemeten impedantie verhogen, gerapporteerd als de Cell Index (CI)21. Bij CAR T-gemedieerde doding worden doelcellen gedood en losgelaten, wat leidt tot een snelle daling van de impedantievan 20. Deze realtime uitlezing maakt continue beoordeling van cytotoxiciteit mogelijk gedurende uren of dagen zonder extra labels of reagentia te hoeven gebruiken22. CAR T-cellen, die niet-hechtend zijn, dragen niet bij aan het impedantiesignaal, waardoor een duidelijke scheiding van effector- en doeluitlezingenmogelijk is. Omdat gegevens continu worden geregistreerd, kunnen onderzoekers multi-ronde stimulatieprotocollen uitvoeren waarbij CAR T-cellen herhaaldelijk worden overgebracht en blootgesteld aan verse tumordoelcellen, waardoor directe metingen mogelijk zijn van hoe de dodelijke capaciteit zichin de loop van de tijd ontwikkelt. Dit bootst de herhaalde antigeenontmoetingen na die CAR T-cellen in vivo ervaren en levert een functionele uitlezing van hun cytotoxische capaciteiten.

Deze impedantie-gebaseerde seriële dodingstest is ideaal voor onderzoekers die de functie van CAR T-cellen evalueren in preklinische omgevingen, waaronder constructoptimalisatie, functionele vergelijkingen en potentietests. Dit protocol vereist het xCELLigence RTCA-systeem en het gebruik van E-Plate 96. Hoewel breed toepasbaar op adherente tumormodellen, is het niet direct geschikt voor suspensieculturen zonder immobilisatie- of tetheringstrategieën. Omdat impedantiemetingen alleen alleen de hechting en levensvatbaarheid van de doelcel weerspiegelen, worden aanvullende analyses zoals flowcytometrie of cytokinetests aanbevolen om de activatie, proliferatie en uitputting van CAR T-cellen volledig te karakteriseren. Het protocol bevat aangewezen stappen die het oogsten van cellen en supernatanten voor deze extra uitlezingen mogelijk maken, waardoor de functionaliteit van CAR T-cellen meer volledig kan worden beoordeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de E-Plate 96 en vereist het xCELLigence RTCA-systeem. Adherente tumorcellen worden van tevoren van tevoren van de nacht gezaaid om de logaritmische groeifase te bereiken op het moment van toevoeging van CAR T-cellen. Afhankelijk van de tumorcellijn en zaaidichtheid kan dit interval worden verkort tot 6 - 9 uur, waardoor effectoren op dezelfde dag kunnen worden toegevoegd. Als deze laatste workflow wordt uitgevoerd, wordt de nominale dag-tot-dag tijdlijn die in het protocol wordt beschreven aangepast en moeten gebruikers het schema dienovereenkomstig aanpassen. Co-culturen worden 48 uur gehandhaafd voordat CAR T-cellen worden overgebracht op vers geplateerde tumorcellen, waarbij twee plaatposities op het xCELLigence-instrument nodig zijn en om de dag wordt afgewisseld tumorcelplatering en effector-toegevoegd worden. CAR T-cellen moeten worden gegenereerd volgens institutionele SOP's of vastgestelde protocollen. Kort gezegd worden perifere bloed T-cellen geïsoleerd onder goedgekeurde ethische normen, getransduceerd onder geschikte bioveiligheidsomstandigheden en beoordeeld op transductie-efficiëntie en levensvatbaarheid met flowcytometrie of gelijkwaardige QC-assays. xCELLigence-assays mogen niet worden uitgevoerd wanneer de CAR-transductie-efficiëntie onder de 20% ligt, omdat lagere efficiënties kunnen leiden tot meer achtergrond en onspecifieke doding door niet-transduceerde cellen, wat tumorgroeicurves kan vervormen. Alle celbehandeling moet onder steriele omstandigheden plaatsvinden in een laminaire stroomkap. Media kan worden gebruikt volgens de standaard van het laboratorium of zoals aanbevolen door de leverancier. Tenzij anders gespecificeerd, worden cellen geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Hoewel geoptimaliseerd voor CAR T-cellen, kan deze methode ook worden toegepast op andere op ophanging gebaseerde effectorcellen en hechtende doelen.

1. Voorbereiding en blanco (Dag 1)

  1. Bordvoorbereiding
    1. Voeg 50 μL tumormedium toe aan de onderkant van elke put van de E-plaat 96.
      OPMERKING: Wees voorzichtig dat je de onderkant van de put niet bekrasst, want dit kan schade aan de plaat veroorzaken.
    2. Plaats de E-plaat in de broedmachine en plaats deze op dezelfde machinegleuf om voor metingen te worden gebruikt.
    3. Incubeer de E-plaat 30 minuten bij 37 °C om deze op de juiste assaytemperatuur en pH te brengen.
  2. Instrumentenopstelling
    1. Start ondertussen de RTCA Software Pro (versie 2.6.1) en selecteer een bestandspad om het experiment op te slaan.
    2. Voer de naam van het experiment in in het veld "RTCA Operator" en sla op.
    3. Selecteer de putten die gemeten moeten worden.
    4. Wijs celnamen toe onder het tabblad Cel en behandeltypes onder het tabblad Behandeling .
  3. Meetschema
    1. Stel het schema op met de volgende stappen:
      Stapnaam = Leeg ; Sweeps = 1 ; Interval = 1 ; Duur = 0:00
      Stapnaam = Tumorcellen ; Sweeps = 250-300 ; Interval = 15 min; Duur = minimaal 24 uur
      Stapnaam = Behandeling ; Sweeps = tot 2500 ; Interval = 5 min; Duur = minimaal 72 uur
    2. Druk op Aanpassen en zorg ervoor dat Auto niet voor een stap is geselecteerd.
  4. Blanking-stap
    1. Na de 30 minuten incubatie van de E-plaat bij 37 °C, druk je op PLAY/RUN om de blanke stap te starten.
    2. Wacht tot de software de stap als KLAAR markeert (ongeveer 1-2 minuten).
    3. Ontgrendel de cradle en verwijder de E-plaat alleen wanneer je klaar bent om celzaaiing te starten.

2. Ronde 1: Tumorcelzaaiing (Dag 1)

  1. Uitzaaien van tumorcellen
    1. Bereid een suspensie van tumorcellen voor in 50 μL geschikt medium per put.
    2. Verwijder de E-plaat uit de broedmachine en zaai de cellen in driemaal.
  2. Uitgangsmeting
    1. Plaats de E-plaat onmiddellijk terug in de machine en vergrendel de houder.
    2. Wacht 5-10 minuten voor de eerste meting om de temperatuur en pH van de E-plaat in evenwicht te brengen, en klik dan op de PLAY/RUN-knop om de meting te starten (Stap 2 van schema = Tumorcellen).
    3. Incubeer de E-plaat een nacht om celhechting mogelijk te maken. Monitor de niet-genormaliseerde Celindex (CI). Wanneer de CI de log-fase groeifase binnengaat, gaat u door naar de volgende stap. Deze fase hangt af van de gebruikte cellijn en kan worden beïnvloed door het aantal gezaaide cellen. BxPC3-cellen (ATCC CRL-1687) werden gezaaid met 20.000 cellen per put, waarbij log-fase groei doorgaans werd bereikt na 6-18 uur.

3. Ronde 1: CAR T-celbehandeling (Dag 2)

  1. Voorbereiding en zaaien van T-cellen
    1. Bereid het vereiste aantal CAR T-cellen voor in 100 μL/put in een menselijk T-celmedium zonder expansiecytokines (bijv. IL-2, IL-7, IL-15, enz.).
      OPMERKING: De transductie-efficiëntie van CAR wordt eenmaal aan het begin van het experiment gemeten. De gewenste effector-tot-doelverhouding (E:T) wordt bepaald op basis van het aantal CAR⁺ T-cellen ten opzichte van de aanvankelijk geplateerde tumorcellen. Bijvoorbeeld, voor een 1:1 E:T-verhouding met 50% CAR⁺ T-cellen en 20.000 BxPC3 tumorcellen, moeten 40.000 totale T-cellen worden geplateerd. De E:T-verhouding verwijst dus naar de beginvoorwaarde aan het begin van de seriële moordassay; tenzij er aanvullende metingen worden uitgevoerd, blijven veranderingen in E:T tijdens latere rondes onbekend. Veranderingen in T-celproliferatie of overleving in de loop van de tijd, en dus in de E:T-verhouding, worden beschouwd als onderdeel van de seriemoord-uitlezing. Als T-cellen worden verdeeld tussen rondes, wordt de E:T evenredig herberekend (bijvoorbeeld een 1:1 splitsing na ronde 3 vermindert een initiële 2:1 E:T tot 1:1 voor ronde 4). Als E:T-dynamiek tussen patronen interessant is, kunnen optionele extra putten worden geplateerd voor tussentijdse metingen van CAR-percentage of effectorfunctie. Het verwijderen van anti-CD3/CD28 T-celstimulatiekralen door magnetische scheiding kan helpen om onspecifieke doding te verminderen. Het wordt ook aanbevolen om T-cellen te gebruiken in de logaritmische groeifase (meestal tussen 5 en 20 dagen na stimulatie) en om cellen met cytokines minstens twee dagen voor de test uit te breiden, in plaats van de dag ervoor.
    2. Pas de transductie-efficiëntie van CAR over experimentele groepen aan naar het laagst voorkomende percentage door te mengen met niet-transduceerde T-cellen, gebaseerd op transductie-efficiëntieanalyse.
      OPMERKING: Als alle groepen een gelijke transductie-efficiëntie hebben, is geen aanpassing nodig. Als de percentages van CAR⁺ verschillen, wordt het aantal T-cellen dat wordt plat berekend zodat elke groep begint met hetzelfde effectieve aantal CAR⁺-cellen en CAR-cellen . Dit gebeurt door het gewenste CAR⁺-celaantal (gebaseerd op de E:T-verhouding en tumorzaading) met 100 te vermenigvuldigen en te delen door het gemeten CAR⁺-percentage voor elke groep, waarna niet-getransduceerde T-cellen indien nodig worden toegevoegd om het totale aantal T-cellen te evenaren. Als bijvoorbeeld één groep 50% CAR⁺ T-cellen heeft, worden 40.000 T-cellen geplateerd (20.000 CAR⁺ + 20.000 CAR-), terwijl een groep met 60% CAR⁺ T-cellen 33.333 T-cellen zou platen om 20.000 CAR⁺-cellen te leveren, waarbij 6.667 niet-getransduceerde T-cellen worden toegevoegd om het totale T-celaantal van de eerste groep (totaal 40.000) te evenaren.
    3. Optioneel, als de cytokine of de compoundbehandeling onderzocht moet worden, voeg dan 20 μL toe van een oplossing bestaande uit menselijk T-celmedium en de gewenste cytokine of verbinding met 11 keer de beoogde eindconcentratie. Dit volume wordt bovenop de standaard 200 μL die al in elke put aanwezig is toegevoegd (50 μL voor blanking, 50 μL voor tumorcelzaaiing en tot 100 μL voor T-celtoevoeging). Volgens de fabrikant ondersteunt de E-Plate 96 een maximaal volume van 243 μL ± 5 μL per put, waardoor een totaal volume van 220 μL acceptabel is voor dergelijke optionele behandelingen.
  2. T-cel zaaien en meten
    1. Verwijder de E-plaat door de houder alleen te ontgrendelen wanneer je klaar bent om T-cellen toe te voegen.
    2. Seed bereidde T-cellen direct op de tumorcellen.
    3. Vergrendel de cradle in het meetapparaat en stop stap 2 in de RTCA-software.
      OPMERKING: Als stap 2 niet wordt afgebroken, blijft het systeem de vorige stap meten en stopt pas wanneer die stap is voltooid, wat resulteert in verlies van datapunten.
    4. Wacht tot stap 2 als KLAAR wordt gemarkeerd.
    5. Klik op de PLAY/RUN-knop om stap 3 (Behandeling) te starten en bevestig de prompt door op OK te klikken.
      OPMERKING: Het toestaan van een evenwichtsperiode van 15-30 minuten na het hanteren (bijvoorbeeld na het zaaien of overplaatsen van cellen) voordat de volgende meetstap (voor stap 3.2.5) begint, helpt de initiële afbuiging veroorzaakt door temperatuur- of pH-fluctuaties in de groeicurves te minimaliseren.

4. Ronde 2: Tumorcelzaaiing (Dag 3)

  1. Bereid een nieuwe 96-well xCELLigence E-plaat voor zoals beschreven in stappen 1.1 en 1.4.
  2. Zaad verse tumorcellen zoals beschreven in stap 2.
  3. Incubeer de E-plaat een nacht om celhechting mogelijk te maken.

5. Ronde 2: CAR T-cel overdracht naar tweede E-plaat (Dag 4)

  1. Breng de inhoud van elke put over in een overeenkomstige put van een U-bodem 96-put plaat met behulp van een multikanaals pipet. Wees voorzichtig dat je de elektroden onderaan de E-plaat niet aanraakt.
  2. Centrifugeer op kamertemperatuur, 400 × g gedurende 5 minuten.
  3. Aspiraat het supernatant zorgvuldig en bewaar het voor enzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA) indien nodig.
  4. Sussie de celpellet opnieuw in 100 μL vers medium zonder expansiecytokines.
    OPMERKING (optioneel): T-cellen kunnen nu worden gesplitst (bijv. 50 μL = 1:2 splitsing) en gebruikt voor verdere analyse, zoals flowcytometrie. Het splitsen van T-cellen corrigeert hun proliferatie tijdens de xCELLigence killing assay. Het helpt om het benodigde aantal cycli te verminderen totdat uitputting duidelijk wordt. Het wordt aanbevolen om splitsingsverhoudingen tussen 2 en 4 te testen.
  5. Voeg 100 μL/well T-cellen toe aan de E-plaat van de tumor in de tweede ronde (50 μL bij 1:2 splitsing), zodat medium en, indien van toepassing, cytokine/verbinding volledig worden aangevuld.

   

6. Voortzetting van seriemoord-assay (Dagen 5 - 10 en daarna)

  1. Herhaal stappen 4 en 5 voor extra dodenrondes indien nodig met intervallen van 48 uur.
  2. Monitor de dodelijke activiteit en de persistentie van T-cellen in elk stadium met behulp van xCELLigence-uitlezingen en aanvullende assays zoals ELISA of flowcytometrie.

7. Dataverzameling en E-plate verwerking

  1. Na de gewenste meetduur drukt u op STOP in de software.
  2. Exportgegevens genormaliseerd tot het tijdstip van effectorcel-optelling en niet-gemiddeld om nauwkeurig gemiddelde ± SEM-plotten in de analysesoftware (R, GraphPad Prism, enz.) mogelijk te maken. Exporteer de gemiddelde dataset indien gewenst.
  3. Ontgrendel en verwijder de E-plaat. Breng het experiment uit in de software.
  4. Maak de E-plaat schoon of bewaar in de incubator voor aanvullende analyses (bijvoorbeeld supernatant voor ELISA of celoogst voor flowcytometrie).

8. Optioneel: E-plaat wassen voor hergebruik

OPMERKING: Deze optionele stap maakt hergebruik van xCELLigence E-platen mogelijk om de experimentele kosten te verlagen. Hergebruik wordt alleen aanbevolen als de elektrische eigenschappen van de E-plaat stabiel blijven over experimenten en totdat individuele putten binnen het acceptabele basisbereik vallen. Volg alle veiligheidsprocedures, vooral bij het hanteren van natriumhydroxide (NaOH). Controleer de E-platen visueel na het wassen om mogelijke fouten in de elektroden te detecteren.

  1. Gooi alle inhoud van de E-plaat weg zonder de onderkant van de E-plaat aan te raken.
  2. Was elke put drie keer met 200 μL gedeïoniseerd water.
  3. Voeg 200 μL van 0,1 M NaOH toe aan elke put.
    WAARSCHUWING: NaOH is corrosief. Zorg ervoor dat lokale veiligheidsrichtlijnen worden gevolgd. Draag handschoenen, jas en veiligheidsbril. Hanteer 1 M NaOH in een veiligheidskast. Gooi NaOH-afval in de gootsteen met water om een goede verdunning te garanderen. Meng nooit geconcentreerde zuren en basen. Voeg geen water toe aan zuur; Alleen zuur naar water.
  4. Incubeer de E-plaat 5 minuten op kamertemperatuur.
  5. Was elke put minstens drie keer met gedeïoniseerd water, waarbij alle resterende NaOH is verwijderd.
  6. Droog de E-plaat door er voorzichtig op een tissue te tikken, gevolgd door aan de lucht te drogen.
  7. Steriliseer de E-plaat onder UV-licht in een bioveiligheidskast gedurende minstens 1 uur of een UV-bestralingsapparaat.
    OPMERKING: Plaats de E-plaat zo dat de putten recht omhoog wijzen. UV-licht dringt niet door de bodems van plastic putjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle uitvoering van het protocol levert reproduceerbare, impedantie-gebaseerde uitlezingen op die de levensvatbaarheid van tumorcellen en cytotoxiciteit van CAR T-cellen over de tijd weerspiegelen. Celgroei en cytotoxiciteit werden beoordeeld met het commerciële RTCA-systeem. De gegevens werden uitgedrukt als genormaliseerde celindex (NCI), berekend door de BI op elk tijdstip te delen door de CI op een geselecteerd normalisatietijd. De normalisatietijd wordt direct vóór de toevoeging van effectorcellen ingesteld. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om CAR T-cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren over meerdere rondes van antigeenblootstelling met behulp van het xCELLigence RTCA-platform. Door longitudinale meting van de levensvatbaarheid van tumorcellen via impedantie mogelijk te maken, vangt deze benadering herhaalde cytotoxische reacties – aangeduid als seriemoord – in een labelvrij en continu formaat. Het protocol is ontworpen om te monitoren hoe de functie van T-cel effectoren in de loop ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK heeft honoraria ontvangen van Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS en GSK. SK is uitvinder van verschillende patenten op het gebied van immuno-oncologie. SK ontving licentiekosten van TCR2 Inc en Carina Biotech. SK ontving onderzoekssteun van TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH en Arcus Bioscience voor werk dat niet gerelateerd was aan het manuscript. Alle andere auteurs geven geen concurrerende belangen aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM en NTTN ontvingen subsidies van de Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). NTTN ontving aanvullende subsidies van de Friedrich-Baur-Stiftung en German Cancer Aid (AvantCAR.de). MPT wordt ondersteund door de Monika Kutzner Foundation en de European Research Council (MSCA Fellowship 101106951). SK wordt ondersteund door het internationale doctoraatsprogramma 'i-Target: immunotargeting of cancer' (gefinancierd door het Elite Network of Bavaria), het Beierse Kankeronderzoekscentrum (BZKF) (TANGO to S.K.), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, subsidienummer: KO5055-2-1 en KO5055/3-1), de Melanoma Research Alliance (subsidienummer 409510), het Marie Sklodowska-Curie Training Network for Optimizing Adoptive T-Cell Therapy of Cancer (gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Unie; subsidie 955575), Marie Sklodowska-Curie Opleidingsnetwerk voor het volgen en beheersen van therapeutische immuuncellen bij kanker (gefinancierd door het Horizon Programme van de EU, subsidie 101168810), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), German Cancer Aid (AvantCAR.de), de Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, Institutional Strategy LMUexcellent van LMU München (binnen het kader van het Duitse Excellentie-initiatief), de Go-Bio-Initiative, de m4-Award van het Beierse Ministerie van Economische Zaken, Bundesministerium für Bildung und Forschung, het EUROSTAR-Programm, European Research Council (Starting Grant 756017, PoC Grant 101100460 en CoG 101124203), door de SFB-TRR 338/1 2021-452881907, Fritz-Bender Stichting, Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, Hector Foundation, Beierse Onderzoeksstichting (BAYCELLATOR), de Monika-Kutzner Stichting, de Bruno en Helene Jöster Stichting (360° CAR), de Dr. Rurainski-Foundation en Brigitte en Dr. Konstanze Wegener Stichting

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Plate 96Agilent 300600910
RTCA software Pro (Basic) Agilent N/AVersie 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Multiple Plates)Agilent N/A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Impedantiegebaseerde AssayCAR TcellenReal Time CelanalyseT celuitputtingCytotoxiciteitsmetingEffector targetratioHergebruik van E platenCelindexkinetiek

Gerelateerde artikelen