Vertraagde en progressieve testikelbeschadiging na blootstelling bij ratten door fijne deeltjes (PM2,5)

Samenvatting

Blootstelling aan PM2.5 induceert vertraagde testikelbeschadiging in rattenmodellen door aanhoudende ontstekingsreacties, versterkte kiemcelapoptose, downregulatie van Connexin-43/Occludin en signalering die consistent is met activatie van de JNK-route, wat de langetermijnbedreiging voor de mannelijke voortplantingsgezondheid benadrukt.

Samenvatting

Fijne deeltjes (PM2.5) worden steeds vaker in verband gebracht met mannelijke voortplantingsstoornissen. Omdat het meeste onderzoek acuut gericht, vertraagd, aanhoudend of progressief is na blootstelling, blijft testikelschade – cruciaal voor langetermijnrisicobeoordeling – slecht begrepen. We hebben een tijdsgebonden rattenmodel opgesteld om te bepalen of de schade aanhoudt of verergert na blootstelling. Tweeënzeventig mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden gerandomiseerd in negen groepen (controle; voertuig na 24 uur, 1, 2 en 4 maanden; PM2,5 op dezelfde tijdstippen) en kreeg intranasale PM2,5 met 5 mg/kg/dag gedurende 7 dagen. We kwantificeerden spermakwaliteit en voortplantingsorganindices, onderzochten testiculaire histologie en ultrastructuur, maten serumtestosteron, FSH, LH en E2, profileerden inflammatoire cytokine-mRNA's (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ), beoordeelden kiemcelapoptose met TUNEL en evalueerden junctionale en stressgerelateerde eiwitten (Connexin-43, Occludin, JNK). Blootstelling aan PM2.5 leidde tot aanhoudende dalingen van de zaadconcentratie en -motiliteit, samen met verhoogde misvormingen en testiculaire en bijlni-atrofie die niet herstelden gedurende de 4 maanden na de expositie. Histologie toonde progressieve verdunning van het seminifere epitheel en ultrastructurele degeneratie. Ook endocriene verstoring was zichtbaar, met verlaagd testosteron en veranderde gonadotropinen. Mechanistisch hield PM2.5-blootstelling een verhoogde expressie van IL-1β en IL-6 in stand, bevorderde de apoptose van de kiemcellen en verlaagde Connexin-43 en Occludin, terwijl het patronen vertoonde die overeenkwamen met activatie van de JNK-route. Samen tonen deze bevindingen vertraagde en progressieve testiculaire toxiciteit aan na het einde van PM2.5-blootstelling en suggereren dat het behouden van de junctionale integriteit en het richten op JNK de langdurige voortplantingsschade kan beperken.

Inleiding

PM2.5, een complex mengsel van fijne deeltjes met een aerodynamische diameter van ≤2,5 μm, ontstaat uit industriële emissies, voertuiguitlaatgassen en biomassaverbranding, en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde milieuvervuiler¹. Epidemiologische studies koppelen PM2.5-blootstelling aan respiratoire en hart- en vaatziekten², evenals aan voortplantingssysteembeperkingen³. De impact op de mannelijke vruchtbaarheid is bijzonder zorgwekkend vanwege bewijs dat luchtvervuiling de spermakwaliteit kan verminderen⁴. Mannelijke factoren dragen wereldwijd bij aan meer dan de helft van de onvruchtbaarheidsgevallen, en meerdere studies melden significante dalingen in spermaparameters in de afgelopen decennia⁵. Recente wereldwijde analyses bevestigen verder wijdverspreide achteruitgang van de spermakwaliteit in meerdere regio's⁶. Hoewel factoren zoals roken, alcoholgebruik, straling en blootstelling aan chemicaliën als risico's zijn⁷, is PM2.5 naar voren gekomen als een extra voortplantingstoxine die zich richt op de testes⁸.

De testikels zijn zeer gevoelig voor omgevingsvergiftigingen vanwege hun unieke fysiologische structuur en continue zaadactiviteit. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat blootstelling aan PM2.5 teelbalschade kan veroorzaken via meerdere routes, zoals oxidatieve stress, ontstekingsreacties en verstoring van de bloed-testisbarrière⁹. Deze acute effecten worden gekenmerkt door verminderde spermakwaliteit, abnormale testiculaire histologie en hormonale disbalans¹⁰. De meeste studies richten zich echter op onmiddellijke schade, waardoor de langetermijn- of vertraagde effecten slecht worden gekarakteriseerd.

Huidige PM2.5-blootstellingsmodellen hebben inherente beperkingen: inademing van het hele lichaam bootst natuurlijke blootstelling na, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en mist dosisprecisie¹¹, terwijl intratracheale installatie dosiscontrole waarborgt maar invasief is en fysiologische deeltjesafzetting¹² niet repliceert. Ons tijdsopgeloste intranasale model vermijdt deze nadelen: de niet-invasieve levering sluit aan bij de patronen van bovenste respiratoire afzetting, maakt nauwkeurige dosiscontrole mogelijk en ondersteunt langdurige multi-time-point bemonstering om vertraagde schade vast te leggen, wat de capaciteit van acuut gerichte traditionele modellen overschrijdt.

Onze 5 mg/kg/dag PM2,5-dosis sluit aan bij subacute blootstellingsparadigma's van knaagdieren die bewezen reproductieve reacties oproepen, en via lichaamsoppervlakteconversie benaderen ze een menselijke equivalente dosis ~6 keer hoger dan de omgevingsniveaus-standaard voor het versnellen van langdurige toxiciteitsmanifestaties¹⁴. Soortoverwegingen gelden: hoewel ratten een geconserveerde testikelfysiologie delen met mensen, kan hun kortere spermatogene cyclus de verloop van de schade versnellen zoals waargenomen in onze tijdstippen¹⁵, en de intranasale levering verschilt van menselijke lagere luchtwegafzetting, hoewel systemische toxineverspreiding naar testikels is bevestigd.

De vertraagde effecten van blootstelling aan milieutoxines zijn cruciaal voor het beoordelen van langetermijnreproductieve risico's, omdat ze onomkeerbare schade kunnen onthullen die niet zichtbaar is in kortetermijnobservaties¹⁶. Sommige giftige stoffen kunnen bijvoorbeeld latente verwondingen aan de testikels veroorzaken, die zich geleidelijk manifesteren of verergeren in de loop van de tijd, zelfs nadat de blootstelling is gestopt, wat mogelijk leidt tot chronische voortplantingsstoornissen¹⁷. Gezien de alomtegenwoordigheid en persistentie van PM2.5 is^{het cruciaal om} te bepalen of de voortplantingstoxiciteit aanhoudt of verslechtert na blootstelling.

Aanhoudende ontsteking, oxidatieve stress en aangetaste herstelmechanismen zijn plausibele oorzaken van vertraagde effecten. Door PM2.5 geïnduceerde upregulatie van IL-1β, IL-6 en TNF-α kan chronische ontsteking in stand houden, spermatogenese verstoren en kiemcelapoptose¹⁹ bevorderen. Schade aan belangrijke junction-eiwitten, zoals Connexin-43 en Occludin, verstoort de bloed-testisbarrière en kan functioneel herstel^belemmeren. Activatie van de c-Jun N-terminale kinase (JNK) route, een mediator van stress en apoptotische signalering, is ook geïdentificeerd²¹.

Ondanks de groeiende erkenning van de voortplantingstoxiciteit van PM2.5, is er een aanzienlijke kenniskloof over de temporele dynamiek van testikelschade na het stoppen van de exposure. Specifiek blijft het onduidelijk hoe lang de testikelletsels aanhouden, of ze in de loop van de tijd verergeren en welke moleculaire routes deze vertraagde effecten aandrijven²². Het aanpakken van deze vragen is cruciaal voor het ontwikkelen van gerichte preventieve en therapeutische strategieën om de door PM2.5 veroorzaakte mannelijke voortplantingsschade te beperken.

Er blijven significante hiaten bestaan met betrekking tot de duur, progressie en mechanismen van PM2.5-geïnduceerde testikelbeschadiging na het stoppen van de blootstelling. Deze studie pakt deze hiaten aan door reproductieve eindpunten te beoordelen; histopathologie; hormoonprofielen—specifiek follikelstimulerend hormoon (FSH), luteïniserend hormoon (LH) en estradiol (E2); ontsteking; apoptose; en barrière-eiwitexpressie op meerdere tijdstippen na blootstelling. De bevindingen geven inzicht in de langetermijnreproductieve risico's van PM2.5 en informeren volksgezondheidsstrategieën ter bescherming van mannelijke vruchtbaarheid.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de institutionele voorschriften en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Fujian Health College (Projectgoedkeuringsnr.: DW2024-01).

Veiligheid en gevaarlijk afval
Giftige reagentia, waaronder formaline, osmiumtetroxide en chloroform, werden behandeld in een gecertificeerde dampkap terwijl ze passende persoonlijke beschermingsmiddelen droegen. Halogenerend organisch afval en osmiumhoudende oplossingen werden verzameld in aangewezen containers en volgens institutionele vereisten afgevoerd. Pentobarbitalnatrium werd geregistreerd als een gereguleerde stof en scherpe stoffen werden gedurende het onderzoek veilig behandeld.

PM2.5 materiaal en hantering
Voor dosering werd een PM2.5 standaard referentiemateriaal gebruikt. Volgens vastgestelde deeltjesvoorbereidingsprocedures werd droog poeder in steriele PBS bij de vereiste concentratie opgehangen en direct voor gebruik 10-15 minuten in een waterbad gesoniceerd, zonder tensideer. Werkende ophangingen werden elke dag vers voorbereid. De endotoxineniveaus werden geëvalueerd met een limulus amoebocyte lysaattest en waren niet detecteerbaar. Indien nodig werden polymyxin-B-controles toegevoegd om LPS-gedreven effecten uit te sluiten.

Constructie van diermodellen in vivo
Tweeënzeventig mannelijke Sprague-Dawley-ratten met SPF (2 maanden oud, 190 ± 10 g) werden onder standaardomstandigheden gehuisvest en gerandomiseerd in negen groepen (n = 8 per groep), bestaande uit een controlegroep, voertuiggroepen bemonsterd op 24 uur, 1, 2 en 4 maanden, en PM2,5-blootgestelde groepen op dezelfde tijdstippen. PM2.5 werd intranasaal toegediend met 5 mg∙^kg-1∙^dag-1 in 10-20 μL per naris onder lichte isoflurananesthesie, eenmaal daags gedurende 7 dagen. Na toediening werden de ratten 1-2 minuten in rugligging geplaatst om de inademing te vergemakkelijken. Dieren werden behouden tot euthanasie op de aangewezen tijdspunten na de blootstelling, en de lichaamsmassa werd geregistreerd voor de berekeningen van orgaancoëfficiënten. Eindpunten omvatten orgaancoëfficiënten, spermakwaliteit, histologie en ultrastructuur, serumvoortplantingshormonen en moleculaire assays.

Morfologie van voortplantingsorganen en beoordeling van de kwaliteit van zaadcellen
Testikels en bijlende epididymiden werden onder diepe pentobarbitale anesthesie ontleed, gedept en gewogen om orgaancoëfficiënten te berekenen. Sperma werd uit de cauda epididymis verzameld door te malen in een voorverwarmde buffer bij 37 °C. De concentratie werd bepaald met een hemocytometer. De motiliteit werd beoordeeld door ten minste 200 sperma te onderzoeken over vijf of meer niet-overlappende velden op voorverwarmde glaas. De morfologie werd geëvalueerd na fixatie, uitsmeren en kleuring met eosine-nigrosine of Diff-Quik, waarbij minstens 200 sperma per rat werden gescoord. Alle beoordelingen waren geblindeerd en technische replicaties werden gemiddeld om één waarde per dier te verkrijgen.

Histologische en ultrastructurele analyse van testikelweefsel
Testes werden vastgezet in 10% neutraal gepufferde formaline, verwerkt via gegradueerd ethanol en xyleen, ingebed in paraffine en op 5 μm gesneden voor HE-kleuring. Gekleurde secties werden geëvalueerd met systematische willekeurige steekproeven, waarbij uitsluitingen werden toegepast voor schuine sneden, artefacten of slechte fixatie. Tubulidiameters werden berekend op basis van orthogonale assen, en de epitheeldikte werd gemeten op gelijkmatig verdeelde punten. De analyses werden geblindeerd en minimaal 10 buisjes per rat werden geëvalueerd.

Voor TEM werden kleine weefselblokken gefixeerd in glutaraldehyde, post-fixeerd in osmiumtetroxide, gedehydrateerd, geïnfiltreerd met hars en gepolymeriseerd. Ultradunne secties werden gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en werden afgebeeld bij 60-120 kV onder consistente instellingen. QC omvatte de beoordeling van de integriteit van het membraan en de mitochondriale integriteit en het vermijden van extractie-artefacten.

Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA)
Bloed werd onder narcose binnen een vast ochtendvenster uit de abdominale aorta genomen om circadiane variatie te beheersen. Na stolling en centrifugatie werd het serum gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C. Testosteron, FSH, LH en E2 werden gekwantificeerd met behulp van een gevalideerd immunoassayplatform. De monsters werden dubbel uitgevoerd met de juiste controles en de precisie van de assay bleef volgens de specificaties van het platform. Hemolyseerde of lipemische monsters werden uitgesloten.

Real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)
Totaal RNA werd uit het testiculaire weefsel gewonnen met fenol-chloroform en gezuiverd door isopropanolprecipitatie en ethanolwas. De kwaliteit van RNA werd spectrofotometrisch geverifieerd. cDNA werd gesynthetiseerd en RT-qPCR werd uitgevoerd met kleurstofgebaseerde chemie onder standaard cyclische omstandigheden, gevolgd door smeltcurveanalyse. De expressieniveaus werden genormaliseerd tot GAPDH met behulp van de 2^{−ΔΔCq-methode} .

Western blot-analyse
Eiwitlysaten werden bereid in een RIPA-buffer met proteaseremmers, gekwantificeerd door een BCA-assay, en gedenatureerd in de laadbuffer. SDS-PAGE en PVDF-overdracht werden onder gecontroleerde omstandigheden uitgevoerd. De membranen werden geblokkeerd, geïncubeerd met primaire antilichamen voor Connexin-43, Occludin, JNK en GAPDH, gevolgd door HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Banden werden gedetecteerd door chemiluminescentie, en densitometrie omvatte achtergrondaftrekking, normalisatie naar GAPDH en schaalverdeling naar de controlegroep.

Statistische analyse
De gegevens werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc-test of Student's t-test werd waar passend gebruikt, met niet-parametrische gegevens geanalyseerd door de Mann-Whitney U-test . Een p-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd.

Voltooiing en schoonmaak
Al het gevaarlijke chemische afval werd gelogd en op de juiste manier afgevoerd. Ruwe data, waaronder instrumentuitvoer en analysebestanden, werden gearchiveerd met bijbehorende notities om traceerbaarheid te waarborgen.

Resultaten

Aanhoudende achteruitgang van de mannelijke voortplantingsfunctie bij ratten, gekenmerkt door verminderde zaadkwaliteit en verminderde voortplantingsorganontwikkeling door PM2.5-blootstelling

Om de impact van PM2.5 op mannelijke voortplantingsfunctie, spermakwaliteit, voortplantingsorgaancoëfficiënten en gerelateerde indicatoren te onderzoeken, werden onderzocht over negen groepen mannelijke ratten. Analyses werden uitgevoerd ten opzichte van het 24 uur post-exposure tijdspunt...

Discussie

Kortdurende PM2,5-blootstelling werd gevolgd door een progressuele, post-expositie achteruitgang van de mannelijke voortplantingsfunctie over 1-4 maanden. Deze bevindingen ondersteunen tijdsafhankelijke voortplantingstoxiciteit die aanhoudt nadat de dosering stopt en verlengen eerdere waarnemingen van PM2.5-geassocieerde voortplantingsstoornis²³.

Om de reproduceerbaarheid te verbeteren, hebben we vier elementen gestandaardiseerd. Ten ee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1% osmium tetroxide	TCI, China	O0308	Voor post-fixatie bij TEM-analyse van testiculaire weefsels
10% neutraal gebufferd formaline	Solarbio, China	PC0020	Voor het fixeren van testiculaire weefselmonsters in HE-kleuring
2,5% glutaaraldehyde	Solarbio, China	G1102	Voor het fixeren van testiculaire weefselmonsters in TEM-analyse
75% ethanol	Acros Organics, USA	61509-0040	Voor het zuiveren van geprecipiteerd RNA in RT-qPCR
Automatische chemiluminescentie-beeldvormer	Bio-Rad, USA	ChemiDoc	Gebruikt voor automatische beeldvorming van chemiluminescente signalen in Western blotting.
BCA-eiwitanalysekit	Solarbio, China	PC0020	Voor het bepalen van de totale eiwitconcentratie in Western blot-analyse
Blockingbuffer	Niet gespecificeerd	T7131A	Gebruikt in Western blot-analyse om niet-specifieke binding te elimineren
Chloroform	Acros Organics, USA	327270010	Gebruikt bij RNA-scheiding tijdens RT-qPCR
Connexin-43	Abcam, USA	ab11370	Detecteert de expressie en distributie van een belangrijk bloed-testisbarrière-eiwit om de integriteit van de barrière te helpen beoordelen
ECL-kit	Biosharp, China	BL520B	Voor het visualiseren van eiwitbanden in Western blot-analyse
ELISA-kits (voor testosteron, FSH, LH, E2)	Abcam, UK	ab108666; ab108702; ab108651; ab108667	Voor het detecteren van serum-reproductiehormonen
Eosine	Solarbio, China	G1002	Gebruikt in HE-kleuring van testiculaire weefsels
Epoxyhars	Solarbio, China	GP2001	Voor het insluiten van testiculaire weefselmonsters in TEM-analyse
GAPDH	Abcam, USA	ab128915	Evalueert de apoptose van testiculaire cellen geïnduceerd door PM2.5 en biedt een morfologische basis voor het bestuderen van de invloed ervan op testiculaire celapoptose
Hematoxylinen	Solarbio, China	G1077	Gebruikt in HE-kleuring van testiculaire weefsels
Beeldvormingssysteem	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Gebruikt voor het beeldvormen van monsters onder een microscoop.
Isopropanol	Acros Organics, USA	AC447080025	Gebruikt bij RNA-precipitatie tijdens RT-qPCR
JNK	Abcam, USA	ab124956	Onderzoekt het moleculaire mechanisme van testiculaire schade veroorzaakt door PM2.5 en identificeert de celtypen waarin het wordt geactiveerd
Microplaatlezer	MOLECULAR DEVICES, USA	SpectraMax iD3	Gebruikt voor het detecteren van signalen in microplates (bijv. absorptie, fluorescentie).
Occludin	Abcam, USA	ab31721	Begrijpt de schade aan de bloed-testisbarrière en onderzoekt de interacties tussen relevante eiwitten
Optische microscoop	Chongqing Opto-Electronic Instrument, China	BDS200	Gebruikt voor algemene optische microscopische observatie.
Pathologische microtoom	Shanghai Kaiyu Instrument, China	RM2016	Gebruikt voor het snijden van secties van pathologische weefsels.
Pentobarbitalnatrium	Solarbio, China	G1102	Gebruikt voor intraperitoneaal injecteren bij ratten vóór bloedafname
PM2.5 standaard referentiemateriaal	National Institute of Metrology, China	GBW13643	Voor PM2.5-blootstelling in experimentele groep
Polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan	Thermo Fisher, USA	88585	Gebruikt in Western blot-analyse voor eiwitoverdracht
PrimeScript RT-reagenskit	TAKARA, Japan	RR037Q	Voor cDNA-synthese in RT-qPCR
Real-time PCR-systeem	Roche, Zwitserland	LightCycler 480	Gebruikt voor real-time polymerasekettingreactie voor genexpressieanalyse.
RIPA-lysebuffer	TAKARA, Japan	RR9161	Voor het extraheren van eiwitten in Western blot-analyse
Scheider	Thermo, USA	MAXQ-4000	Gebruikt voor het schudden van monsters in experimenten.
SPSS	IBM, USA	28	Voor data-analyse
Steriele zoutoplossing	Solarbio, China	S8160	Gebruikt in de voertuiggegroepeerde behandeling
TB Green Premix Ex Taq II-kit	TAKARA, Japan	RR820S	Gebruikt in RT-qPCR
Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)	Hitachi, Japan	HT7800/HT7700	Gebruikt voor ultrastructurele observatie op nanoschaal.
Trizol-reagens	Ambion, China	15596018	Voor het extraheren van totaal RNA in RT-qPCR
Ultramicrotoom	Leica, Duitsland	Leica UC7	Gebruikt voor het snijden van ultradunne secties voor TEM.
Universeel eiwitoverdrachtssysteem / Eiwitoverdrachtsblotmachine	Bio-Rad, USA	Trans-Blot Turbo	Gebruikt voor eiwitoverdracht in Western blotting.
Staande optische microscoop	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100	Gebruikt voor staande optische microscopische observatie.
Uranylacetaat	Merck, Duitsland	201030	Voor het kleuren van ultradunne secties in TEM-analyse van testiculaire weefsels