Procedures voor de identificatie van SARS-CoV-2 ingangsremmers als potentiële antivirale middelen met MLV-gebaseerde pseudovirussen

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het genereren van SARS-CoV-2 pseudotype-deeltjes met behulp van een luciferase-reportersysteem en het gebruik ervan om intreeremmers te identificeren. Deze protocollen worden aangetoond met behulp van twee verschillende entry-inhibitors: een recombinant humaan ACE2-Fc fusie-eiwit en de kleinmolecuulverbinding arbidool.

Samenvatting

Het SARS-CoV-2-virus is een opkomend, zoönotisch pathogeen dat sinds zijn ontstaan in 2019 wereldwijd een enorme last van ziekten en sterfte heeft veroorzaakt. Veilige en toegankelijke platforms om virale toegang en potentiële antivirale verbindingen te evalueren, blijven essentieel voor voortdurende geneesmiddelenontdekking tegen opkomende varianten. Dit artikel beschrijft een sterk geoptimaliseerd protocol voor het genereren van op het muisleukemievirus (MLV) gebaseerde pseudogetypeerde deeltjes die het SARS-CoV-2 spike-eiwit expressieven en een luciferase-reportergen dragen, waardoor de studie van virale intrede onder biosafety niveau 2 omstandigheden mogelijk is. De beschreven methoden beschrijven het gebruik van geoptimaliseerde cellijnen, hoge transfectie-efficiëntie met kosteneffectieve reagentia, productie van zeer effectieve pseudovirussen en titratie van de infectiviteit om de minimale virale input voor screeningsassays te bepalen. Representatieve resultaten tonen robuuste luciferase-activiteit aan in geïnfecteerde cellen vergeleken met niet-geïnfecteerde controles, terwijl controle-spike-loze en VSV-G-pseudovirussen de assayspecificiteit bevestigen. Daarnaast ondersteunt het systeem compound screening door remmende effecten bij virale intrede te kwantificeren en cytotoxiciteit te beoordelen met behulp van een MTT-levensvatbaarheidstest. Al met al biedt dit reproduceerbare en schaalbare protocol een betrouwbaar platform voor middelmatige tot hoge doorvoerscreening van nieuwe virale instapremmers, wat bijdraagt aan de identificatie van antivirale kandidaten en het bevorderen van onderzoek naar SARS-CoV-2 intreemechanismen.

Inleiding

Het ontstaan van het Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) eind 2019 leidde tot een wereldwijde pandemie die wereldwijd miljoenen doden veroorzaakte en een bedreiging vormt door nieuwe varianten met verhoogde smitbaarheid en immuunontsnappingspotentieel¹. Als een omhuld RNA-virus uit de familie van Coronaviridae gebruikt SARS-CoV-2 zijn trimeric spike (S) glycoproteïne om de toegang van gastheercellen te bemiddelen door te binden aan de angiotensine converterende enzym 2 (ACE2) receptor en proteolytische activatie te ondergaan door TMPRSS2 en andere gastheerproteasen ^2,3. Hoewel er verschillende behandelopties zijn ontwikkeld om COVID-19-symptomen te beheersen, onderstreept de voortdurende evolutie en snelle ontwikkeling van virale varianten de dringende noodzaak van veilige en schaalbare systemen om virale toegang te bestuderen en nieuwe antivirale verbindingen te evalueren die gericht zijn op deze vroege fase in infectie⁴.

Het SARS-CoV-2-virus blijft in sommige gebieden geclassificeerd als biosafety level 3 agent⁵ vanwege het hoge transmissiepotentieel. Daarom vereist elke replicatieve laboratoriumtaak een hoog-containment BSL-3-faciliteit, waardoor de meeste laboratoria in het veld wetenschappelijk onderzoek met dit virus kunnen doen, belemmeren. Pseudotype-virusgebaseerde systemen, ook wel pseudovirussen (PV's) genoemd, bieden een praktisch alternatief dat virale instapstudies mogelijk maakt in biosafety level 2 (BSL-2) laboratoria, waardoor de toegankelijkheid voor wereldwijde onderzoeksinspanningen wordt^{vergroot 6}. De pseudogetypeerde deeltjes die het SARS-CoV-2 spike-eiwit bevatten, zijn niet-replicerend, waardoor ze een veilige surrogaat zijn om virusingang te evalueren en te screenen op kleine-molecuulremmers⁷. Deze deeltjes kunnen worden ontworpen om een luciferase- of fluorescerende reportergen te dragen, waardoor een snelle, kwantitatieve detectie van infectie mogelijk is door het rapporteringssignaal in geïnfecteerde cellen te meten. Systemen gebaseerd op muisleukemievirus (MLV) of lentivirus-ruggengraat zijn veel gebruikt voor het bestuderen van de binnenkomst van SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, ebolavirus, onder andere 8,9,10,11.

In deze protocollen beschrijven we de generatie van MLV-gebaseerde PV's met behulp van een drie-plasmidesysteem, gebaseerd op het werk van Millet en Whittaker⁸. De gebruikte plasmiden omvatten een verpakkingsplasmide die codeert voor de MLV-kerngenen gag-pol (pCMV-MLVgagpol), een transfervector die codeert voor het reportergen luciferase (pTG-Luc), en een plasmide dat het SARS-CoV-2 spike glycoproteïne expressie is, overeenkomend met de oorspronkelijke Wuhan-Hu-1 variant. Daarnaast worden pseudovirussen ook gegenereerd met behulp van het G-glycoproteïne van het vesiculaire stomatitisvirus (VSV-G), die later worden gebruikt als tegenscreening van potentiële treffers. Pseudovirussen worden geproduceerd in cellen afkomstig van HEK293 en gebruikt om zeer gevoelige cellen te infecteren, waarbij hACE2 en TMPRSS2 stabiel tot expressie komen. Transfectie-efficiëntie wordt eerst geëvalueerd met behulp van een groen fluorescerend eiwit (GFP)-expressief plasmide. Vervolgens worden PV's gegenereerd door deze drie plasmiden co-transfecteren, gevolgd door de titratie van de resulterende virussen. Met de juiste hoeveelheid PV's wordt een assay uitgevoerd in 96-wellplaten om te screenen op verbindingen die de binnenkomst van de virussen kunnen remmen. Dit protocol maakt gebruik van vertakte polyethylelijnimine (PEI) als kosteneffectief transfectiereagentia, waardoor de implementatie van de procedures eenvoudiger wordt.

Protocol

1. Hoogefficiënte transfectie van HEK293T-afgeleide cellen met behulp van vertakte polyethyleeneimine (PEI)

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met behulp van de standaard aseptische techniek en BSL-2 procedures. Gebruik HEK293T-afgeleide cellen voor transfectie en generatie van pseudogetypede virussen. Bij deze methode worden cellen getransfecteerd in celcultuurbehandelde 6 putplaten. De PEI-voorraadoplossing wordt voorbereid zoals eerder beschreven door Yang en collega's (2017)¹². Voordat men de drievoudige transfectie uitvoert om het pseudovirus te genereren, is het raadzaam om de beste PEI-plasmide-DNA-verhouding te optimaliseren om een hoge transfectie-efficiëntie (meer dan 70-80%) te garanderen. Deze optimalisatie moet worden uitgevoerd door transfectie van een plasmide dat groen fluorescerend eiwit (GFP) expressief maakt en vervolgens het aandeel fluorescentiecellen te controleren met een fluorescentiemicroscoop. Voor deze optimalisatie houd je plasmide-DNA constant op 2,5 μg per put en test je verschillende hoeveelheden PEI, in het bereik van 1-20 μL. Hier zijn de beste omstandigheden voor deze loten cellen en PEI, bestaande uit 5 μL PEI-voorraadoplossing (1 mg/mL) en 2,5 μg GFP-expressief plasmide per put in een 6-well plaat.

1. Zaad 7,5 x 10 5 HEK293-afgeleide cellen per put in een 6-put weefselkweekplaat, in een totaalvolume van 2 mL per put van compleet medium (DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd fotaal rundvleesserum (FBS), 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), 100 IU/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine) 24 uur voor transfectie.
   OPMERKING: Bij het zaaien van cellen moet u voorkomen dat de weefselkweekplaat in cirkelvormige bewegingen wordt verplaatst, omdat dit celaggregatie in het centrum van putten kan veroorzaken, wat resulteert in onregelmatige celverdeling en daardoor een lagere transfectie-efficiëntie. Eén plaat met zes putten is voldoende voor één experiment, waaronder één put als celcontrole (niet-transfect), en de rest van de plaat voor het testen van verschillende verhoudingen PEI-plasmide-DNA.
2. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende de nacht. Zorg er de volgende dag voor dat de cellen ongeveer 50-60% samenvloeien.
3. Op de dag van transfectie bereid je de PEI-plasmide-DNA-complexen voor in steriele, 1,5 mL microcentrifugebuizen.
   1. Bereid voor elke put een PEI-oplossingsbuis voor met 5 μL PEI-voorraad (1 mg/mL) in 50 μL gereduced serummedium, en één DNA-oplossingsbuis met 2,5 μg GFP-expressieve plasmide, in 50 μL van hetzelfde medium.
   2. Als meerdere putten getransfecteerd moeten worden, kunnen oplossingen dienovereenkomstig worden opgeschaald. Meng elke buis kort door vortex en draai 5 seconden naar beneden. Incubeer buizen op kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten.
4. Verwijder tijdens deze incubatie voorzichtig het medium uit elke put van de 6-put plaat, zodat de celmonolaag niet wordt verstoord. Vervang voorzichtig door 1 mL/put van volledig transfectiemedium (DMEM-T, hetzelfde als DMEM-C, maar zonder antibiotica).
5. Bereid het transfectiecomplex voor. Na de 10 minuten incubatie voeg je de 50 μl van de DNA-oplossingsbuis toe aan de PEI-oplossingsbuis. Meng snel door zes keer op en neer te pipetteren en precies 3 minuten in RT te incuberen. Voeg direct complexe druppels toe aan cellen in elke bijbehorende put.
6. Sluit de randen van de plaat af met parafilm en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 30 minuten bij RT, zonder rem, met een schwenkrotor en plaatbak.
7. Na centrifugatie verwijder je de parafilm voorzichtig en incubeer je de plaat bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 3 uur.
8. Na de incubatie verwijder je voorzichtig het transfectiemedium uit elke put en vervang je het langzaam door 2 mL voorverwarmde DMEM-C per put.
9. Incubeer getransfecteerde cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
10. Beoordeel de transfectie-efficiëntie door GFP-expressie met fluorescentiemicroscopie. De frequentie van fluorescerende cellen zou hoger moeten zijn dan 70-80% (Figuur 1). Dit is cruciaal voor de efficiëntie van de volgende methode in sectie 2.

2. Generatie van SARS-CoV-2 spike- en VSV-G pseudogetypede pseudovirale deeltjes

OPMERKING: Deze methode gebruikt dezelfde procedure als sectie 1, behalve dat in plaats van het GFP-plasmide, cellen worden geco-transfecteerd met de drie plasmiden die nodig zijn om pseudotype-virussen te genereren, waarbij de optimale transfectiecondities worden gebruikt om een hoge transfectie-efficiëntie te garanderen. Het protocol gebruikt ook HEK293T-afgeleide cellen in platen met 6 putten, voldoende voor de volgende drie vereiste voorwaarden: a) niet-getransfecteerde cellen (één put), b) cellen die alleen met het MLV-verpakkingsplasmide en de luciferase-reportertransfervector (één put; spike-loze pseudovirussen) worden getransfecteerd, en c) cellen die met deze twee plasmiden en het spike-expressieve plasmide worden getransfecteerd om SARS-CoV-2 pseudotype-virussen te genereren (vier wellen). Het hier gebruikte spike-expressing plasmide codeert voor de spike van de SARS-CoV-2, Wuhan-stam en bevat sequentiemodificaties om een efficiënte presentatie van het eiwit in PV's mogelijk te maken. Het spike-loze pseudovirus zal later tijdens infecties als controle nodig zijn, om de spike-afhankelijke toegang in permissieve cellen te valideren. Evenzo worden VSV-G-PV's gegenereerd met hetzelfde experimentele ontwerp om later te worden gebruikt als tegenscreening van potentiële remmende verbindingen. Als een groter volume pseudovirus nodig is, kan het protocol worden opgeschaald tot twee platen met 6 putten, wat ook praktisch kan zijn voor de centrifugatiestap van de plaat.

1. De dag voor transfectie zaai HEK293T-afgeleide cellen in twee platen met 6 putten, zoals beschreven in sectie 1. Gebruik één plaat voor het genereren van spike-PV's en de andere voor de VSV-G-PV's.
2. Op de dag van transfectie bereid je de transfectiemixen voor zoals weergegeven in Tabel 1, volgend stap 1.3.
   OPMERKING: PEI-oplossing wordt voorbereid zoals eerder gemeld¹². Plasmiden pCMV-MLVgagpol en pTG-Luc werden verkregen uit Millet en Whittaker⁸. Plasmide pVSV-G werd verkregen van Gee et al 2020¹³. Alle plasmiden moeten van tevoren worden voorbereid als hoogwaardige preps, vrij van endotoxines. Het wordt aanbevolen om commercieel verkrijgbare maxiprep-kits te gebruiken, met als laatste stap steriele filtratie via een laagbindende 0,2 μm spuitfilter.
3. Meng elke buis zoals beschreven in sectie 1 en incubeer 10 minuten bij RT.
4. Tijdens deze incubatie verwijder je het medium zorgvuldig uit elke put van de 6-putplaten, zodat de celmonolaag niet wordt verstoord. Vervang langzaam met 1 ml voorverwarmd DMEM-T medium per put, zodat het medium langs de wand van de put loopt en niet direct op de cellen.
5. Bereid transfectiecomplexen voor zoals beschreven in sectie 1 en transfect cellen met behulp van het eerder beschreven protocol.
6. Na de 48-uur incubatie na transfectie verzamel je de supernatanten, breng je ze over in 50 mL steriele conische centrifugebuizen en centrifugeer je ze op 290 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Verzamel het celvrije supernatant en filter het met een polyvinylidienfluoride (PVDF), steriel 0,45 μm topflesfilter. Bereid aliquots van 1 mL voor en bewaar ze bij -80 °C.
   OPMERKING: Pseudotype-deeltjes zijn stabiel bij -80 °C gedurende enkele maanden. Vermijd herhaalde vries-dooicycli om de infectie te behouden.

	Voor SARS-CoV-2 spike-PV's (per put)	Voor VSV-G-PV's (per put)	Voor spike-loze PV's (per put)
PEI-oplossing:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Gereduzeerd serummedium	45 μL	45 μL	45 μL
Plasmide-DNA-oplossing:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
pUNO1-spike	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Gereduzeerd serummedium	tot 50 μL	tot 50 μL	Tot 50 μL

Tabel 1: Voorbereiding van transfectiemixen voor de generatie van PV's.

3. Titratie van SARS-CoV-2 en VSV-G pseudotypede deeltjes

OPMERKING: Deze stap is essentieel om te bevestigen dat de geproduceerde pseudogetypeerde deeltjes infectieus zijn en om het minimaal effectieve volume te bepalen dat vereist is voor downstream-toepassingen zoals stofscreening. De titratie moet voor elke nieuwe batch pseudovirus worden uitgevoerd. Hiervoor worden cellen die zeer vatbaar zijn voor infectie met SARS-CoV-2 (HSI-cellen) geïnfecteerd met afnemende hoeveelheden van de pseudotype-virussen. De binnenkomst van de pseudovirussen, gemedieerd door de spike-mens ACE2-interactie, of door VSV-G met andere cellulaire receptoren, wordt 72 uur later gemonitord door de detectie van de luciferaseactiviteit in een luminescentietest.

1. De dag voor de transductie zaad je 2,5 x 10 HSI-cellen per put in een 96-put weefselkweekplaat, in 50 μL volledig medium (DMEM-C). Bereid drie putten voor voor elke hoeveelheid pseudovirus om te testen, en neem putten op voor infectie, ook met spike-loze pseudovirussen, en voor niet-geïnfecteerde cellen. Incubeer de plaat een nacht op 37 °C met 5% CO₂.
2. Op de dag van de transductie ontdooi je één aliquot van elke pseudovirusbatch om op ijs te testen en voorzichtig te mengen door inversie. Voeg ook één aliquot van de spike-loze controle op. Voeg direct aan elke put meerdere hoeveelheden van de pseudoviruspreparaat toe (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 en 0,8 μL). Stel de volumes van alle putten aan op 150 μL met DMEM-C.
3. Sluit de plaat af met parafilm en centrifugeer op 2.500 × g gedurende 45 minuten bij RT, zonder rem.
4. Verwijder de parafilmafdichting en incubeer de plaat 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
5. Na de incubatie bereid je de luciferase-assay voor volgens de instructies van de fabrikant. Ontdooi luciferase-substraat (opgeslagen bij -80 °C) en 5x luciferase-assay lysisbuffer (opgeslagen bij -20 °C) en evenwichtig bij RT (10-15 min).
6. Verdun de luciferase-assay lysisbuffer tot 1x met steriel water. Bereid minstens 3 ml voor.
7. Aspireer langzaam en voorzichtig het supernatant van elke put met een multikanaals pipet.
8. Voeg 30 μL 1x lysisbuffer toe aan elke put met behulp van een multikanaals pipet. Plaats de plaat 10 minuten in een plaatschudder bij 150 rpm, bij RT. Controleer de volledige lysatie onder een omgekeerde microscoop (alle cellen moeten gelyseerd zijn en niet te onderscheiden bij visueel onderzoek).
   OPMERKING: Bereid de microplaatlezer van tevoren voor om luminescentiedetectie direct na toevoeging van het substraat uit te voeren om consistentie te waarborgen en signaalverval te voorkomen.
9. Breng de lysaten over op een ondoorzichtige, witte plaat met 96 putjes.
10. Voeg 50 μL luciferasesubstraat toe aan elke put en meng kort door de plaat in een cirkelvormige beweging te bewegen. Plaats de plaat in de luminometer en meet de luminescentie.
11. Analyseer de verkregen gegevens.
    1. Controleer of regelaars de verwachte luminescentiewaarden geven. Zorg ervoor dat de niet-geïnfecteerde cellen zeer lage achtergrondluminescentiewaarden geven.
       OPMERKING: Cellen die geïnfecteerd zijn met spike-loos pseudovirus moeten waarden geven op het niveau van niet-geïnfecteerde cellen, en cellen die geïnfecteerd zijn met afnemende hoeveelheden spike-presenterend pseudovirus moeten hoge, dosisafhankelijke luminescentiewaarden vertonen (Figuur 2). De luminescentiewaarden die door de VSV-G-PV's worden gegenereerd, zijn meestal veel hoger dan die van spike-PV's, ongeveer één of twee ordes van grootte.
    2. Voor volgende screenings selecteer je de hoeveelheid pseudovirus die een signaal genereert dat minstens honderd tot duizend keer zo groot is als dat van de niet-geïnfecteerde cellen.

4. Screening van verbindingen voor pseudovirale intree-inhibitie met behulp van spike-PV's

1. Zaad 2,5 x 10⁴ HSI-cellen per put in 50 μL volledig medium (DMEM-C) in een 96-well-plaat, zoals beschreven in sectie 3. Incubeer 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂.
   1. Beschouw een plaatontwerp dat kolommen 1 tot 11 bevat voor verbindingen plus pseudovirus, en kolom 12 voor controles. In kolom 12 wijst je vier putten toe voor virusbestrijding (alleen pseudovirus) en vier putten voor niet-geïnfecteerde, niet-behandelde cellen.
2. De volgende dag bereid je seriële verdunningen (1:3) voor van te testen verbindingen, beginnend bij 50 μM (eindconcentraties tijdens infecties: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 en 0,06 μM), in DMEM-C met 0,5% DMSO.
   1. Bereid voor gemak verdunningen voor in een aparte 96-put "verdunningsplaat", waar seriële verdunningen eerst worden uitgevoerd en vervolgens (50 μL) worden overgebracht naar de plaat met de cellen.
   2. Als het aantal verbindingen zeer groot is, in de orde van honderden of meer, verminder dan deze eerste verdunningsreeks tot ongeveer 4 punten, met één put per verdunningspunt, en overweeg een voorscreening. Vervolgens test je de potentiële treffers opnieuw met 7-punts seriële verdunningen, 1:3, met drie replica's, beginnend bij dezelfde concentratie van 50 μM.
3. Zodra de verdunning van verbindingen klaar is, aspireert u voorzichtig het medium van cellen met een multikanaals pipet en voegt u 50 μL verbindingsverdunning toe aan de overeenkomstige putten. Incubeer 1 uur bij 37 °C, 5% CO₂. Voor de bediening in kolom 12 voeg je alleen DMEM-C toe.
4. Zonder de verbindingen te verwijderen, voeg aan elke put de vooraf bepaalde hoeveelheid pseudotyped SARS-CoV-2 pseudovirus toe, in een volume van 50 μL volledig medium, met verbindingen in dezelfde concentraties. Sluit de platen af met parafilm.
5. Centrifugeer de plaat op 2.500 × g gedurende 45 minuten bij RT zonder rem, verwijder daarna parafilm en incubeer bij 37 °C, 5%_CO2 gedurende 72 uur.
6. Ga door met luciferase-gebaseerde infectiekwantificatie zoals beschreven in sectie 3.
7. Voer data-analyse uit.
   1. Exporteer luminescentiewaarden naar een spreadsheet om de gegevens te formatteren voor latere import in data-analyse- en grafieksoftware.
   2. Bereid staafdiagrammen voor die het gemiddelde van elk concentratiepunt weergeven, inclusief de standaardfout van de gemiddelde staven. Plot ook de waarden die zijn verkregen uit positieve (PV's alleen) en negatieve controles (niet-geïnfecteerde cellen).
      OPMERKING: De resultaten van de test worden als geldig beschouwd als 1) niet-geïnfecteerde cellen zeer lage waarden vertonen, 2) PVs-controles hoge waarden tonen, 3) positieve controle van inhibitie (d.w.z. arbidol of hACE2-Fc) remming van infectie vertoont, op een dosisafhankelijke manier (Figuur 3A, B).
   3. Observeer vervolgens de waarden die door onbekende verbindingen worden geproduceerd om te beoordelen of er remming is en of er een dosisafhankelijk effect is. Zo ja, onderwerp deze verbindingen dan aan verdere bevestigende analyses.
      OPMERKING: Voor verdere bevestiging van mogelijke treffers, volg de volgende stappen. Test eerst de potentieel getroffen verbindingen opnieuw zoals voorgesteld in stap 4.2. Als het dosisresponseffect wordt bevestigd, voer dan een counterscreening uit met dezelfde verdunningsreeks maar met de VSV-G-PV's. Deze test is belangrijk om te controleren of de rem van de ingang specifiek is voor de spike-ACE2-interactie, en niet door interferentie in een andere stap later tijdens de productie van de luciferase in de geïnfecteerde cellen (Figuur 3A, B). Hier zou de positieve verbinding geen remmende activiteit tegen de VSV-G-PV's moeten vertonen. Als dit het geval is, moet dezelfde reeks concentraties worden getest op cytotoxiciteit met behulp van een cellevensvatbaarheidstest (MTT-assay, weergegeven in sectie 5). Samenvattend zou een potentiële trefferverbinding remming van SARS-CoV-2-spike-PV's moeten vertonen, geen of minder inhibitie van VSV-G-PV's, en geen of in ieder geval veel zwakkere remming van de levensvatbaarheid van de cellen. Door een dosis-responscurve aan te passen met behulp van de luminescentiegegevens, kan de half-maximale inhibitieconcentratie (IC₅₀) voor de inhibitie van de PV's worden schat, en een half-maximale cytotoxische concentratie (CC₅₀) uit de levensvatbaarheidsassay. De verhouding CC₅₀ / IC₅₀ wordt gebruikt om de selectiviteitsindex (SI) te berekenen, wat een belangrijke indicator is van het potentiële nut van de positieve verbinding. Voor de analyse van de dosis-responscurves en de schatting van de IC₅₀ en CC₅₀ zijn zeer gedetailleerde procedures beschreven:¹⁴.

5. MTT-gebaseerde cellevensvatbaarheidstest

1. Zaad 2,5 x 10⁴ HSI-cellen per put in 50 μL DMEM-C in een 96-wellplaat. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C, 5% CO₂. Zorg ervoor dat de cellen de volgende dag ongeveer 50% confluent zijn. Bereid voldoende putten voor, waarbij alle verschillende concentraties van de te evalueren verbinding, onbehandelde cellen en blanco putten die alleen medium in drievoud bevatten, worden meegenomen. Test de potentiële getroffen verbindingen op dezelfde concentraties als geëvalueerd in de PV-ingangsinhibitietest.
2. Na de incubatie wordt het medium zorgvuldig verwijderd en vervangen door 100 μL volledig medium met verschillende concentraties van de verbinding om te evalueren, in 0,5% DMSO.
3. Centrifugeer de plaat op 2.500 × g gedurende 45 minuten bij RT zonder rem en incubeer 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂. Deze stap is opgenomen om de cellen precies te behandelen zoals in de vorige sectie, behalve het toevoegen van de PV's.
4. Bereid een 0,5 mg/mL MTT-oplossing met DMEM. Steriliseer door door 0,2 μm te filteren en houd het in het donker.
   OPMERKING: 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT) is lichtgevoelig. Het moet bevroren blijven, in het donker.
5. Verwijder het medium voorzichtig uit elke put en vervang het door 100 μL MTT-oplossing. Incubeer 2 uur bij 37 °C, 5%_CO2.
6. Tijdens deze incubatie bereid je een oplosoplossing met 40 mM HCl in isopropylalcohol.
7. Verwijder de MTT-oplossing voorzichtig met een multikanaals pipet, zonder de formazankristallen onderin elke put te verstoren.
8. Voeg 100 μL van de oplosoplossing toe aan elke put. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en leg hem op een plaatschudder op 150 rpm gedurende 15 minuten.
9. Recordabsorptie bij 570 nm en 630 nm.
10. Voer data-analyse uit.
    1. Met behulp van de ruwe waarden van optische dichtheid trek je de waarden die bij 630 nm worden verkregen af van die bij 570 nm voor elke put. Vervolgens wordt de gecorrigeerde waarden van de onbehandelde celputten gemiddeld. Beschouw deze onbehandelde cellen als 100% levensvatbaar.
    2. Normaliseer vervolgens de waarden van behandelde cellen ten opzichte van de bronnen van de onbehandelde cellen, met behulp van de formule:
       Levensvatbaarheid (%) =
11. Plot levensvatbaarheidspercentages als balken die het gemiddelde van replicaties ±± standaardfout van het gemiddelde weergeven. Voer verdere statistische analyses uit om groepen te vergelijken met procedures die zijn geïmplementeerd in een data-analyse- en grafieksoftware, waarbij levensvatbaarheid bij verschillende concentraties wordt vergeleken met de controle van onbehandelde cellen.
12. Vergelijk de gemiddelden van elk concentratiepunt met die van de met DMSO alleen behandelde cellen met niet-parametrische Kruskal-Wallis met Dunn na de test (verschillen worden als significant beschouwd bij p-waarden < 0,05). Voor het uitzetten van een dosis-responscurve en het schatten van de CC₅₀ uit OD-waarden, controleer de procedure die elderwe¹⁴ heeft gerapporteerd.

Resultaten

Verschillende transfectiemethoden zijn gerapporteerd die PV's genereren, waaronder calciumfosfaat¹⁵, lipide-gebaseerde methoden¹⁶ en PEI, zowel lineair als vertakt. Dit artikel toont aan dat transfectie van HEK293T-afgeleide cellen met vertakte PEI een hoogefficiënte transfectie mogelijk maakt (Figuur 1), meestal vergelijkbaar met transfectiemethoden met commercieel verkrijgbare lipide-gebaseerde transfectiemid...

Discussie

Deze veelzijdigheid van het MLV-systeem voor het genereren van pseudotypen voor andere virussen is gerapporteerd door andere belangrijke virussen, zoals ebolavirus¹⁸, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, La Crosse-virus²⁰, Hantavirus²⁰, Vishna-virus²¹, arenavirus²², influenzavirus²³ en anderen. Deze pseudotypen z...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 µm Low protein-binding syringe filters	Thermo Scientific	720-1320	Syringe Filters (0.2 μm,13 mm, PES, steriele)
0.25% Trypsin-EDTA 1X solution	Gibco	25200-056	Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red
0.45 µm PVDF Bottle-Top Filter Units	Avantor	514-1045	Bottle-Top Vacuum Filtration Systems (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 µm)
1.5 mL Sterile Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30123611	Safe-Lock Tubes
100 X Penicillin Streptomycin solution	Corning	30-002-CI	Penicillin-Streptomycin Solution, 100x
5 X Luciferase assay lysis buffer	Promega	E2650	onderdeel van het Promega Bright-Glo Luciferase Assay System
50 mL Sterile Conical Tubes	Corning	352070	50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
6-well Tissue Culture Plates	Thermo Scientific	140675	Cell-Culture Treated Multidishes
96-well Tissue Culture Plates	Thermo Scientific	168055	Nunc™ MicroWell™ 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate
Arbidol hydrochloride	Sigma-Aldrich	SML0860
Branched polyethylenimine, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Confocal laser microscope (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) With: High Glucose, L-glutamine, Phenol Red, Sodium Pyruvate)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Heat-inactivated (56°C, 30 min)
HEK293T-derived cells (Lenti-X 293T Cell Line)	Takara Bio	632180	Highly transfectable subclone van HEK293 cellijn en ondersteunt hoge niveaus van virale eiwitexpressie
HEPES Buffer	Gibco	15630-080
Highly susceptible cells for infection (293T-ACE2.TMPRSS2 (mCherry) Cell Line)	BEI Resources	NR-55293	HEK293T cellijn gemodificeerd om stabiel ACE2 en TMPRSS2 te produceren
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Inverted phase contrast microscope	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Luciferase substrate	Promega	E2650	onderdeel van het Bright-Glo Luciferase Assay System
Microplate reader with luminescence detection	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]	Sigma-Aldrich	M2128
Opaque White 96-well Plates	Corning	3917	96-well Solid White Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates
Parafilm	Bemis	PM999
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP was een gift van Doug Golenbock (Addgene plasmid # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol plasmid	-	-	Vriendelijk gedoneerd door Dr. Gary Whittaker
Phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Phosphate-Buffered Saline, 1X zonder calcium en magnesium
Promega PureYield Plasmid Maxiprep System	Promega	A2393
pTG-Luc plasmid	-	-	Vriendelijk gedoneerd door Dr. Gary Whittaker
pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan) plasmid	Invivogen	p1-spike
pVSV-G plasmid	Addgene	138479	pVSV-G was een gift van Akitsu Hotta (Addgene plasmid # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Recombinant Human ACE2-Fc fusion protein	Invivogen	fc-hace2
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Opti-MEM Reduced Serum Medium