Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

258 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

10 april 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Samenvatting

Microglia, de residente macrofagen van het centrale zenuwstelsel, veranderen hun metabole programma's dynamisch als reactie op fysiologische en pathologische signalen. Het begrijpen van deze metabole verschuivingen is cruciaal om hun rol in ontstekingen te verduidelijken. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het glycolytische profiel van primaire microglia die zijn geïsoleerd uit neonatale muishersencortexen met behulp van een glycolyse-stresstest op een extracellulaire fluxanalysator. Deze test maakt realtime meting van ECAR mogelijk, een indicator van glycolytische activiteit die geassocieerd wordt met een lage pH, zoals lactaat. Onze aanpak omvat het behandelen van gekweekte microglia onder verschillende omstandigheden om te onderzoeken hoe metabole routes worden veranderd als reactie op diverse prikkels, waaronder pro-inflammatoire stimuli. Uniek is dat ons laboratorium verse voorraadoplossingen bereidt van verschillende reagentia, waaronder glucose, oligomycine en 2-deoxyglucose (2DG), om de verschillende aspecten van het pad te targeten, met zorgvuldige aanpassing van de pH voor elk reagens om experimentele nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te waarborgen. Deze methode biedt een robuust platform voor het onderzoeken van glycolyse in primaire microglia en biedt inzicht in hun functionele toestanden onder inflammatoire of ziektegerelateerde aandoeningen.

Inleiding

Cellen in het centrale zenuwstelsel veranderen hoe ze energie produceren als reactie op normale en ziekteomstandigheden 1,2. Onder de belangrijkste metabole routes zijn glycolyse en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) belangrijke routes die de functies van immuuncellen reguleren – ze ondergaan een robuuste en directe reactie op respectievelijk pro-inflammatoire en ontstekingsremmende aandoeningen 3,4. Zo kunnen immuuncellen schakelen tussen metabole routes als reactie op ontstekingssignalen en functionele toestanden5. Microglia, net als hun myeloïde tegenhangers, zijn metabolisch verbonden met hun functies en passen zich snel aan verschillende routes aan als alternatieve metabole brandstof, wat metabole flexibiliteit 6,7 aantoont. Microglia ondergaan tijdens ontsteking een snelle metabole herprogrammering, waarbij verbeterde glycolyse een belangrijke metabole handtekening is van pro-inflammatoire toestanden8. Dus stellen assays die de cellulaire afhankelijkheid van een metabolisch fenotype identificeren ons in staat hun functionele toestanden onder verschillende omstandigheden te onderzoeken. In het huidige protocol streven we ernaar te bepalen of primaire microglia afhankelijk zijn van verhoogde glycolyse tijdens pro-inflammatoire aandoeningen. Hiervoor voeren we routinematig glycolyse-stresstestassays uit. Hoewel de Seahorse XFe24-analyzer (extracellulaire fluxanalysator) veel wordt gebruikt om ECAR te meten in geïmmortaliseerde cellijnen en getransformeerde cellen, brengen primaire microglia unieke technische uitdagingen met zich mee, waaronder beperkte celopbrengsten, variabele hechtingseigenschappen en een hoge gevoeligheid voor kweekomstandigheden, wat metabole metingen kan verstoren. Bovendien biedt het realtime meting van ECAR, waardoor een nauwkeurige evaluatie van lactaat-gedreven glycolyse op meerdere tijdstippen mogelijk is, die niet alleen met eindpunt-lactaatassays kan worden vastgelegd. Extracellulaire flux-gebaseerde metabole profilering is breed toegepast in metabolismeonderzoek om celbio-energetica te karakteriseren, waardoor dit protocol zeer geschikt is voor studies die metabole verschuivingen in cellen tijdens activatie, ziektemodellering of geneesmiddelentesten onderzoeken. Lezers kunnen geschiktheid bepalen op basis van hun behoefte aan dynamische, hoogresolutie glycolytische metingen binnen primaire cellen.

Glucose wordt via glycolyse omgezet in pyruvaat en vervolgens ofwel omgezet in lactaat in het cytoplasma of in mitochondriën in CO₂ en water. De omzetting van glucose naar lactaat leidt tot de afgifte van protonen in de extracellulaire ruimte, wat resulteert in verzuring van het medium. De extracellulaire fluxanalysator kwantificeert deze verzuring als de ECAR9. In de glycolyse-stresstest worden cellen eerst geïncubeerd in een glucose- en pyruvatvrij medium, en wordt hun baseline ECAR geregistreerd. De eerste injectie levert een verzadigende hoeveelheid glucose, die cellen via glycolyse metaboliseren tot pyruvaat, waarbij ATP, NADH, water en protonen worden geproduceerd. De verhoogde protonafgifte verhoogt ECAR, wat 'glycolyse' weerspiegelt. Vervolgens wordt oligomycine toegevoegd om de mitochondriale ATP-synthese te remmen, waardoor cellen uitsluitend op glycolyse moeten vertrouwen. Deze verandering in de protongradiënt verhoogt ECAR verder en wordt gemeten als de maximale glycolytische capaciteit van de cel. Tot slot wordt 2DG, een glucose-analogie, geïntroduceerd. Het remt hexokinase competitief, blokkeert de glycolyse en vermindert ECAR. Deze daling bevestigt dat de eerdere ECAR afhankelijk was van glycolyse. Het verschil tussen de maximale glycolytische capaciteit en het glycolyseniveau bepaalt de glycolytische reserve. De initiële ECAR vóór glucosetoevoeging vertegenwoordigt niet-glycolytische verzuring door andere cellulaire processen (Figuur 1).

We voerden een glycolyse-stresstest uit met behulp van de extracellulaire flux-analyzer. Ruwe ECAR-waarden werden geëxporteerd naar Excel voor analyse. Voor elke aandoening identificeerden we de tijdspunten die overeenkomen met basale ECAR (voorafgaand aan glucose-toevoeging), glycolyse (na glucose-injectie) en glycolytische capaciteit (na oligomycinebehandeling). ECAR-waarden van de relevante tijdspunten binnen elke fase en over de vier technische replica's werden gemiddeld, en glycolyse werd berekend als de toename van ECAR na glucosetoevoeging. De glycolytische capaciteit werd berekend als een toename van ECAR na toevoeging van oligomycine. De glycolytische reserve werd berekend als een afname van ECAR na 2DG-injectie. Deze gemiddelde waarden werden vervolgens gebruikt om metabole responsen tussen groepen te vergelijken.

Aan de andere kant is de mitochondriale stresstest (Agilent) de standaardmethode om zuurstofverbruik (OCR) te beoordelen en mitochondriale functies te evalueren, waarbij parameters worden gemeten zoals basale ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling, protonlek, maximale ademhaling, reserve ademhalingscapaciteit en niet-mitochondriale ademhaling. Deze metingen worden verkregen door sequentieel specifieke mitochondriale remmers, oligomycine (ATP-syntaseremmer), FCCP (Carbonylcyanide-4 (trifluoromethoxy) fenylhydrazon), een ontkoppelaar die maximale ademhaling aanstuurt, en rotenon/antimycine A (complexe I/III-remmers) te injecteren, waardoor kwantitatieve beoordeling van mitochondriale gezondheid en bio-energeticamogelijk is 10,11,12,13 . ECAR-assays en OCR-assays worden dus onder verschillende omstandigheden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en kregen goedkeuring van het Animal Care Committee van de Memorial University of Newfoundland onder protocolnummer 22-01-DK.

1. Voorbereidingen voorafgaand aan de start van de experimenten

  1. Bereid dissectieoplossing voor door 10 mM HEPES toe te voegen aan 1x HBSS zonder Ca2+ en Mg2+.
  2. Bereid de verteringsoplossing voor (per 2–3 hersenen) door 1 mL 2,5% trypsine (10x voorraad, onverdund), 2 mL dissectieoplossing en 200 μL DNase I (1 mg/mL) te combineren.
  3. Bereid gemengd gliamedium voor door DMEM aan te vullen met 10% FBS, 1x glutamax en 1x antibioticum/antimycoticum.
  4. Bereid microgliamedium voor door DMEM aan te vullen met 10% FBS, 1x Glutamax, 1x MEM NEAA, 1x natriumpyruvaat en 1x penicilline/streptomycine.

2. Plating voor gemengde gliaculturen (Figuur 2A)

  1. Op dag 1:
    1. Verzamel postnatale dag (P0)-P2 pups van C57BL/6C-muizen, haal de cortexen eruit met een stereomicroscoop en verwijder de meninges. Vervolgens ontleed je de cortex in kleine stukjes in dissectieoplossing en breng je deze over in een 15 mL conische buis. Laat de weefsels aan de onderkant van de buis zakken.
    2. Dekanteer de dissectieoplossing en vervang deze door 3 ml verteringsoplossing per 2–3 hersenen. Tritureer voorzichtig met een 2 mL serologische pipet om het weefsel te dissociëren.
    3. Plaats de buizen op een rotor in een broedmachine bij 37 °C en meng door te tritureren met een 2 mL serologische pipette elke 8 minuten, in totaal ongeveer 24 minuten.
    4. Na de weefselvertering centrifugeer je de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Vervolgens verwijder je het supernatant en suspendeer je de pellet opnieuw in 5 mL gemengd glia-medium.
    5. Gebruik een naald van 18 G in een spuit van 5 mL om de cellen te tritureren en vervolgens door een 70 μm nylon cel zeef te halen. Centrifugeer de verzamelde cellen opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    6. Suspensie de pellet eerst opnieuw in 1 mL gemengd glia-medium en tritureer meerdere keren om celklontering te verwijderen, en daarna opnieuw in een groter volume, tot 12 mL in elke T75-kolf (2–3 hersencortexen per kolf worden aanbevolen)
      OPMERKING: Het coaten van de kolf met Poly-D-Lysine of een ander reagens is niet vereist.
  2. Op dag 2 vervang je het hele medium en voeg je verse gemengde glia-media toe.
  3. Op dag 3 vervang je ongeveer tweederdevan het medium door verse gemengde glia-media. Laat de cellen nog eens zeven dagen groeien, in totaal 10 dagen.
    OPMERKING: Op dit punt kan een astrocytenlaag worden waargenomen.
  4. Op dag 6 vervang je 2/3 van het medium door verse gemengde glia-media. Bevestig de aanwezigheid van een samenvloeiende astrocytlaag.

3. Het verkrijgen van pure primaire microglia (Figuur 2A)

OPMERKING: Rond dag 10 zijn kleine, ronde cellen zichtbaar die bovenop de astrocytenlaag zweven; dit zijn voornamelijk microglia (Figuur 2B).

  1. Schud de kolf op 250 rpm gedurende 2 uur bij 37 °C. Verzamel het volledige medium met de drijvende cellen in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten.
  2. Sussen de pellet opnieuw in microglia-media en plaat ongeveer 250.000 cellen per put in de celcultuurmicroplaten van de extracellulaire fluxanalysator.
    OPMERKING: Ongeveer 3–4 miljoen cellen per mL worden verkregen uit drie T75-flessen; Het coaten van de celkweekplaten met poly-D-lysine of andere reagentia is geen vereiste.
  3. Incubeer de microplaat bij 5%CO2 gedurende 30–45 minuten. Daarna vervang je het medium opnieuw om een zuivere microgliacultuur te verkrijgen en om eventuele oligodendrocyten te verwijderen die nog ronddrijven. De cellen zijn de volgende dag al klaar voor behandeling (Figuur 2C).
  4. Sluit de vier putten die als 'achtergrond'-controles zijn aangewezen uit celzaading: één in elke rij (Figuur 3C). Deze putten ontvangen assay-media.
    OPMERKING: Vul de ongebruikte putten met steriel water of PBS om verdamping van het medium te voorkomen, en plaats de cellen in een willekeurig patroon in plaats van in vaste rijen of kolommen om plaatvariabiliteit te minimaliseren.

4. Behandeling van primaire microglia met pro-inflammatoire prikkels

  1. Op dag 11 behandel je de cellen 24 uur lang met 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). Randomiseer controle- en LPS-behandelde putten om eventuele positie-effecten uit te sluiten.
    OPMERKING: De behandelingsduur kan variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden en vereist voorafgaande optimalisatie.

5. Voorbereiding op de extracellulaire fluxtest één dag voor het uitvoeren van het experiment

  1. Voeg op dag 11 1 mL kaliber buffer toe aan de kalibratieplaat (24-put formaat; extracellulaire flux assay kit) in alle putten. Houd de plaat een nacht op 37 °C zonderCO2.
    OPMERKING: De kalibratieplaat bestaat uit 4 injectieputten. Voor de glycolyse-stresstest wordt glucose toegevoegd aan Port A, oligomycine aan Port B en 2DG geïnjecteerd in Port C (zie Figuur 4A).
  2. Bereid glucose- en 2DG-voorraadoplossingen voor
    1. Glucose – Los 90 mg glucose op in 2 ml extracellulair flux assay-medium (Materiaaltabel). Los aanvankelijk op in ongeveer 1,9 mL zodat, wanneer de pH de volgende dag wordt aangepast met 1N NaOH, het uiteindelijke volume niet boven de 2 mL uitkomt, wat cruciaal is om de molariteit te behouden.
    2. 2DG – Los 328 mg op in 2 mL extracellulaire flux assay media.
      OPMERKING: Bewaar zowel de glucose als de 2DG bij 4 °C 's nachts
  3. Haal 30-40 mL testmedium in een 50 mL conische buis en bewaar bij 4 °C voor het uitvoeren van de assays de volgende dag.

6. Extracellulaire flux assay (Dag 12)

  1. Op dag 12 verwarm je de vooraf geconstitueerde glucose, 2DG, en de gealiquoteerde assaymedia tot 37 °C. Pas de pH van glucose en 2DG aan, en die van het gealiquoteerde assaymedium, naar 7,4 door 1N NaOH in stappen toe te voegen (bijv. 5 μL, dan 10 μL).
  2. Vortex kort voor een uniforme menging totdat de pH boven de 7 komt.
    OPMERKING: pH-indicatorstrips worden aanbevolen voor consistente pH-monitoring.
  3. Voeg 2 μL standaardoplossing van 10mM oligomycine toe aan 2 mL pH-gecorrigeerd assaymedium.
    1. Voorraadoplossingsbereiding van 10mM oligomycine: Reconstrueren een 10 mg flesje oligomycine in 1 mL steriele DMSO, met een concentratie van 10 mg/mL, en bewaren bij -80 °C tot verder gebruik.
  4. Haal de cellen uit de incubator (vanaf stap 4) en verzamel het medium in 1,5 mL microcentrifugebuizen en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten.
  5. Verzamel het supernatant (gooi het pelletje weg om cellen/afval te verwijderen) en bewaar het bij -80 °C voor lactaatmetingen, genoemd in stap 8.
  6. Was de cellen heel voorzichtig met 1 mL pH-gereguleerd testmedium om te voorkomen dat de cellen loskomen.
  7. Verwijder het testmedium en voeg 500 μL pH-gecorrigeerd testmedium toe en incubeer bij 37 °C (zonder CO2) gedurende 45 minuten tot 1 uur.
  8. Voeg in de tussentijd alle benodigde inhibitoren toe aan de kalibratieplaat van de extracellulaire fluxanalyzer in hun respectievelijke poorten: 55 μL glucose naar poort A linksboven in alle putten, 60 μL oligomycine in poort B naar de bovenste putten rechtsboven en 65 μL 2DG in poort C naar de benedenbomen linksonder (inclusief achtergrondputten) (zie Figuur 4A).
    OPMERKING: De volumetoename bij elke stap is nodig om de molariteit te behouden, aangezien de volumes toenemen met de voorafgaande toevoeging van glucose en oligomycine.
  9. Na het toevoegen van de inhibitoren stel je een glycolyse-stresstest in met de Agilent Seahorse Wave-software (zie Figuur 3). Vervolgens voer je de kalibratieplaat uit zodra je dat aanvraagt.
    OPMERKING: Verwijder de bovenste kap van de plaat en de roze kap tussen de platen voordat je de kalibratieplaat in de machine plaatst. Tijdens deze stap worden de pH- enO2-sensoren getest en de kwaliteitscontrole gecontroleerd.
  10. Zodra de kalibratie is voltooid, zal de machine de opdracht geven om de kalibratieplaat te ontladen en de kweekplaat te laden.
    1. Stap I: Selecteer Assay-sjabloon (Figuur 3A)
      1. Open de Wave-software en kies vanuit het Template-gedeelte het juiste assay-sjabloon voor het experiment.
      2. Selecteer in dit geval "XF Glycolysis Stress Test" op de extracellulaire flux-analyzer.
    2. Stap II: Definieer groepen en injectiestrategieën (Figuur 3B)
      1. Ga naar het tabblad Groepsdefinities en maak experimentele groepen aan (bijv. Achtergrond, Controle en LPS).
      2. Definieer de injectiestrategie door de verbindingen te selecteren die in elke poort geïnjecteerd moeten worden (bijv. glucose, oligomycine, 2DG voor de glycolyse-stresstest; deze instellingen zijn standaard door de software ingesteld, controleer dit hiernaar).
    3. Stap III: Groepen toewijzen aan plaatkaart (Figuur 3C)
      1. Open de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep door de groepsnamen (bijv. Achtergrond = zwart, Controle = groen, LPS = rood) op de plaatindeling te slepen.
      2. Zorg ervoor dat lege/achtergrondputten zijn aangewezen voor nauwkeurige normalisatie.
    4. Stap IV: Het protocol instellen (Figuur 3D)
      1. Programmeer onder het tabblad Protocol de meetcycli en injecties. Typische volgorde voor de glycolyse-stresstest omvat niet-glycolytische verzuring, injectie van glucose (poort A) → glycolyse meet, injectie van oligomycine (poort B) → glycolytische capaciteit, injectie van 2-DG (poort C) → meet de glycolytische reserve
      2. Definieer het aantal meetcycli na elke injectie en pas de timing aan (bijv. 3 cycli van 3 minuten mixen, 2 minuten wachten, 3 minuten meten).
        OPMERKING: Voor onze experimenten gebruiken we de standaardinstellingen van de software.
      3. Bekijk de totale assaytijd voordat je de assay uitvoert.
    5. Stap V: Normalisatie (Figuur 3E)
      1. Normaliseer gegevens met eiwitconcentratiewaarden verkregen uit de bicinchoninezuur (BCA) assay binnen Wave-software met behulp van de ingebouwde normalisatieoptie (bijvoorbeeld op eiwitinhoud, celnummer of andere beschikbare methoden). Eiwitconcentratiemetingen zijn weergegeven in Tabel 1.
        OPMERKING: Het protocol voor het isoleren van het eiwit voor de BCA-assay na ECAR-meting wordt beschreven in de volgende stap 7.

7. Verzameling van cellen voor datakwantificatie en normalisatie

  1. Zodra de extracellulaire fluxtest is voltooid, verwijder je de kweekplaat en begin je onmiddellijk met eiwitextractie of bewaar je de plaat bij -80 °C totdat deze klaar is voor eiwitextractie.
    OPMERKING: Eiwitassays stellen ons in staat waarden te normaliseren over verschillende behandelomstandigheden (ze zijn een van de methoden om de data te normaliseren, niet de enige).
  2. Voor directe eiwitisolatie verwijder je het assaymedium uit de putten en was je één keer met 500 μL RT PBS (1x) (een zachte eenmalige wash wordt aanbevolen om verstoring van de celmonolaag te minimaliseren).
  3. Om cellen te verzamelen die tijdens dit proces kunnen loskomen, centrifugeer je de plaat één keer op 300 × g gedurende 5 minuten, gooi je de PBS weg en plaats je de resulterende pellet opnieuw in de RIPA-buffer om nauwkeurige totale eiwitmetingen te garanderen.
  4. Voeg ongeveer 75–100 μL RIPA-buffer toe aan elk van de putten en plaats de plaat op een shaker (lage tot middenrotatie) gedurende 30 minuten (RT). Vervolgens breng je de inhoud over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 mL.
    OPMERKING: Tritureer en meng goed binnen de putten voordat je de RIPA-buffer in de 1,5 ml microcentrifugebuis plaatst.
  5. Incubeer de microcentrifugebuis ongeveer 30 minuten op een rotator bij RT voor een goede lysatie van cellen. Koel de centrifuge tijdens deze tijd voor tot 4 °C.
  6. Centrifugeer het cellysaat op 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi de pellet weg, want die bevat cellulair afval.
  7. Verzamel het supernatant voor eiwitkwantificatie met behulp van de BCA-assay (of een andere voorkeursmethode). Ga direct door of bewaar de lysaten na verwijdering van alle assaymedia bij -20 °C (voor kortdurende opslag) of -80 °C (voor langdurige opslag).
  8. Bij het herstarten na het opbergen van de monsters bij -20 °C of -80 °C, ontdooi ze dan ongeveer 20–30 minuten op ijs, kort vortex/spin, en ga door met het standaard BCA-protocol.
  9. Of kun je de cellen per put tellen met een hemocytometer of via een flowcytometer en integreren in de normalisatiestrategieën. Voeg in dat geval ongeveer 100–200 μL trypsine toe (voorverwarmd tot 37 °C) direct nadat de test is voltooid en het testmedium is verwijderd, en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten. Verzamel de cellen door 100–200 μL van 10% FBS toe te voegen om de effecten van trypsine te neutraliseren.
    1. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in ongeveer 1 mL van 10% FBS voordat je telt met een hemocytometer. Alternatief kunnen de cellen worden vastgezet met 4% PFA gedurende 15 minuten voordat wordt overgestapt op flowcytometrie-gebaseerde celtelling.
      OPMERKING: Als je direct celtelling doet, is fixatie op basis van PFA niet vereist.
  10. Normaliseer ECAR-waarden met eiwitconcentratie uit stap 7.8 of celtellingen uit stap 7.9.1 in elke put met behulp van de Wave-software zoals in stap 6.10.5.1. De resulterende waarden zijn de genormaliseerde waarden voor de glycolyse-stresstestassay.
  11. Genereer de resultaten en grafiek met de optie "Exporteren", gevolgd door de optie "Graph Pad Prism" en "Excel-sheet" voor elke datapuntwaarde ter kwantificatie.
    OPMERKING: In de celkweekplaat is de keuze tussen vier aangewezen blanco putten flexibel en kan door de onderzoeker worden ingesteld. De standaard blanco opstelling is te zien in Figuur 3C.

8. Lactaatmetingen uit kweeksupernatanten

  1. Ontdooi geleidelijk de supernatant aliquots op ijs die op dag 12 zijn verzameld en opgeslagen bij −80 °C vanaf stap 6,5.
  2. Bepaal de L-lactaatconcentraties met behulp van de L-Lactaat Assay Kit in fluorometrische modus, volgens het protocol van de fabrikant.
    Opmerking: De fluorometrische modus is veel gevoeliger dan de colorimetrische assay.
  3. Bereid standaarden voor door seriële verdunning van de geleverde lactaatstandaard om een kalibratiecurve te genereren variërend van 0 tot 0,1 nmol/put.
  4. Voeg monsters en standaarden toe aan een heldere 96-wells microplaat in duplicaat, en voeg vervolgens het reactiemengsel met lactaatenzymmengsel en fluorescerende sonde toe aan elke put.
  5. Incubeer 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Meet de fluorescentieintensiteit met een fluorescentiemicroplaatlezer met excitatie-/emissiegolflengten ingesteld op 535/587 nm.
  6. Bereken lactaatconcentraties in monsters van de standaardcurve en druk deze uit als pM. Lactaatniveaus van supernatanten van onbehandelde (controle) en LPS-behandelde primaire microglia worden weergegeven in Tabel 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De extracellulaire flux-gebaseerde glycolyse-stresstest meet met succes het glycolytische profiel van primaire microglia. De assay meet basale glycolyse, dat wil zeggen glycolyse na glucose-injectie, glycolytische capaciteit na oligomycine-injectie en remming van glycolyse bij 2DG-injectie. Voor ons experiment vergeleken we controle- (onbehandelde) en LPS-behandelde primaire microglia. We observeerden lichte morfologische veranderingen tussen controle- en LPS-behandelde microglia na 24 u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De microgliale respons tijdens neuro-inflammatie gaat gepaard met diepgaande metabole herbedrading die deze cellen in staat stelt te voldoen aan de energetische en biosynthetische eisen van hun functionele toestand. De extracellulaire flux-gebaseerde glycolyse-stresstest biedt een gevoelige en realtime methode om glycolytische flux te meten, waardoor we kunnen analyseren hoe primaire microglia hun metabolisme aanpassen onder pro-inflammatoire omstandigheden. In deze studie maakten we geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflict aan te geven.

Dankbetuigingen

Het werk wordt gefinancierd via een CIHR-projectsubsidie aan DKK. De RTI aan Dr. Craig Moore voor Seahorse assay XFe24 analyzer wordt zeer erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1M HEPES solutionSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco  14175-079
2.5% TrypsinGibco  15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiotic/Antimycotic Gibco15240-062
D –(+)Glucose, anhydrous Thermoscientific  A16828.36
DMEMGibco 11965-092
DNase IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco  35050-061
L-Lactate KitAbcamab65330
LPS Sigma Aldrich L4391
MEM NEAA Gibco  11140-050
Oligomycin AMillipore sigma 495455
Penicillin/StreptomycinGibco  15240-062
pH indicator stripsFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TechnologiesN/AGeneric name: Extracellular flux analyzer
Seahorse 24 V7 PS cell culture microplatesAgilent Seahorse100777-004Generic name: Extracellular flux cell culture microplates
Seahorse assay XF Calibrant buffer (pH 7.4)Agilent Seahorse  100840-000Generic name: Extracellular flux calibrant buffer
Seahorse assay XF DMEM media (pH 7.4)Agilent Seahorse    103575-100Generic name: Extracellular flux assay media
Seahorse Extracellular flux assay kitAgilent Seahorse 102342-100Generic name: Extracellular flux calibration plate 
Sodium pyruvate Gibco  11360-070

Referenties

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glycolyse microgliaglycolyse stresstestmicroglia metabolismeECAR metingneonatale muizenhersenenpro inflammatoire stimuliglucosemetabolismemetabole routes
Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.