Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie onderzoekt het therapeutisch potentieel van Calceolarioside A in glioma, waarbij het vermogen aantoont om PI3K/Akt-signalering te remmen en de degradatie van Nrf2 te bevorderen, waardoor ferroptose wordt geïnduceerd en tumorprogressie zowel in vitro als in vivo wordt onderdrukt.
Dit protocol demonstreert de experimentele workflow die wordt gebruikt om de effecten van Calceolarioside A (CaA) op ferroptose-inductie en modulatie van de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/proteïne Kinase B (Akt)/nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) route in gliommodellen te onderzoeken. De procedures omvatten een reeks celgebaseerde assays in U251- en U87-menselijke gliomalijnen om de levensvatbaarheid, proliferatie en chemosensitiviteit van cellen na CaA-behandeling te evalueren. Ferroptose-geassocieerde veranderingen worden beoordeeld door het meten van reactieve zuurstofsoorten (ROS), glutathion (GSH), malondialdehyde (MDA) en labiele ijzerniveaus, samen met expressie van ferroptose-gerelateerde eiwitten zoals glutathionperoxidase 4 (GPX4), cysteïne/glutamaat antiporter subunit (xCT) en ferritine via western blot. Om de betrokkenheid van de paden te beoordelen, beschrijft het protocol qRT-PCR, western blot en immunoprecipitatie-gebaseerde assays voor Nrf2-expressie en ubiquitinatie. NRF2-overexpressieexperimenten zijn opgenomen om de rol ervan in de regulatie van ferroptose te bevestigen. Het protocol demonstreert verder het gebruik van een muis-xenograftmodel, waarbij U87-cellen subcutaan worden geïmplanteerd, gevolgd door intraperitoneale CaA-toediening om tumorgroei en toxiciteit in vivo te evalueren. Histologische analyse van belangrijke organen wordt uitgevoerd om de systemische veiligheid te beoordelen. Daarnaast wordt moleculaire koppeling gebruikt om directe binding tussen CaA en de PI3K p110α-subunit (PIK3CA) te voorspellen. Samen bieden deze procedures een reproduceerbaar kader om ferroptosemechanismen en de therapeutische effectiviteit van natuurlijke verbindingen in gliomonderzoek te onderzoeken.
Gliomen, met name hooggradige glioblastomen, vormen een van de dodelijkste vormen van hersentumoren, gekenmerkt door snelle proliferatie, therapieresistentie en een slechte prognose1. In de afgelopen jaren zijn verschillende antigliommiddelen onderzocht, waaronder traditionele chemotherapeutica zoals temozolomide en een reeks natuurlijke verbindingen zoals curcumine2, resveratrol3 en epigallocatechine gallaat4. Deze middelen oefenen hun effecten uit via meerdere mechanismen, waaronder het inductie van apoptose, het remmen van angiogenese en het moduleren van oxidatieve stresspaden. Veel van deze verbindingen ondervinden echter beperkingen zoals slechte biologische beschikbaarheid of onvolledige mechanistische karakterisering. Dit benadrukt de cruciale noodzaak van uitgebreide methodologieën die niet alleen anti-tumoractiviteit bevestigen, maar ook systematisch de onderliggende farmacologische mechanismen ontleden. Het opzetten van dergelijke mechanistische workflows is vooral belangrijk om de ontwikkeling van nieuwe anti-gliomverbindingen te versnellen van ontdekking tot preklinische validatie.
Om dit doel te ondersteunen, integreren steeds meer studies nu geavanceerde computationele en experimentele tools om mechanistische resolutie 5,6 te verbeteren. Structuurgebaseerde geneesmiddelenontwerp- en kunstmatige intelligentie (AI)-modellen – zoals AlphaFold3 en moleculaire docking – faciliteren de identificatie van veelbelovende interacties tussen geneesmiddel en doelwit met ongekende snelheid en nauwkeurigheid 7,8. Deze tools vullen experimentele methoden aan door bindingsaffiniteiten te voorspellen en potentiële moleculaire doelen te identificeren vóór laboratoriumvalidatie. Tegelijkertijd stellen de opkomst van pathway-gebaseerde functionele assays, live-cell imaging en hoogresolutie proteomtechnieken onderzoekers in staat om de cellulaire impact van nieuwe verbindingen over meerdere regulerende assen te evalueren, waaronder oxidatieve stressreacties, signaaltransductiecascades en celsterftemodaliteiten zoals ferroptose 9,10,11.
Onder de signaalroutes die betrokken zijn bij gliombiologie zijn de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/proteïen Kinase B (Akt) en de nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) routes van bijzonder belang vanwege hun rol in tumorgroei, redoxhomeostase en therapieresistentie12,13. PI3K/Akt-signaaltransductie bevordert overleving, proliferatie en metabole adaptatie in gliomacellen, terwijl Nrf2 fungeert als een meesterregulator van de antioxidantrespons en ferroptotische celdoodonderdrukt. Aanhoudende activatie van deze routes draagt bij aan het ontwijken van behandeling, waardoor ze aantrekkelijke doelwitten zijn voor farmacologische interventie15. Conventionele methoden voor pathway-interrogatie omvatten western blotting voor totale en gefosforyleerde eiwitten, evenals qRT-PCR voor genexpressie-analyse. Echter, diepgaande analyse van Nrf2-signalering vereist aanvullende assays die eiwitstabiliteit, nucleaire translocatie en post-translationele modificaties zoals ubiquitinatie beoordelen. Deze veelzijdige detectiestrategieën zijn essentieel om te begrijpen hoe specifieke verbindingen de redoxregulatie en ferroptotische controle verstoren of versterken.
Calceolarioside A (CaA), een derivaat van hydroxycinnaminzuur, biedt een dubbel mechanisme door tegelijkertijd PI3K/Akt-signalering te remmen en proteasomale afbraak van Nrf2 te bevorderen, waardoor de ferroptotische gevoeligheid wordt verhoogd. Deze dual-targetingstrategie kan de reproduceerbaarheid en mechanistische diepte verbeteren ten opzichte van bestaande middelen zoals erastine of RSL3, die stroomafwaarts werken van antioxidanten. Dit protocol biedt een geïntegreerde experimentele benadering om het farmacologische mechanisme van CaA te onderzoeken, waaronder moleculaire koppeling om PI3K-bindingsplaatsen te identificeren, immunoblotting en immunoprecipitatie om Nrf2-expressie en ubiquitinatie te detecteren, en ferroptosemarkers zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS), glutathion (GSH) en malondialdehyde (MDA). Bovendien wordt een xenograft-muismodel gebruikt om de therapeutische effectiviteit en systemische veiligheid van CaA te beoordelen. Deze uitgebreide workflow biedt een reproduceerbaar en informatief platform voor het bestuderen van het werkingsmechanisme van antikankermiddelen, met nadruk op het integreren van signaalpadmodulatie en celsterfteregulatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Celkweek en behandeling
Murine HT22-neuronale cellen en menselijke glioom U87- en U251-cellijnen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum en 4 mM L-glutamine, onder bevochtigde omstandigheden bij 37 °C en 5% CO₂. Om experimentele consistentie te vereenvoudigen, werden alle celbehandelingen gestandaardiseerd en hier beschreven. Deze sectie beschrijft de specifieke aandoeningen die in elke behandelgroep worden gebruikt en de bijbehorende downstream assays.
CaA-behandeling:
HT22-cellen werden behandeld met toenemende concentraties CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 en 500 μM) gedurende 72 uur. U87- en U251-gliomcellen werden behandeld met CaA bij concentraties van 5, 20 of 50 μM gedurende 24 uur voor de meeste experimenten, of met 50 μM voor 0, 6, 12 of 18 uur voor tijdverloopstudies. Deze behandelingen werden gebruikt in de volgende analyses: western blotting voor cysteïne/glutamaat antiporter subunit (xCT), glutathionperoxidase 4 (GPX4), ferritine (FTH1), glutaminase, en PI3K/Akt/zoogdiertarget van Rapamycine (mTOR)/ eukaryote Initiatiefactor 4B (EIF4B) (totale en gefosforyleerde niveaus); real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) voor Nrf2 en Kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap1); ROS-meting met 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïne-diacetatie (DCFH-DA); GSH- en MDA-kwantificatie; FerroOrange-gebaseerde Fe2+ detectie; 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) proliferatie-assay; Kolonievormingsassay; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) cellevensvatbaarheidsassay.
Liproxstatine-1 (Lip1) co-behandeling:
Cellen werden voorbehandeld met 50 nM Lip1 gedurende 2 uur voordat 50 μM CaA werd toegevoegd. Deze omstandigheden werden gebruikt in MTT-assay (0, 24, 48, 72 h); Kolonievormingsonderzoek; EdU-assay; Annexine V/PI apoptose-assay (met/zonder 20 nM cisplatijn).
MG132 co-behandeling:
Cellen werden behandeld met 10 μM MG132 alleen of gecombineerd met 50 μM CaA gedurende 24 uur. Dit werd toegepast op western blotting voor Nrf2-eiwitstabilisatie (totaal en nucleair); Immunoprecipitatie (IP) assays voor ubiquitineerde Nrf2 en Keap1.
Cisplatine co-behandeling:
Cellen werden behandeld met 20 nM cisplatine alleen of in combinatie met 20 μM CaA gedurende 24 uur. Deze behandelingen werden gebruikt in de apoptosetest van Annexin V/propidium jodide (PI).
Nrf2 overexpressie:
Cellen werden getransfecteerd met 2,5 μg Nrf2 overexpressieplasmide of lege vector met transfectiemiddel gedurende 18 uur, waarna ze behandeld werden met 50 μM CaA gedurende 24 uur. Deze aandoening werd gebruikt bij western blotting voor xCT, GPX4, FTH1 en glutaminase; ROS, MDA, GSH assays; FerroOrange kleuring voor intracellulair ijzer.
Een workflowdiagram (Aanvullende Figuur S1) vat de bovenstaande experimentele omstandigheden en bijbehorende analyses samen. Deze figuur koppelt elk behandelprotocol visueel aan de specifieke downstream assays voor verbeterde helderheid en reproduceerbaarheid.
Beoordeling van cellevensvatbaarheid
De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld met behulp van de conventionele MTT-colorimetrische methode zoals eerder beschreven16. HT22-, U251- en U87-cellen werden geplateerd in 96-put kweekplaten en een nacht geïncubeerd om hechting mogelijk te maken. Na afronding van de behandelingsperiode werd 15 μL MTT-oplossing in elke put gebracht en werden de platen 4 uur geïncubeerd bij 37 °C. Het medium werd vervolgens weggegooid en 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd om de gevormde formazankristallen te oplossen. De absorptie werd vervolgens geregistreerd op 490 nm met behulp van een microplaatlezer. Hogere absorptiewaarden duiden op een grotere levensvatbaarheid van cellen, terwijl een vermindering van de absorptie cytotoxische effecten suggereert.
EdU-incorporatietest
Voor het beoordelen van DNA-synthese en celproliferatie werden EdU-incorporatietests uitgevoerd met behulp van een EdU Imaging Kit zoals eerder beschreven17. Kort gezegd werden U251- en U87-gliomacellen gezaaid in 24-wellplaten. Na behandeling werden de cellen geïncubeerd met EdU (10 μM eindconcentratie) en nog eens 24 uur gekweekt. Na de incubatiestap werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens permeabiliseerd met 0,5% Triton X-100., en gekleurd volgens de instructies van de kit. Het percentage EdU-positieve cellen (prolifererende cellen) werd gekwantificeerd met fluorescentiemicroscopie en genormaliseerd tot het totaal aantal kernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-gekleurde kernen.
Kolonievormingstest
Voor de kolonievormingstest werden U251- en U87-gliomacellen in schalen van 3,5 cm plat bij lage dichtheid (500 cellen per schotel). Na behandeling werd het kweekmedium vervangen door verse, medicijnvrije medium, en werden de cellen nog eens 14 dagen onderhouden om kolonievorming mogelijk te maken, waarbij elke drie dagen mediumwissels werden uitgevoerd. De resulterende kolonies werden vervolgens vastgezet met 4% paraformaldehyde, gekleurd met 0,1% kristalviolet, en handmatig geteld onder een microscoop. Clusters met een diameter van meer dan 75 μm werden als kolonies beoordeeld. Elk experiment werd driemaal uitgevoerd en drie keer herhaald. Deze assay volgde algemeen geaccepteerde protocollen voor het evalueren van de langetermijnproliferatieve capaciteit18. Kolonies moeten verschijnen als dichte, cirkelvormige clusters; Minder en kleinere kolonies wijzen op een verminderde proliferatiecapaciteit.
Beoordeling van celapoptose
Apoptotische celdood werd beoordeeld met behulp van de FITC-Annexin V apoptosedetectiekit zoals eerder beschreven16. U87- en U251-gliomacellen werden behandeld met 20 nM cisplatine in aanwezigheid of afwezigheid van 20 μM CaA gedurende 24 uur voorafgaand aan de kleuring. Voor experimenten waarbij ferroptosis werd geremd, werden cellen voorbehandeld met 50 nM Lip1 voor 2 uur, gevolgd door co-behandeling met 20 μM CaA en 20 nM cisplatine voor nog eens 24 uur. Na de aangegeven behandelingen werden de cellen geoogst (300 × g, 5 min) en gekleurd met Annexin V-FITC en PI volgens de instructies van de fabrikant. Na het labelen werden monsters onderzocht op een flowcytometer. Gegevensverzameling werd uitgevoerd met FL1 (FITC) en FL2 (PI) kanalen, met compensatie-instellingen toegepast om spectrale overlap te minimaliseren. Het aandeel Annexine V-positieve cellen werd vervolgens berekend om de mate van apoptose te bepalen.
Western blot-analyse
Western blotting werd uitgevoerd volgens vastgestelde procedures19,20. Kort na de geïndiceerde behandelingen werden cellen gelyseerd in een RIPA-buffer met protease- en fosfataseremmers, en werden de eiwitniveaus bepaald met behulp van de Bradford-assay. Voor experimenten die de subcellulaire distributie van Nrf2 beoordeelden, werden nucleaire en cytoplasmatische eiwitten geëxtraheerd met een commerciële nucleaire extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
In totaal werd 40 μg eiwit per monster opgelost op een 10% SDS-PAGE gel en vervolgens overgedragen op PVDF-membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk bereid in PBST (PBS met 0,1% Tween-20) gedurende 1 uur op kamertemperatuur, gevolgd door nachtelijke incubatie met primaire antilichamen bij 4 °C. Na het wassen werden HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5.000) gedurende 1 uur bij 37 °C aangebracht, en werden de signalen gedetecteerd met een verbeterd chemiluminescentiesysteem (ECL).
De expressieniveaus van xCT, glutaminase, GPX4 en FTH1 werden gemeten, waarbij glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als belastingscontrole werd gebruikt. Gefosforyleerde eiwitten (p-PI3K, p-Akt, p-MTOR en p-EIF4B) werden gekwantificeerd ten opzichte van hun respectievelijke totale eiwitniveaus, terwijl het totale aantal eiwitten werd genormaliseerd tegen GAPDH. Nucleaire Nrf2 werd genormaliseerd tot Lamin B. Verwachte uitkomsten omvatten een dosis- en tijdsafhankelijke vermindering van Nrf2 en p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, en downregulatie van ferroptose-gerelateerde markers in met CaA behandelde cellen.
Voor ubiquitinatietests werden cellen behandeld met MG132 (10 μM) met of zonder CaA (50 μM) gedurende 24 uur. Na de lysis werden eiwitcomplexen immunoprecipiteerd met anti-Nrf2- of anti-Keap1-antilichamen; normale konijnen-IgG werd gebruikt als negatieve controle. De immunoprecipitaten werden vervolgens onderzocht met anti-ubiquitine-antilichamen om ubiquitinatievormen te detecteren, terwijl het totale aantal lysaten ook werd onderzocht op Nrf2- en Kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap1)-niveaus om input te bevestigen.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
RNA-extractie en qRT-PCR werden uitgevoerd volgens standaardprotocollen21. Kort gezegd werden U87- en U251-gliomacellen behandeld met of zonder 50 μM CaA voor verschillende duurheden (6 en 18 uur). Totaal RNA werd geïsoleerd en omgezet in cDNA via reverse transcriptie. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd met een SYBR Green qPCR Master Mix op een realtime PCR-platform. Relatieve genexpressie werd bepaald met behulp van de 2-ΔΔCt-berekening. De primersequenties die werden gebruikt voor Nrf2, Keap1 en het huishoudelijke gen GAPDH waren als volgt:
Nrf2 vooraan, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 omgekeerd, 5′-GGAATGTCTGCGCCAAAAAGCTG-3′
Keap1 voorwaarts, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 achteruit, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′
GAPDH vooraan, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH achteruit, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′
Nrf2-transductie
U251- en U87-gliomacellen werden tijdelijk getransfecteerd met ofwel een Nrf2-overexpressieplasmide of een overeenkomstige lege controlevector met behulp van het lipide-gebaseerde transfectiereagens; De procedure was gebaseerd op conventionele transiënte transfectiemethoden22. Kort gezegd werden cellen gezaaid in 6-wellplaten met een dichtheid van 3 × 10⁵ cellen per put en 's nachts gekweekt om ongeveer 70-80% confluentie te bereiken op het moment van transfectie. Voor elke put werd 2,5 μg plasmide-DNA verdund in 125 μL gereduced serum medium en gemengd met 5 μL van het transfectie-reagens. Afzonderlijk werd 3,75 μL van het transfectie-reagens verdund in nog eens 125 μL van het gereduceerde serummedium. De verdunde DNA- en transfectie-reagensmengsels werden vervolgens gemengd, voorzichtig gemengd en 10-15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om complexe vorming mogelijk te maken. De resulterende transfectiecomplexen (totaal volume 250 μL) werden druppelgewijs toegevoegd aan elke put met cellen in een nieuw volledig medium.
Na 18 uur incubatie bij 37 °C in een CO₂-incubator werd het transfectiemedium vervangen door een nieuw kweekmedium. Vervolgens werden er cellen uitgevoerd, waaronder western blotting, ROS-analyse, MDA/GSH-kwantificatie en ijzeraccumulatiestudies. Dit protocol volgt algemeen geaccepteerde transiënte genexpressieprocedures en maakt robuuste Nrf2-expressie mogelijk binnen 24-48 uur na transfection.
Meting van intracellulair ijzer
De intracellulaire Fe2+- niveaus werden gemeten met behulp van de fluorescerende indicator FerroOrange. Korte U251- en U87-gliomacellen werden gezaaid in 24-wellplaten en behandeld met wisselende concentraties CaA (5, 20 en 50 μM). Om het effect van Nrf2-overexpressie op ferroptose te beoordelen, werden U87- en U251-cellen getransfecteerd met een Nrf2-expressieplasmide of lege vector. Na 18 uur werd het medium vervangen en werden cellen behandeld met 50 μM CaA gedurende 24 uur. Vervolgens werden cellen blootgesteld aan 1 μM FerroOrange in serumvrij medium en 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C voordat ze werden geanalyseerd. Na incubatie werden de cellen gespoeld en onder een fluorescentiemicroscoop geobserveerd, met een TRITC-filterset (excitatie ~543 nm, emissie 560-600 nm), waarbij een verhoogde oranje fluorescentieintensiteit een hogere niveaus van labiele Fe2+ aangeeft, meestal gelokaliseerd in het cytoplasma. Deze methode is aangepast van gevestigde fluorescente-probe-gebaseerde ijzerassays23.
Meting van GSH en MDA
Intracellulaire GSH- en MDA-niveaus werden bepaald volgens gestandaardiseerde evaluatieprotocollen om oxidatieve stress te evalueren24. Korte U251- en U87-gliomacellen werden gezaaid in 24-wellplaten en behandeld met wisselende concentraties CaA (5, 20 en 50 μM). Om het effect van Nrf2-overexpressie op ferroptose te beoordelen, werden U87- en U251-cellen getransfecteerd met een Nrf2-expressieplasmide of lege vector. Na 18 uur werd het medium vervangen en werden cellen behandeld met 50 μM CaA gedurende 24 uur. Vervolgens werden cellen gelyseerd in een RIPA-buffer en werden de totale eiwitconcentraties gemeten met een BCA-eiwitkwantificatiekit. De inhoud van GSH en MDA werd vervolgens geanalyseerd met commerciële detectiekits volgens de protocollen van de fabrikant.
ROS-assay
De intracellulaire ROS-generatie werd beoordeeld met behulp van de fluorescerende sonde DCFH-DA volgens de vastgestelde protocollen25. Korte U251- en U87-gliomacellen werden gezaaid in 24-wellplaten en behandeld met wisselende concentraties CaA (5, 20 en 50 μM). Om het effect van Nrf2-overexpressie op ferroptose te beoordelen, werden U87- en U251-cellen getransfecteerd met een Nrf2-expressieplasmide of lege vector. Na 18 uur werd het medium vervangen en werden cellen behandeld met 50 μM CaA gedurende 24 uur. Vervolgens werden cellen behandeld met 5 μM DCFH-DA bij 37 °C gedurende 1 uur, gevolgd door PBS-washes om overtollige kleurstof te verwijderen. Fluorescentiesignalen werden gevisualiseerd met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een FITC-filter (excitatie 488 nm, emissie 525 nm), en er werden beelden gemaakt voor analyse. Verhoogde intensiteit van groene fluorescentie komt overeen met verhoogde intracellulaire ROS-niveaus.
Dierproeven
Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Weifang Peoples Hospital onder goedkeuringsnummer [2025SDL579]. Om het glioma-xenograftmodel te genereren, werden 2 × 106 U87-cellen opnieuw opgehangen in 0,2 mL PBS en subcutaan geïnformeerd in de linkerflank van 4 weken oude mannelijke BALB/c-naakte muizen. Na 7 dagen tumorontwikkeling te hebben gehad, werden de muizen willekeurig ingedeeld in drie groepen (n = 8 per groep): onbehandelde controlegroep, CaA-behandeld (2,5 mg/kg) en CaA (2,5 mg/kg) gecombineerd met Lip1 (10 mg/kg). De behandelingen werden toegediend via een dagelijkse intraperitoneale injectie gedurende 14 opeenvolgende dagen. Tumorafmetingen werden elke 3 dagen gemeten met schuifkleeuwen, en volumes werden berekend met de formule: volume = (lengte × breedte²) / 2. Op dag 21 werden alle muizen geëuthanaseerd en werden tumoren verwijderd en gefotografeerd voor verdere analyse.
RNA-sequencing en KEGG-routeanalyse
RNA-sequencing werd uitgevoerd om transcriptieveranderingen na CaA-blootstelling te profileren. De integriteit van RNA werd bevestigd door gebruik te maken van een microvolume UV-VIS spectrofotometer en een capillair-gebaseerd elektroforesesysteem voorafgaand aan sequencing op het Illumina-platform. Schone reads werden met HISAT2 gekoppeld aan het menselijke referentiegenoom (GRCh38), en genexpressie werd gekwantificeerd als FPKM. Differentieel expressieve genen werden geïdentificeerd met DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), en functionele verrijking werd beoordeeld met KEGG-routeanalyse (aangepast P < 0,05).
Moleculaire koppelingsanalyse
Moleculaire koppeling werd toegepast om de interactie tussen CaA en de PI3K/Akt-route te voorspellen. De kristalstructuur van de menselijke PI3K-katalytische subunit p110α (PIK3CA) werd verkregen uit de Protein Data Bank (PDB ID: 8BFU). De structuur van CaA werd opgehaald van PubChem en energie-geminimaliseerd met behulp van moleculaire modelleringssoftware. Met behulp van moleculaire dockingvoorbereidingssoftware werden alle watermoleculen en niet-essentiële liganden uit de PIK3CA-structuur verwijderd en werden waterstofatomen toegevoegd. Er werd een koppelraster gedefinieerd rond de actieve locatie van PIK3CA (gebaseerd op bekende verbindingslocatiecoördinaten), en een koppelingsalgoritme werd gebruikt om het koppelen uit te voeren. De hoogst scorende bindingshoudingen van CaA werden geselecteerd op basis van bindingsaffiniteit (kcal/mol) en onderzocht op belangrijke interacties. Interacties tussen eiwit en liganden, zoals waterstofbruggen en hydrofobe contacten, werden gevisualiseerd met moleculaire visualisatiesoftware en een 2D-interactie-mappingtool.
Veiligheid en afvalverwerking
Alle experimenten met chemische reagentia zoals DMSO, fluorescerende kleurstoffen (DCFH-DA, FerroOrange) en fixatiemiddelen werden uitgevoerd in een dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen en veiligheidsbril. DMSO- en fluorescentieprobes werden met voorzichtigheid behandeld vanwege hun vermogen om de huid te doordringen en mogelijke cytotoxiciteit. Verontreinigde materialen, waaronder pipettoppen, kweekplaten en handschoenen, werden gedumpt in aangewezen containers voor gevaarlijk afval. Dierlijke weefsels en karkassen werden behandeld als biologisch gevaarlijk afval en werden verbrand of geautoclaveerd volgens institutionele bioveiligheidsvoorschriften en lokale milieurichtlijnen.
Statistische analyse
Alle resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De verschillen tussen twee groepen werden geëvalueerd met behulp van een tweevoudige Student's t-test. Voor analyses met meerdere groepen werd eenrichtings-ANOVA gevolgd door geschikte post hoc-vergelijkingen (zoals de test van Tukey) toegepast. Een p-waarde onder 0,05 werd beschouwd als indicatief voor statistische significantie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Proliferatieonderdrukking en verhoogde chemosensitiviteit van U251- en U87-cellen in vitro door CaA
Figuur 1A illustreert de structuur van CaA. We evalueerden eerst de cytotoxische effecten van CaA met behulp van een MTT-assay op normale muis HT22-neuronale cellen en menselijke gliom-U251- en U87-cellen. Vergeleken met onbehandelde cellen (0 μM CaA) had CaA minimale impact op de levensvatbaarheid van HT22-cellen bij concentratie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
CaA vertoont een overtuigend antitumoreffect bij glioblastoom door twee cruciale overlevingsassen uniek te moduleren: de PI3K/Akt/mTOR-route en het Nrf2-ferroptose-verdedigingsmechanisme. De PI3K/Akt-route wordt vaak gehyperactiveerd bij glioblastoma multiforme (GBM, veranderd in tot ~88-90% van de gevallen) door PTEN-verlies of RTK-activatie, wat proliferatie en therapieresistentie26 aandrijft. Toch heeft het alleen richten op deze route beperkte apoptose opgelev...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Geen enkele
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | capillary-based elektroforesesysteem | ||
| Annexin V-FITC Apoptosis Kit | Roche Diagnostics | 11858777001 | N/A |
| AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina) | moleculaire docking-voorbereidingssoftware (docking-algoritme) | ||
| Calceolarioside A (CaA) | Sigma-Aldrich | SMB00246 | N/A |
| Chem3D | moleculaire modelleringssoftware | ||
| cDNA Synthesis Kit | Vazyme Biotech | R223 | N/A |
| DCFH-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | N/A |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | N/A |
| DMSO | Merck | D8418 | N/A |
| FerroOrange sonde | Dojindo | F374 | N/A |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | N/A |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAriaIII Flow Cytometry | Instrument voor het analyseren van Annexin V gekleurde cellen |
| Fluorescentiemicroscoop | Olympus | IX73 | Instrument voor het observeren van FerroOrange en DCFH-DA fluorescentie |
| FTH1 antilichaam | Abcam | ab75973 | AB_1310150 |
| GAPDH antilichaam | Abcam | ab8245 | AB_2107448 |
| GLS antilichaam | Abcam | ab93434 | AB_10563527 |
| GPX4 antilichaam | Abcam | ab125066 | AB_10972289 |
| HT22 muis neuronale cellijn | AddexBio | C0011008 | CVCL_0321 |
| jetPRIME transfectie reagens | Polyplus-transfectie | 114-07 | polymer-gebaseerd transfectie reagens |
| Keap1 antilichaam | Abcam | ab139729 | AB_2732852 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | N/A |
| LigPlot+ | 2D interactie mapping tool | ||
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | lipid-gebaseerd transfectie reagens | |
| Liproxstatin-1 | Selleck | S7699 | N/A |
| MG132 | Selleck | S2619 | N/A |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | H1M | Instrument voor het meten van absorptie in MTT assay (op 490 nm) |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655 | N/A |
| NanoDrop | microvolume UV-Vis spectrofotometer | ||
| Nrf2 antilichaam | Abcam | ab62352 | AB_945626 |
| Nude BALB/c muizen | Vital River, China | N/A | IMSR_CRL:028 |
| OptiMeM verminderd serum medium | |||
| PyMOL | moleculaire visualisatiesoftware | ||
| QuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem | |||
| SYBR Green Master Mix | Vazyme Biotech | Q711 | N/A |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | N/A |
| U251 humane glioma cellijn | CLS Cell Lines Service | 300385 | CVCL_0021 |
| U87 humane glioma cellijn | ATCC | HTB-14 | CVCL_0022 |
| Ubiquitine antilichaam | Abcam | ab7780 | AB_306981 |
| xCT/SLC7A11 antilichaam | Abcam | ab175186 | AB_2715513 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
This corrects the article 10.3791/69643