Methodenartikel

Genoom-brede mapping van histonmodificaties en bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen met behulp van CUT&RUN

DOI:

10.3791/69656

⸱

3 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, 2Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geoptimaliseerd Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next generation sequencing (CUT&RUN-seq) protocol wordt beschreven voor neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen. Het maakt genoombrede mapping mogelijk van diverse histonmodificaties en transcriptiefactoren (bijv. E2F7) bindingsplaatsen om epigenetische en transcriptionele deregulatie in de SCLC-pathobiologie te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatine-remodellerende eiwitten en transcriptiefactoren (TF's) spelen een cruciale rol in de tumorbiologie van kleincellige longkanker (SCLC). Genoombrede karakterisering van histon posttranslationele modificaties (PTM's) en TF-bindingsplaatsen is essentieel voor het identificeren van regulerende DNA-elementen en genroutes, wat zal leiden tot een dieper mechanistisch begrip van SCLC en nominale doelen voor therapeutische interventie. Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next generation sequencing (CUT&RUN-seq) is een krachtige methode om specifieke histonmodificaties in kaart te brengen en de DNA-bindingsprofielen van een breed scala aan eiwitten in situ in het cellulaire genoom te bepalen. In CUT&RUN wordt de micrococcale nuclease (MNase) die aan eiwit A/G is gefuseerd via antilichamen gerekruteerd naar de genomische locaties van chromatine-geassocieerde eiwitten, waarbij de onderliggende DNA-fragmenten vrijkomen uit bulk chromatine bij activatie en splijting van MNase. Deze gelokaliseerde vertering genereert kleine, locus-specifieke DNA-fragmenten die geschikt zijn voor sequencing.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het profileren van histonmodificaties H3K4me3 (geassocieerd met actieve of open promotoren) en H3K4me1 (geassocieerd met actieve enhancers), evenals de transcriptiefactor E2F7, in SCLC. Dit protocol is geoptimaliseerd voor neuro-endocriene (NE) SCLC-cellijnmodellen, die doorgaans worden gekenmerkt door grote kernen, weinig cytoplasma en groei als niet-hechtende aggregaten in suspensie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon posttranslationele modificaties (PTM's) en transcriptiefactoren (TF's) zijn centrale regulatoren van genexpressie. Histon-PTM's, zoals acetylering, methylering, fosforylering en ubiquitinering, beïnvloeden voornamelijk op hun N-terminale staarten de chromatinestructuur 1,2. Bij kanker zijn histon-PTM's vaak ontregeld, wat leidt tot abnormale activatie van oncogenen of het uitschakelen van tumorsuppressorgenen3. TF's binden specifieke DNA-sequenties aan promotoren of enhancers om doelgenen te activeren of te onderdrukken, vaak door histone-modificerende enzymen te rekruteren die chromatine-remodelleringcoördineren 4. Enzymen die histonmarkeringen schrijven, wissen of lezen, zoals histonacetyltransferasen (HAT's), histondeacetylasen (HDAC's) en methyltransferasen (HMT's), zijn bij kanker vaak gemuteerd of ontregeld, waardoor ze aantrekkelijke therapeutische doelenzijn 5.

In SCLC zijn epigenetische veranderingen en transcriptiefactoren (LDTF's) bepalende afstammingslijnen (LDTF's) belangrijke drijfveren van tumorbiologie6. In tegenstelling tot genetische mutaties reguleren epigenetische veranderingen, waaronder DNA-methylering en histonmodificaties, genexpressie zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen. Deze modificaties kunnen tumorsuppressorgenen tot zwijgen brengen of oncogenen activeren, wat het agressieve gedrag van SCLC aanwakkert. Zo wordt de histonmethyltransferase KMT2D vaak gemuteerd met een alteratiefrequentie van 12,9% in een grote SCLC-patiëntcohort7 en is verantwoordelijk voor histon H3 lysine 4 monomethylering (H3K4me1), een kenmerk dat geassocieerd wordt met actieve enhancerregio's in het genoom. SCLC is een moleculair heterogene ziekte. SCLC worden ingedeeld in moleculaire subtypes op basis van differentiële expressie van vier LDTF's: achaete-scutue homoloog 1 (ASCL1), neurogene differentiatiefactor 1 (NEUROD1), ja-geassocieerd eiwit 1 (YAP1) en POU klasse 2 homeobox 3 (POU2F3). De neuro-endocriene (NE) subtypes, waaronder ASCL1 en NEUROD1, zijn goed voor ongeveer 70-80% van de SCLC-gevallen8. Daarom kan het onderzoeken van de verspreiding en profielen van verschillende histon-PTM's en TF-bindingsplaatsen in de verschillende SCLC-subtypes subtype-specifieke genprogramma's verduidelijken die kwetsbaar zijn voor therapeutische interventie.

De traditionele methode om histon-PTM's en de bindingsplaatsen van sequentie-specifieke regulerende eiwitten op genoomniveau te identificeren is chromatine-immunoprecipitatiesequencing (ChIP-seq)9. ChIP-seq vereist echter een groot aantal inputcellen en levert vaak hoge achtergrond op over het genoom. Als gevolg daarvan vereist ChIP-seq een hoog niveau van verrijking van het doeleiwit om echt signaal van ruis te onderscheiden en heeft het diepe sequencing nodig voor effectieve data-analyse. Daarnaast kan formaldehydecrosslinking die in ChIP-seq wordt gebruikt, epitopen maskeren en vals-positieve bindingsplaatsengenereren 10. Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next-generation sequencing (CUT&RUN-seq) is een hoogresolutie-alternatief voor het in kaart brengen van histon-PTM's en TF-bindingsplaatsen in situ binnen intacte cellen. Bij deze methode worden permeabiliseerde cellen geïncubeerd met een antilichaam dat gericht is op het chromatine-geassocieerde eiwit van belang, gevolgd door binding van een Protein A(G)-micrococcal nuclease (MNase) fusie-eiwit. Gerichte DNA-vertering langs het eiwit van belang wordt vervolgens geïnduceerd onder calcium- en zoutarme omstandigheden, waarbij specifieke DNA-fragmenten vrijkomen voor zuivering. De gezuiverde DNA-fragmenten worden gebruikt om barcode-sequencingbibliotheken te construeren, die kunnen worden samengevoegd voor high-throughput sequencing 11,12,13,14. In vergelijking met ChIP-seq vereist CUT&RUN aanzienlijk minder cellen als input, produceert het minder achtergrondruis, voorkomt het crosslinking-artefacten en zijn er minder sequencing-reads nodig – waardoor het bijzonder geschikt is voor het kostenefficiënt bestuderen van dynamische chromatinetoestanden in kanker.

CUT&RUN-technologie is ontwikkeld om de genomische locaties van de chromatine-interacterende eiwitten te onderzoeken, waaronder histonmodificaties, TF-bindingsplaatsen en chromatine-geassocieerde complexen, waardoor epigenetische regulatielandschappenblootgelegd worden 11,12. Deze techniek heeft gedetailleerde analyses mogelijk gemaakt van de architectuur van enhancer-promotor, regulatie van transcriptienetwerken en de dynamica van chromatinetoestanden tijdens ontwikkeling en ziekteprogressie15. In kankeronderzoek maakt CUT&RUN nauwkeurige mapping mogelijk van histonmarkeringen16,17 en oncogene transcriptiefactorbezetting, wat helpt bij het identificeren van lineage-specifieke regulatieprogramma's en potentiële therapeutische doelen15,16. Bovendien kan CUT&RUN in situ worden uitgevoerd in cellen, waaronder CD8+ T-cel17, evenals op weefselmonsters18,19.

Om de genomische locatie van PTM's en transcriptiefactor E2F7-bindingsplaatsen in SCLC-subtypes te detecteren, pasten we CUT&RUN-seq toe op vier SCLC NE-cellijnmodellen: H146 en DMS79 (ASCL1-subtype), evenals H446 en H82 (NEUROD1 subtype), met of zonder KMT2D-mutaties. We profileerden het histonenmerk H3K4me1, een versterker-geassocieerde modificatie die voornamelijk wordt gekatalyseerd door KMT2D, en E2F7, waarvan is aangetoond dat het een cofactor is van ASCL120. Het histonmerk H3K4me3, dat geassocieerd wordt met actieve promotoren, diende als positieve controle, terwijl IgG als negatieve controle diende.

Hier presenteren we een gedetailleerd CUT&RUN-seq-protocol voor SCLC NE-cellijnen, gebaseerd op het volgende: een commercieel verkrijgbare CUT&RUN-kit (zie Materiaaltabel), het oorspronkelijke werk van Skene en Henikoff 11,12,13, en onze eigen laboratoriumoptimalisaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol (Figuur 1) biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van CUT&RUN-seq in SCLC NE-cellijnen, die doorgaans groeien als niet-hechtende aggregaten of drijvende clusters.

1. Celcultuur

  1. Houd cellijnen DMS79 (ASCL1 subtype), H146 (ASCL1 subtype), H82 (NEUROD1 subtype) en H446 (NEUROD1 subtype) in 13 mL RPMI-1640 media, aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (zie Materiaaltabel) in 75 mL flessen. Kweek de cellen in een broedmachine bij 37 °C met 5%CO2.
    OPMERKING: Alle cellen die in deze studie zijn gebruikt, zijn gekocht bij ATCC en zijn geauthenticeerd met korte tandem repeat-profilering.

2. Celpermeabilisatie

OPMERKING: Goede celpermeabilisatie is essentieel om antilichamen, pAG-MNase en verteerde eiwit-DNA-fragmenten vrij in en uit de cellen te laten diffunderen. Voordat het CUT&RUN-protocol op een nieuwe cellijn wordt gestart, moeten optimalisaties worden uitgevoerd om de ideale digitonineconcentratie te bepalen voor effectieve permeabilisatie. De laagste concentratie om meer dan 95% permeabilisatie te bereiken (95% van de cellen is "dood") moet worden gebruikt voor het CUT&RUN-protocol.

  1. Leg de 5% digitonine-bouillon, protease-inhibitor en spermidine op ijs en laat ze volledig ontdooien.
  2. Bereid de wasbuffer voor volgens tabel 1 en houd de buffer op ijs.
  3. Bereid een 0,05% digitonine werkoplossing door 10 μL van de 5% voorraad te mengen met 990 μL Wash Buffer. Meng grondig door vortex te laten draaien en laat het ijs staan.
  4. Genereer een verdunningsreeks van digitonine (0,05%, 0,01%, 0,001% en 0,0001%) door de vorige oplossing sequentieel te verdunnen tot een eindvolume van 1 mL van elke buis. Vortex elke verdunning voordat je doorgaat naar de volgende. Tegelijkertijd bereid je een 0,05% Dimethylsulfoxide (DMSO) controle voor in Wash Buffer (totaal 100 μL; zie Tabel 2).
    OPMERKING: Digitonine en DMSO zijn gevaarlijke chemicaliën. Behandel met voorzichtigheid en gooi al het afval weg in een correct gelabelde container voor gevaarlijk afval met een veilige deksel.
  5. Houd alle digitonine-verdunningsoplossingen en de DMSO-controle op ijs totdat ze gebruikt zijn.
  6. Bepaal het aantal benodigde cellen door het aantal permeabilisatiecondities te vermenigvuldigen met het aantal benodigde cellen per test. Voeg extra 20% toe om pipetteervariatie te compenseren (bijvoorbeeld voor vijf omstandigheden van 5×10cellen van 5 cellen, bereid ongeveer 1,2 x 5 x 5 x 105 cellen voor).
  7. Verzamel het vereiste aantal gekweekte cellen door centrifugatie op 600 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Sussief de pellet opnieuw in 600 μL van 1× PBS (100 μL per conditie plus 20% extra).
  8. Aliquot 100 μL van de PBS-resuspendeerde cellen in vijf 1,5 mL microcentrifugebuizen – één buis voor elke digitonineconcentratie en één voor de DMSO-controle.
  9. Centrifugeer de buizen op 600 × g gedurende 3 minuten bij RT.
  10. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer elke pellet opnieuw in 50 μL van de bijbehorende digitonine- of DMSO-controlebuffer.
  11. Incubeer de monsters 10 minuten bij RT.
  12. Meng 10 μL van de behandelde cellen met 10 μL trypanblauw en laad 10 μL van het mengsel op een celtellende glaas.
  13. Gebruik een celteller om levensvatbare cellen (ongekleurd) en niet-levensvatbare, permeabiliseerde positieve cellen (blauw gekleurd) te kwantificeren.
  14. Identificeer de laagste digitonineconcentratie die het hoogste aandeel trypanblauwe positieve cellen produceert. Gebruik deze concentratie voor het downstream CUT&RUN-experiment. Bevestig dat de DMSO-controle levensvatbaarheid behoudt die typisch is voor een normale gezonde celkweek.

3. CUT&RUN sequentie

OPMERKING: De reagentia in dit protocol zijn geschaald voor 5 reacties, met extra toegevoegd om pipetverliesrekening te compenseren. Voor een lijst van materialen en uitrusting, zie Tabel van Materiaal. Voor elk CUT&RUN-experiment worden minstens twee onafhankelijke biologische replicaten aanbevolen.

  1. Dag 1
    1. CUT&RUN buffervoorbereiding
      1. Bereid de Wash-buffer voor door Pre-Wash Buffer, 25x Protease Inhibitor en 1 M Spermidine te combineren zoals beschreven in Tabel 3.
      2. Bereid de celpermeabilisatiebuffer voor door 5% Digitonine toe te voegen aan de wasbuffer volgens tabel 3.
      3. Bereid de Antibody Buffer voor door 0,4 μL EDTA toe te voegen aan 100 μL Cell Permeabilization Buffer met de juiste digitonineconcentratie, zoals beschreven in Tabel 3. Leg de voorbereide buffer op ijs.
      4. Bewaar de resterende celpermeabilisatiebuffer bij 4 °C voor gebruik op dag 2.
    2. Activatie van Concanavaline A (ConA) kralen
      1. Suspenseer ConA voorzichtig weer op om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
      2. Breng 55 μL van de kralen-suspensie (11 μL per monster) over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      3. Plaats de buis op een 1,5 mL magnetisch rek totdat de kralen volledig zijn losgeraakt, en pipetteer dan om het supernatant te verwijderen.
      4. Was de kralen onmiddellijk twee keer met 500 μL ijskoude Bead Activation Buffer (100 μL per monster). Suspendeer de kralen opnieuw door zachtjes te pipetten voor elke wasbeurt en gebruik het magnetische rek om supernatant tussen de wasbeurten weg te gooien.
      5. Na de laatste wasbeurt verwijder je het supernatant en suspendeer je de geactiveerde kralen voorzichtig opnieuw in 55 μL (11 μL per monster) ijskoude Bead Activation Buffer.
      6. Haal 10 μL van de kralen in elke buis van een 8-strip buisset en houd de buizen op ijs.
    3. Oogst cellen en bind cellen aan geactiveerde kralen
      OPMERKING: Cellevensvatbaarheid is belangrijk voor de signaal/achtergrondverhouding. De levensvatbaarheid van SCLC NE-cellijnen kan echter variabel zijn (70%-90%) vanwege de van nature hoge celomzet en de voorkeur om als middelgrote tot grote aggregaten in suspensie te groeien.
      1. Haal de cellen uit de 37 °C incubator en bekijk ze onder een microscoop om de kwaliteit te waarborgen.
      2. Breng de celsuspensie over in een 50 mL conische buis en centrifugeer op 1.000-1.200 × g gedurende 5 minuten bij RT.
      3. Aspiraat het medium uit de kegelvormige buis en spoel de celpellet af met 20 mL 1× PBS.
      4. Centrifugeer opnieuw, aspireer het PBS en verteur het pelletje met Accutase 3-5 minuten bij 37°C, afhankelijk van de grootte van de pellet.
      5. Beëindig de spijsvertering door 5 mL PBS + 10% FBS toe te voegen. Verkrijg de single-cell suspension door voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipet.
      6. Centrifugeer de cellen op 1.000-1.200 × g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 5 mL PBS.
      7. Tel startcellen, bevestig de levensvatbaarheid en integriteit van de cel.
      8. Bereken het totale aantal benodigde cellen door het aantal reacties te vermenigvuldigen met het aantal cellen per reactie (5×105). Voeg 20% overtollig toe om rekening te houden met pipetfouten (bijv. 1,2 × 6 × 5 × 105 voor 6 reacties). Breng de berekende celsuspenties over naar 1,5 mL buizen. Centrifuge op 600 x g, 3 minuten op RT.
        OPMERKING: Bereid ten minste één extra reactie voor als back-up.
      9. Suspendeer de cellen opnieuw in RT Wash Buffer met een dichtheid van 5×105 cellen per reactie (in totaal zes reacties), met 100 μL per reactie, en geef zacht maar grondig pipetten om een uniforme suspensie te garanderen. Centrifugeer op 600 x g gedurende 3 minuten bij RT. Pipette om supernatant te verwijderen.
      10. Herhaal de wasstap (Stap 9) nog een keer.
      11. Geef 100 μL gewassen cellen aan elke buis in de 8-strip set met 10 μL geactiveerde CoA-kralen. Zachtjes met een pipetet om te mengen en snel te draaien in een mini-centrifuge om de slib op te vangen (kralen mogen niet bezinken).
      12. Incubeer de kraalcelsuspenis 10 minuten bij RT zodat cellen aan de kralen kunnen binden.
      13. Plaats buizen op een 0,2 mL buizenmagneetrek, laat de slib optrekken en pipetteer om supernatant te verwijderen. Bewaar 10 μL supernatant om te bevestigen dat cellen aan de kralen gebonden zijn. Gooi het resterende supernatant weg en ga snel door naar de volgende stap.
      14. Verwijder buizen uit de magneet. Voeg onmiddellijk 50 μL ijskoude Antibody Buffer toe aan elke reactie en pipetteer voorzichtig om de kralen opnieuw te laten ophangen.
      15. Meng 10 μL van zowel het supernatant als 10 μL van de cel/kraal-suspension (opnieuw gesuspendeerd in Antibody Buffer) met 10 μL trypanblauw en laad het mengsel op de celcounter-slide.
      16. Analyseer met een cellenteller. Controleer of de supernatant bijna geen kralen of cellen bevat, en dat het parel/celmengsel permeabiliseerde cellen bevat omringd door kralen.
        OPMERKING: Het is belangrijk om de compatibiliteit van de CoA-parelbindingen van de cellen te controleren.
    4. Permeabilisatie en antilichaambinding
      OPMERKING: Het succes van CUT&RUN hangt in belangrijke mate af van de affiniteit van het antilichaam voor zijn doelwit en de specificiteit onder specifieke experimentele omstandigheden. Wij raden het volgende aan: 1. Gebruik commerciële antilichamen die zijn gevalideerd voor CUT&RUN indien beschikbaar. 2. Voor doelen zonder door CUT&RUN gevalideerde antilichamen, overweeg die gevalideerd voor immunofluorescentie (IF), aangezien IF-antilichamen epitopen in hun oorspronkelijke cellulaire context herkennen, vergelijkbaar met in situ binding van antilichamen aan het doelwit binnen permeabiliseerde cellen in CUT&RUN. 3. Test 3-5 antilichamen parallel om de meest effectieve voor jouw specifieke toepassing te identificeren.
      1. Draai snel aan het K-MetStat paneel en pipetteer om opnieuw te hangen. Voeg 2 μL K-MetStat panel toe aan reacties die zijn aangewezen voor H3K4me3 positieve en IgG negatieve controle-antilichamen. Pipet om te mengen en snel te spinnen (optioneel).
      2. Voeg 0,5 μg elk van H3K4me3, H3K4me1 en IgG-antilichamen toe, en 0,6 μg van E2F7 polyklonale antilichamen uit verschillende bronnen aan elke reactie (Tabel 4). Label de 8-strip buizen.
      3. Pipetteer voorzichtig om elke reactiebuis goed te mengen. Broei 's nachts op 4 °C op een nutator met de buisdoppen verhoogd. Draai of draai de buizen niet om.
  2. Dag 2
    1. Binding van pAG-MNase aan antilichaam
      OPMERKING: Dat kralen 's nachts zakken is normaal en heeft geen invloed op het resultaat. Als de kralen na een nachtelijke incubatie klonterig of plakkerig worden, suspenderen ze dan opnieuw door zacht te pipetten. Om consistentie en doorvoer te verbeteren, wordt multikanaals pipetteren aanbevolen. Bij het gebruik van 8-strip buizen verwijder en vervang je buffers één strip tegelijk om te voorkomen dat ConA-kralen uitdrogen.
      1. Zet de magneetstandaard op ijs.
      2. Haal de 8-strip buizen uit de 4 °C incubatie en draai snel om vloeistof op te vangen.
      3. Plaats buizen op de magneetstandaard totdat de slurry weg is. Pipette voorzichtig en verwijder het supernatant.
      4. Zet buizen op de magneetstandaard. Was buizen twee keer met 200 μL koude cel permeabilisatiebuffer. Pipette om supernatant te verwijderen.
      5. Verwijder buizen van de magneetstandaard en voeg onmiddellijk 50 μL koude cel Permeabilisatiebuffer toe aan elke reactie. Zachtjes pipetteren om cellen/kralen opnieuw te suspenderen.
      6. Voeg 2,5 μL pAG-MNase toe aan elke reactie en meng goed door zachtjes te pipetten.
      7. Incubeer reacties 10 minuten bij RT.
      8. Draai snel de buizen rond, plaats ze terug op de magneetstandaard totdat de slurry verdwijnt. Pipette om supernatant te verwijderen.
      9. Buisjes op een magneetstandaard bewaren, was buizen twee keer met 200 μL koude cel permeabilisatiebuffer. Pipette om supernatant te verwijderen.
      10. Verwijder buizen van de magneetstandaard en sussen voorzichtig opnieuw in 50 μL koude cel Permeabilisatiebuffer. Leg de buizen op ijs.
    2. Gerichte chromatine-vertering en afgifte
      OPMERKING: Voer Ca2+-afhankelijke vertering uit bij 0 °C om ongewenste MNase-splitsing van toegankelijk DNA12 te minimaliseren. Neem spike-in DNA op, zoals Escherichia coli (E. coli), zodat het ongeveer 0,5-5% (idealiter ~1%) van de totale sequencing reads13 vertegenwoordigt. Spike-in DNA wordt gebruikt om de sequencingdiepte te normaliseren en is vooral belangrijk bij het vergelijken van monsters over een reeks, bijvoorbeeld bij het evalueren van de globale histoonmodificatieveranderingen na remming of genetische verwijdering van histonmodificerende enzymen.
      1. Voeg 1 μL 100 mM calciumchloride toe aan elke reactie in de 8-buisstrip (vanaf stap 3.2.1.10) terwijl je op ijs staat. Pipetteer voorzichtig om de kralen volledig te laten ophangen en een efficiënte vertering te garanderen.
      2. Incubeer de buizen op een nutator bij 4 °C gedurende 2 uur, met de afgesloten uiteinden omhoog.
      3. In een nieuwe 1,5 mL buis bereid je de Stop Buffer Mix. Voor elke reactie combineert u 33 μL Stop Buffer met 1 μL E. coli spike-in DNA (0,5 ng). Zachtjes vortexen om te mengen.
      4. Voeg aan elke reactie 33 μL stopbuffer toe aan het einde van de 2 uur incubatie. Meng door zacht te pipetteren.
      5. Incubeer de reacties in een thermocycler bij 37 °C gedurende 10 minuten.
      6. Snel de buisjes laten draaien om de inhoud onderin op te vangen, en plaats ze dan op een magneetrek totdat de oplossing helder is.
      7. Breng voorzichtig ongeveer 84 μL supernatant dat het door CUT&RUN vrijgegeven DNA bevat over in verse 1,5 mL buizen.
    3. DNA-zuivering met behulp van de DNA Purification Kit (zie Tabel van Materiaal)
      OPMERKING: Voeg vóór het eerste gebruik 6,9 mL isopropanol toe aan de DNA Binding Buffer en 20 mL ≥ 95% ethanol aan de DNA Wash Buffer.
      1. Voeg 420 μL DNA Binding Buffer toe aan elke verzamelde supernatant. Vortex kort om grondig te mengen.
      2. Plaats een DNA-opruimkolom in de verzamelbuizen.
      3. Laad elk monster op de overeenkomstige kolom.
      4. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 30 seconden bij RT. Verwijder de doorstroming en breng de kolom terug naar de verzamelbuis.
      5. Voeg 200 μL DNA-wasbuffer toe aan elke kolom en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 seconden bij RT. Verwijder de doorstroming en vervang de kolom in de verzamelbuis.
      6. Herhaal de wasstap één keer.
      7. Centrifugeer opnieuw op 16.000 x g gedurende 30 seconden bij RT om de resterende wash-buffer volledig te verwijderen.
      8. Schakel kolommen over naar gelabelde 1,5 mL buizen.
      9. Breng 12 μL Elution Buffer direct toe op het membraan in het midden van de kolom.
      10. Incubeer 5 minuten bij RT en centrifugeer dan bij 16.000 × g voor 1 minuut bij RT om het DNA te elueren.
        OPMERKING: Dit is een veilige stopplaats. Bewaar geëlueerd DNA bij -20 °C voor toekomstige verwerking.
    4. CUT&RUN DNA-kwantificatie en analyse van fragmentgrootteverdeling
      OPMERKING: Kwantificeer DNA met een fluorometer met de dsDNA High Sensitivity assay Kit, die nauwkeurigere metingen van dubbelstrengs DNA biedt dan absorptiegebaseerde methoden.
      1. Gebruik 1 μL van elk monster om de CUT&RUN DNA-concentratie te bepalen met behulp van de dsDNA High Sensitivity Assay Kit (zie Materiaaltabel).
      2. Gebruik een extra 1 μL DNA om de aanwezigheid en grootteverdeling van gespleten fragmenten te beoordelen. Voer fragmentanalyse uit met de High Sensitivity DNA Kit (zie Materiaaltabel) volgens de richtlijnen van de fabrikant (optioneel).
        OPMERKING: Zeer overvloedige bindende eiwitten, zoals histon post-translationele modificaties (PTM's), kunnen in deze stap gemakkelijk worden gedetecteerd. Echter, transcribiefactoren met lage abundantie kunnen moeilijker te detecteren zijn.
    5. Bibliotheekconstructie, fragmentanalyse en sequencing
      OPMERKING: ≤5 ng totaal CUT&RUN DNA, zoals bepaald door dsDNA High Sensitivity Assay Kit kwantificering, werd gebruikt voor de bouw van CUT&RUN next-generation sequencing (NGS) bibliotheken. Om adapterdimeren te minimaliseren, verlaag je de adapter van Illumina naar 1 μL voor de adapterligatie. Het aantal PCR-cycli tijdens de bouw van de bibliotheek kan worden aangepast op basis van invoerhoeveelheid, bibliotheekopbrengst en duplicatiesnelheid. Verschillende DNA-zuivering Magnetische Korrels (zie Tabel van Materiaal) grootteselectiestrategieën kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de doel-histon PTM's of transcriptiefactoren.
      1. De bibliotheekbouw werd gebouwd met behulp van de CUT&RUN-bibliotheekvoorbereidingskit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant van de kit, met kleine aanpassingen. Kort gezegd werd 5 ng CUT&RUN DNA gebruikt als aanbevolen input voor bibliotheekvoorbereiding. Voor DNA minder dan 5 ng, gebruik zoveel mogelijk voor bibliotheekvoorbereiding. Voor elk monster werden dubbele i5- en i7-indexprimers gebruikt om succesvolle multiplex-sequencing te garanderen.
        OPMERKING: Dit is een veilige stopplaats. Het DNA kan worden opgeslagen bij -20°C voor verdere verwerking.
      2. Meet de concentratie van de CUT&RUN-bibliotheek met een fluorometer en de dsDNA High Sensitivity Assay Kit. De grootteverdeling van de CUT&RUN NGS-bibliotheken werd bepaald met behulp van de High Sensitivity DNA Kit (zie Table of Materials) op basis van de High Sensitivity DNA Kit Guide of een vergelijkbaar capillair elektroforese-instrument TapeStation (zie Table of Materials).
        OPMERKING: Verdun de CUT&RUN-bibliotheek om de concentratie binnen het detectiebereik van de dsDNA High Sensitivity Assay Kit en de High Sensitivity DNA Kit te brengen.
      3. Poolbibliotheken (40-46) gebaseerd op gelijke moleculaire en unieke indexen. Na DNA-zuivering Magnetische Korrels groottekeuze werd een paired-end sequencing (100 bp leeslengte) uitgevoerd voor de gepoolde bibliotheken op een Illumina NovaSeq 6000-systeem voor een halve S-Prime (SP) met een leesdiepte van naar schatting 10 miljoen lezingen per bibliotheek.
    6. CUT&RUN data-analyse
      1. Analyseer CUT&RUN-gegevens met behulp van een aangepaste pijplijn (Figuur 5A). Beoordeel de leeskwaliteit met FastQC. Verwijder adaptersequenties vanaf het begin van de reads met Cutadapt. Aligned-pair reads naar het menselijk genoom (hg38) en het E. coli-referentiegenoom met Bowtie2. Gebruik Samtools om niet-toegewezen reads te verwijderen. Verwijder dubbele lezingen met Picard en genereer bedGraph-bestanden met Bedtools. Maak bigWig (bw) bestanden aan met DeepTools. Visualiseer de data met IGV en DeepTools. Normaliseer het totale aantal leespunten met de piek-in E. coli-leesaantallen. Voer peak calling uit met SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN)19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typische of "klassieke" SCLC NE-cellijnen worden gekenmerkt door grote kernen, weinig cytoplasma en groei als niet-hechtende aggregaten of compacte sferoïden in suspensie. ASCL1-hoge cellijnen, zoals NCI-H146 en DMS79, en NEUROD1-hoge cellijnen, zoals NCI-H82 en H446, vertonen dit klassieke SCLC-fenotype: kleine tot middelgrote cellen met weinig cytoplasma, fijnkorrelige chromatine en een neiging om voornamelijk te groeien als niet-hechtende aggregaten of compacte sferoïden. Hoewel NEURO...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische dysregulatie en LDTF's zijn belangrijke drijfveren van de tumorbiologie van SCLC6. Het bepalen van de genomische distributie van specifieke histonmodificaties en DNA-bindende eiwitten in SCLC kan potentiële mechanismen van verworven therapeutische resistentie en fenotypische plasticiteit onthullen. CUT&RUN-seq is een krachtige methode voor het in kaart brengen van histon- en niet-histoneiwit-DNA-interacties met hoge resolutie14

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door NCI K08CA241309 (PI: Hui-Zi Chen), ACS IRG Award (PI: Hui-Zi Chen) en American Lung Association Lung Cancer Discovery Award (PI: Hui-Zi Chen). De sequencing werd uitgevoerd bij het Linda T. and John A. Mellowes Center for Genomic Sciences and Precision Medicine. We danken ook alle laboratoriumleden voor hun inzichten en steun voor dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
RPMI-1640 media Gibco ThermoFisher Scientific11875093Celcultuur medium
Fetal Bovine Serum (FBS)NeuromicsFBS002-HIComponent van celcultuur medium
1% Penicillin-Sstreptomycin Gibco ThermoFisher Scientific15140122Antibiotica, om bacteriële besmetting van celculturen te voorkomen
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco ThermoFisher Scientific15250061Trypan Blue Staining werd gebruikt om permeabiliteit te evalueren met een geautomatiseerde celteller. 
Roche cOmplete, EDTA-free Proease Inhibitor CocktailRoche11873580001Proteïne remmer. Componenten van wasbuffer
5% Digitonin EpiCypher21-1004Buffer componenten  en buffer recept kan worden gevonden in het bufferblad
Beads activeringsbufferEpiCypher21-1001Buffer componenten  en buffer recept kan worden gevonden in het bufferblad
Concanavalin A (ConA) BeadsEpiCypher21-1401ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen zijn lectin-gecoate magnetische kralen die lipidemembraanbinding mogelijk maken
CUT&RUN Kit CUTANA ChIC EpiCypher14-1048Reagentia voor CUT&RUN DNA-generatie
DNA-zuiveringskitCUTANA  EpiCypher14-0050Extract DNA uit de vrijgekomen doelgerichte DNA-fragmenten in de supernatant in de reactie
CUT&RUN Library Prep KitCUTANA EpiCypher14-001Genereer de CUT&RUN next-generation sequencing (NGS) bibliotheken
 DNA zuiveringsmagnetische kralenAgencourt AMPure XP Beckman CoulterA63880PCR-product schoonmaken en maatselectie (d.w.z. adapter dimer en primer verwijdering)
E. coli Spike-in DNAEpiCypher18-1401Wordt gebruikt als een exogene spike-in om sequencing-reads over een reeks monsters te kalibreren—bijvoorbeeld, behandelde versus onbehandelde omstandigheden
pAG-MNaseEpiCypher 15-1016Bij binding aan het primaire antilichaam knipt het enzym het doelgerichte DNA-fragment aan beide kanten van het gebonden eiwit wanneer geactiveerd door calcium
PBS PH7.4 1xGibco (Thermo Fisher Scientific)10010-049Cellen wassen
Pre-Wash BufferEpiCypher21-1002Buffer componenten  en buffer recept kan worden gevonden in het bufferblad
dsDNA High Sensitivity  Assay KitQubitTM Thermo Fisher ScientificQ32854CUT&RUN DNA-kwantificering
Stop BufferEpiCypher21-1003Buffer componenten  en buffer recept kan worden gevonden in het bufferblad
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technoligies5067-4626CUT&RUN DNA- en NGS bibliotheken kwantificering en fragmentgrootteverdelingsanalyse
Materiaal
8-strip 0.2 mL PCR-buisjesEpiCypher10-0009kBuisjes voor CUT&RUN reacties, compatibel met de 0.2 ml buisjes Magnetische scheidingsrek
LUNA 8-kanaals slidesLogos BioSystems INCL72001Slides voor celtelling,  celviabiliteit en integriteitscontrole
Multi-kanaals reagentenreservoirFisher Scientific14-387-072Wasbuffer container
DynaMagTM-2 (Magnetische scheidingsrek), 1.5 mL buisjesThermo Fisher Scientific12321DConA-kralen werden geïsoleerd uit hun opslagbuffer door magnetische scheidingsrek en vervolgens geactiveerd door resuspenderen in activeringsbuffer in een 1.5 mL microcentrifugebuis.
Magnetische scheidingsrek, 0.2 mL buisjesEpiCypher10-0008Stand om  kralen-bindende cellen, antilichamen, pAG/MNase te scheiden van reactie- en wasbuffers
Eppendor Research plus 8-kanaals pipet, 0.5-10 uL Eppendorf3125000010Aspirate 8-strip buisjes' monsters  om de workflow te versnellen, vergelijkbaar multi-kanaals pipettor
Eppendorf Refrence 2 8-kanaals pipet, 30-300 uLEppendorf4926000050Aspiratie- en wasstappen om de workflow te versnellen, vergelijkbaar multi-kanaals pipettor
Apparatuur
Scientific Industries Vortex-Genie 2 Mixer, Variabele snelheid, 120VFisher Scientific50-728-002Min-centrifuge en spin
LUNA FX7 Automatische celtellerLogos BioSystems INCL70001Celteller
Nutating MixerVWR82007-202Kralen incubatiestappen (overnacht antilichaam incubatie, pAG-MNase-digestreactie).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler ThermocyclusEppendorf6331CUT&RUN next generation bibliotheekbouw
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226DNA-kwantificering.
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AFragmentgrootte, concentratie-analyse voor CUT&RUN DNA en CUT&RUN bibliotheken,  vergelijkbaar capillaire elektroforese-instrument (bijv. Agilent TapeStation)
Agilent TapeStationAgilent TechnologiesG2992AAFragmentgrootte, concentratie-analyse voor CUT&RUN DNA en CUT&RUN bibliotheken
Illumina NovaSeq 6000 systeem Illumina, San Diego, CA, VSSequencing van de gepoolde CUT&RUN bibliotheken 
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications-cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  4. Wang, Y., et al. STAT3 facilitates super enhancer formation to promote fibroblast-to-myofibroblast differentiation by the analysis of ATAC-seq, RNA-seq and ChIP-seq. J Cell Mol Med. 29 (11), e70639(2025).
  5. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol. 20 (1), 245(2019).
  6. Takumida, H., et al. Integrative epigenome and transcriptome analyses reveal transcriptional programs differentially regulated by ASCL1 and NEUROD1 in small cell lung cancer. Oncogene. 44 (34), 3113-3125 (2025).
  7. Sivakumar, S., et al. Integrative analysis of a large real-world cohort of small cell lung cancer identifies distinct genetic subtypes and insights into histologic transformation. Cancer Discov. 13 (7), 1572-1591 (2023).
  8. Rudin, C. M., et al. Author correction: Molecular subtypes of small cell lung cancer: A synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 19 (7), 415(2019).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  10. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  11. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, e21856(2017).
  12. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  13. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife. 8, e46314(2019).
  14. Custers, S., et al. Cleavage under targets & release using nuclease (CUT&RUN) protocols for the study of genetic and epigenetic regulation in cancer. Methods Mol Biol. 2944, 207-225 (2025).
  15. Hainer, S. J., Boskovic, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329.e11 (2019).
  16. Marroquin-Rivera, A., et al. Immune-related transcriptomic and epigenetic reconfiguration in BV2 cells after lipopolysaccharide exposure: An in vitro omics integrative study. Inflamm Res. 73 (2), 211-225 (2024).
  17. Huang, H., et al. Deciphering the role of histone modifications in memory and exhausted CD8 T cells. Sci Rep. 15 (1), 17359(2025).
  18. De Sarkar, N., et al. Nucleosome patterns in circulating tumor DNA reveal transcriptional regulation of advanced prostate cancer phenotypes. Cancer Discov. 13 (3), 632-653 (2023).
  19. Roberti, A., Fraga, M. F. Epigenomic profiling of histone posttranslational modifications in frozen cancer tissue using CUT&RUN. Methods Mol Biol. 2930, 229-243 (2025).
  20. Black, J. B., et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 33 (9), 108460(2020).
  21. Augert, A., et al. Small cell lung cancer exhibits frequent inactivating mutations in the histone methyltransferase KMT2D/MLL2: CALGB 151111 (Alliance). J Thorac Oncol. 12 (4), 704-713 (2017).
  22. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  23. Yang, Y., et al. H3K9me3 involved in FOXL2 regulation of SerpinE2 expression to affect steroid hormone synthesis in follicular granulosa cells. FASEB J. 39 (12), e70730(2025).
  24. Panday, A., Elango, R., Willis, N. A., Scully, R. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 3 (3), 101529(2022).
  25. Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease. J Vis Exp. (180), e63536(2022).
  26. Hsieh, T. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Mol Cell. 78 (3), 539-553.e8 (2020).
  27. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CUT And RUNchromatineremodelleringneuroendocriene cellijnenH3K4me3 profileringH3K4me1 enhancernext generation sequencingE2F7 transcriptiefactor

Gerelateerde artikelen