Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Regulatie van de AKT/Wnt/β-catenine-route en inductie van Cuproptose door curcumine bij glioblastoom

655 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

27 januari 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

In dit artikel

Samenvatting

Curcumine (CUM) remt de progressie van glioblastoom (GBM) door cuproptose te induceren via onderdrukking van de AKT/Wnt/β-catenine-as. Dit protocol onderzoekt het moleculaire mechanisme waarmee CUM de maligne progressie in GBM belemmert en beschrijft methoden om te evalueren hoe CUM cuproptose induceert door dit pad te moduleren.

Samenvatting

Curcumine (CUM) kan het kwaadaardige gedrag van glioblastoom (GBM) reguleren. Deze studie onderzoekt of CUM de voortgang van GBM onderdrukt door cuproptose te induceren via de AKT/Wnt/β-catenine signaalroute. Optimale curcumineconcentraties werden bepaald met behulp van de MTT-test. A172- en U251-cellen werden behandeld met CUM, AKT-remmer MK-2206, Wnt-remmer LGK974 en Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl2). Celproliferatie, migratie, invasie en apoptose werden respectievelijk beoordeeld met carboxyfluoresceïne succinimidyl aminoesterkleuring, scratch assays, Transwell assays en flowcytometrie. MitoSOX-fluorescentie, Seahorse-metabole analyse, immunofluorescentie, Cu2+- detectie en Western blotting werden gebruikt om mitochondriale oxidatieve stress en cuproptose te evalueren. De AKT/Wnt/β-katenine-as werd geanalyseerd met een TCF/LEF1 reporterkit en western blotting. Er werd een GBM-xenograftmodel opgesteld en CUM werd vijf weken lang toegediend via gavage. CUM-effecten op tumorgroei, cuproptose en de expressie van eiwitten in de AKT/Wnt/β-catenine-route werden geëvalueerd. Cellen werden behandeld met 10 μM en 20 μM CUM in vitro. CUM-behandeling verminderde proliferatie, migratie en invasie, terwijl het oxidatieve stress en cuproptose bevorderde. CUM onderdrukte ook de signaleringsactiviteit van Wnt/β-catenine. Remming van de routes verhoogde de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (3,7-voudig) en Cu2+ (3,1-voudig) niveaus, en verminderde de expressie van dihydrolipoamide acetyltransferase, waardoor kwaadaardig gedrag werd beperkt. Bij naakte muizen verminderde CUM de tumorgroei significant, bevorderde cuproptose en remde de activatie van de AKT/Wnt/β-catenine-as. Onze resultaten geven aan dat CUM de signalering van AKT/Wnt/β-catenine onderdrukt, cuproptose bevordert en de progressie van GBM belemmert.

Inleiding

Glioom is de meest voorkomende primaire intracraniële kwaadaardige tumor in het centrale zenuwstelsel (CZS). Graad 4 glioom verwijst meestal naar glioblastoom (GBM), met een slechte prognose2. GBM is een zeer invasieve hersentumor die bijna 50% van de maligniteiten van het zenuwstelsel uitmaakt, met een mediane overleving van minder dan 1 jaar3. Het staat bekend om zijn hoge maligniteit en hoge recidiefpercentagevan 4,5. Momenteel zijn GBM-behandelstrategieën voornamelijk gebaseerd op chirurgie, aangevuld met radiotherapie, chemotherapie en andere uitgebreide behandelmethoden6. Hoewel opkomende therapeutische strategieën zoals immunotherapie, biotherapie en nanomedicine opmerkelijke resultaten hebben opgeleverd in preklinische studies 7,8, blijft de totale 5-jaars overlevingskans slechts 4,3%. Het meest gebruikte chemotherapieregime is het bekende Stupp-regime; echter, voor GBM-patiënten met niet-gemethyleerde MGMT is de algehele overlevingskans niet significant verlengd,namelijk 10. Daarom is het verkennen van nieuwe behandelstrategieën van cruciaal belang om de overlevingstijd van patiënten te verlengen. Dit onderzoek stelt de hypothese dat het antikankermechanisme van curcumine (CUM) op GBM cuproptose betreft.

Abnormale koperstofwisseling of door koper veroorzaakte celschade kan leiden tot eenreeks ziekten. Onder conventionele redoxcondities kan gereduceerd Cu+ worden geoxideerd tot Cu2+. Tsvetkov et al. vonden een eerder onontdekt mechanisme van koper-geïnduceerde celdood, genaamd cuproptose. Cu2+-ionen binden aan geacyleerde verbindingen, waarna de expressie van Fe-S-clustereiwitten wordt gedownreguleerd, wat celdoodveroorzaakt 12,13. Uitgebreid onderzoek heeft bevestigd dat cuproptose nauw samenhangt met het pathofysiologische proces van tumoren14,15. Cuproptosis-gerelateerde lncRNA's en genen vertegenwoordigen potentiële biomarkers voor GBM-prognose en behandeling16. BCMD kan Cu2+ vrijgeven, cuproptose induceren en immunogene celdood veroorzaken om GBM17 te behandelen. Daarom geloven wij dat cuproptose als een nieuw doelwit voor GBM-therapie kan worden gebruikt. De meeste bestaande schema's vertrouwen echter op synthetische dragers zoals Elesclomol-Cu of directe inductie van koperionen met hoge concentratie. Hoewel deze exogene drastische interventie het concept van cuproptose kan bewijzen, zijn de mogelijkheden voor klinische transformatie beperkt door het gebrek aan fysiologische correlatie en targeting. Daarom is de zoektocht naar natuurlijke of kleinmolecuulverbindingen die endogeen en nauwkeurig de cuproptose van GBM kunnen reguleren en het upstream signaalmechanisme kunnen verduidelijken, een belangrijke brug geworden tussen dit nieuwe mechanisme en klinische behandeling.

Chinese geneeskunde wordt algemeen beschouwd als een waardevolle bron voor onderzoek naar antitumorgeneesmiddelen. CUM is een polyfenolische stof die wordt gewonnen uit traditionele Chinese medicijn kurkuma. De moderne farmacologie heeft bevestigd dat het antioxidatie-, ontstekingsremmende en antitumorfuncties heeft. CUM heeft veel antitumoractiviteiten. Het kan de activiteit van GBM-cellen verminderen door apoptose, verstoring van multimoleculaire routes en andere mechanismente bevorderen 18. In vitro-experimenten hebben aangetoond dat laag-dosis CUM gecombineerd met bestraling synergetisch deproliferatie van antiGBM kan versterken. Bovendien kan CUM kernpaden reguleren die gerelateerd zijn aan GBM, waaronder MAPK20. In vergelijking met traditionele temozolomide (TMZ) chemotherapie vertoont CUM unieke therapeutische voordelen. De effectiviteit van temozolomide wordt vaak beperkt door de krachtige DNA-reparatiemechanismen in GBM, wat leidt tot resistentie tegen geneesmiddelen; het mechanisme waarmee CUM cuproptose induceert door mitochondriale metabolisme21,22 te richten, is onafhankelijk van TMZ. CUM kan niet alleen de metabole processen die samenhangen met cuproptosis reguleren, maar ook tegelijkertijd interfereren met meerdere belangrijke signaalroutes die gerelateerd zijn aan GBM-progressie, wat potentiële wegen biedt om de beperkingen van enkele therapieën te overwinnen en gecombineerde behandelstrategieën te ontwikkelen. Het concentratiebereik van CUM dat in deze studie werd gebruikt (10-20 μM) komt overeen met de effectieve concentraties die zijn gerapporteerd in preklinische behandelingsstudies23. Hoewel de inherente lage orale biobeschikbaarheid van CUM en de efficiëntie van de toediening via de bloed-hersenbarrière belangrijke uitdagingen zijn in praktische toepassingen, hebben opkomende nanoafgiftesystemen en gerichte modificatiestrategieën veelbelovende oplossingen geleverd om deze bottleneck24 te overwinnen.

Hoewel de proapoptotische, antiproliferatieve en migratieremmende effecten van CUM in GBM in veel studies zijn gerapporteerd in 25,26, richt het merendeel van het bestaande onderzoek zich op de effecten ervan op traditionele apoptose- of autophagiepaden. Deze studie heeft als doel te verduidelijken of CUM de kwaadaardige progressie van GBM remt door cuproptose te reguleren. We onderzochten of CUM cuproptose deels kan induceren door de AKT/Wnt/β-catenine-as te onderdrukken, waardoor GBM wordt onderdrukt. Op basis hiervan biedt deze studie experimentele basis voor CUM om de behandeling van GBM te verbeteren en voor het ontwikkelen van nieuwe doelwitten in GBM-therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met vastgestelde institutionele normen voor de humane zorg en het gebruik van proefdieren en werden formeel goedgekeurd door de institutionele Animal Ethics Committee. Er werden maatregelen genomen om het ongemak en de stress van de dieren waar mogelijk te verminderen.

Werk met chemische verbindingen, kleurstoffen en biologische monsters volgde de gevestigde bioveiligheidspraktijken om potentiële risico's te beperken. Potentieel gevaarlijke stoffen – waaronder paraformaldehyde, koperhoudende reagentia en DHE – werden behandeld met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, mondkapjes en veiligheidsbrillen. Alle afvalmaterialen, zoals gebruikte reagentia en besmette wegwerpartikelen, werden gescheiden in aangewezen biohazard-containers en vervolgens behandeld door erkende diensten voor gevaarlijk afvalbeheer in overeenstemming met institutionele en milieuveiligheidsvoorschriften. Het algemene experimentele ontwerp is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1
Figuur 1: De workflow van deze studie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Celcultuur en groepering
Normale menselijke hersenastrocyten (NHA) en glioblastoomcellijnen A172, U251, LN229 en SHG-44 (zie Materiaaltabel) werden gekweekt in DMEM-medium met 10% foetaal rundereserum (FBS) en gehouden in een broedmachine op 3 °C met 5% CO₂. Het medium werd om de dag verwisseld en cellen werden doorgevoerd wanneer ze ongeveer 80% confluentie bereikten. De juiste dosis en blootstellingstijd voor CUM werden bepaald met behulp van de MTT-assay. NHA-, A172-, U251-, LN229- en SHG-44-cellen werden behandeld met verschillende concentraties (0, 2,5, 5, 10, 20 en 4 μM) CUM gedurende respectievelijk 24, 48 en 7 uur,23. Vervolgens werd 2 μL MTT-oplossing toegevoegd. Na h werd 15 μL dimethylsulfoxide aan elke put toegevoegd en zachtjes gemengd. Optische dichtheid (OD) bij 45 nm werd gemeten met een microplaatlezer. Onbehandelde cellen (controlegroep) werden in alle experimenten als negatieve controles gebruikt.

A172- en U251-cellen werden gezaaid en verdeeld in groepen: Controle, CUM lage dosis (1 μM), CUM hoge dosis (2 μM), AKT-remmer (MK-2206), AKT remmer + Wnt remmer (MK-2206 + LGK974) en Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), gebaseerd op behandelvoorwaarden. Cellen in de CUM-groepen werden behandeld met 10 of 2 μM CUM gedurende 4 uur. Cellen in de MK-2206 groep ontvingen 1 μM MK-2206 gedurende 2 uur. Cellen in de MK-2206 + LGK974 groep werden behandeld met μM LGK974 voor h na blootstelling aan MK-2206. Elsm-Cu groepcellen werden behandeld met 100 nM Elesclomol en μM CuCl₂ gedurende 4 uuren 14.

Flowcytometrie
Gekweekte A172- en U251-cellen in elke groep werden 1 minuut lang geïncubeerd met PBS met 1 μg/mL PI-kleuringsoplossing. Cellen werden vervolgens behandeld met 0,25% trypsine en verzameld door centrifugatie (20 × g, min, kamertemperatuur). PI-positieve cellen werden gedetecteerd met een flowcytometer met een PE-kanaal (excitatie bij 488 nm), en het celsterftecijfer werd berekendop 27.

Carboxyfluoresceine succinimidyl aminoester (CFSE) assay
A172- en U251-cellen werden 1 minuut in het donker geïncubeerd met μmol/L CellTrace CFSE-kleurstof bij 3 °C. Het medium werd vervolgens geneutraliseerd en cellen werden gecentrifugeerd op 20 × g voor een minuut bij kamertemperatuur. Na de verzameling werden de cellen gekweekt en behandeld volgens hun groepering. De fluorescentieintensiteit van CFSE werd geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (excitatie bij 488 nm)27.

Celklonvormingsassay
Gekweekte A172- en U251-cellen werden verteerd, opnieuw opgehangen en geteld. Twee milliliter van de voorbereide celophanging werd toegevoegd. Na zacht mengen werden de cellen ongeveer 14 dagen geïncubeerd. Cellen werden vervolgens 3 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde, waarna het fixatiemiddel werd weggegooid. Na het beitsen met 0,1% kristalviolet. Er werden koloniebeelden vastgelegd en het kloonvormingspercentage werd berekendop 14.

Celkrastest
A172- en U251-cellen (1 × 106 cellen/put) werden gekweekt totdat ze 90% confluentie bereikten. De celmonolaag werd eenmaal bekrabd met een steriele 2 μL tip om een wond te creëren en vervolgens behandeld met verschillende concentraties CUM voor h en 48 uur. Beelden werden vastgelegd met een microscoop. De genezingssnelheid van de kras werd geëvalueerd met behulp van ImageJ-software. Afbeeldingen werden omgezet naar 8-bits formaat, een uniforme drempel werd ingesteld om het krasgebied van het cellenoppervlak te onderscheiden, en de krasgebieden op 0 uur en 48 uur werden berekend met de functie Deeltjes Analyseren . Krasgenezingssnelheid (%) = (0 uur afstand − 48 uur afstand) / 0 uur afstand × 100%23.

Transwell-experiment
A172- en U251-cellen werden blootgesteld aan de gespecificeerde behandelingen, vervolgens enzymatisch losgekoppeld en gecentrifugeerd op 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden opnieuw opgehangen in een serumvrij medium. Matrigel werd verdund in een verhouding van 1:8 in serumvrij medium, grondig gemengd, en 5 μL werd aangebracht in de bovenste kamer van een Transwell-insert, gevolgd door een incubatie van 4 uur. In totaal werden 5 × 10 4-cellen per put toegevoegd aan de bovenkamer, terwijl 60 μL medium aangevuld met 20% FBS in de onderste kamer werd geplaatst. Na 48 uur incubatie werden de cellen gefixeerd met paraformaldehyde en gekleurd met kristalviolet. Vijf gezichtsvelden werden geselecteerd uit het midden en de periferie van elke put. Cellen werden onder een microscoop geobserveerd en in beeld genomen. Invasieve cellen werden berekend met behulp van ImageJ. Beelden werden omgezet naar 8-bits formaat, drempels werden toegepast om gekleurde cellen van de achtergrond te onderscheiden, en de functie Deeltjes analyseren telde cellen die door het membraan23 waren gemigreerd.

Detectie van mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP)
Gekweekte A172- en U251-cellen in elke groep werden 30 minuten in het donker geïncubeerd met mL JC-1 werkoplossing. Cellen werden voorzichtig gewassen met voorgekoelde JC-1 buffer, waargenomen en gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop. Met 488 nm excitatie werden JC-1 polymeer- en monomeersignalen verzameld met respectievelijk 590 nm en 530 nm emissiefilters. De rood/groene fluorescentieverhouding (JC-1 aggregaten tot monomeren) werd geanalyseerd met ImageJ-software om MMP-veranderingen28 te evalueren. Beelden van rode en groene kanalen werden afzonderlijk geëxtraheerd en de gemiddelde fluorescentieintensiteit in hetzelfde gebied werd gekwantificeerd.

Detectie van zuurstofverbruikssnelheid (OCR)
Gekweekte A172- en U251-cellen werden gezaaid. De plaat werd in een voorverwarmde analyzer geplaatst bij 3 °C ter aanpassing. Na aanpassing werd het bepalingsmedium toegevoegd. Na automatische kalibratie werd de plaat 15-2 minuten in evenwicht gebracht bij 3 °C zonderCO2. De basislijn OCR werd gemeten en het assayprogramma werd ingesteld om mitochondriale OCR op bepaalde intervallen te registreren. Gegevens werden geëxporteerd voor latere analyse28.

MitoSOX fluorescentieprobe detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS)
A172- en U251-cellen werden aangepast naar een dichtheid van 1 × 104 cellen/mL, en 1 mL per put werd in een confoce schotel geplant, waarna de medicatieinterventie werd uitgevoerd. De celsupernatant werd weggegooid en 1 mL verdunde MitoSOX-probe (1:1.000) werd toegevoegd. Cellen werden in het donker geïncubeerd bij 3 °C gedurende 1 minuut. Het fluorescentiesignaal werd vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop (excitatie/emissie: 510/580 nm) om mitochondriale ROS-niveaus29 te beoordelen.

Immunofluorescentie
Dekfolies zijn één keer gewassen met DMEM-kweekmedium. Vervolgens werden ze geplaatst in zes-put platen voor celzaaiing en medicijninterventie. Na 24 uur werden de cellen vastgesteld in 4% paraformaldehyde en vervolgens 30 minuten geblokkeerd met 5% bovin serumalbumine (BSA). De blokkerende oplossing werd verwijderd en verdunde primaire antilichamen gericht op dihydrolipoamide acetyltransferase (DLAT) en β-catenine werden toegepast, gevolgd door een nachtelijke incubatie bij °C30. Fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen werden vervolgens geïntroduceerd en 30 minuten geïncubeerd bij 3 °C. Celkernen werden tegengekleurd met DAPI en de glaasjes werden gemonteerd met een antifade-reagens. Fluorescentiebeelden werden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop en de signaalintensiteit werd gekwantificeerd met ImageJ-software. Beelden werden omgezet naar 8-bits formaat en er werd een consistente drempel toegepast om doelsignalen van achtergrondruis te onderscheiden. Het rechthoekgereedschap werd gebruikt om de gewenste celgebieden te selecteren, en de gemiddelde fluorescentieintensiteit werdgemeten tot 27. Om mitochondriën te visualiseren, werden cellen behandeld met 20 nM MitoTracker Red CMXRos gedurende 30 minuten en vervolgens gefixeerd met paraformaldehyde30.

TCF/LEF1 luciferase verslaggever kit
De activatie van Wnt/β-catenine binnen A172- en U251-cellen werd beoordeeld met behulp van een TCF/LEF1 luciferase-rapportagekit. De TCF/LEF reportervector bevat een TATA-box en T-celfactor/lymfoïde versterkerfactor (TCF/LEF) responselementen, waardoor indirecte detectie van β-catenine transcriptieactiviteit via de expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) mogelijk is. Gekweekte A172- en U251-cellen werden omgekeerd getransfecteerd met 5 ng TCF/LEF-rapportagevector. Zestien uur na transfectie werd de fluorescentieintensiteit geregistreerd met een microplaatlezer met excitatie- en emissieinstellingen van respectievelijk488 en 51 nm.

Tumordragende muizen
Tien mannelijke BALB/c naakte muizen (7 weken oud, 2 ± 2 g) werden onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden (2 °C, 65% luchtvochtigheid) onderhouden met onbeperkte toegang tot standaard voedsel en water. Alle procedures zijn goedgekeurd door de Ethische Beoordelingscommissie van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van de Yangtze Universiteit (nr. 2023092; goedkeuringsdatum: 18-10-2023).

Om een GBM-xenograftmodel vast te stellen, werden A172-cellen (4 × 106 cellen/mL) opgehangen in serumvrij medium, en 0,1 mL werd subcutaan in de rechterflank van elke muis geïnjecteerd. Dieren werden willekeurig toegewezen aan een controlegroep of een CUM-behandelgroep (n = 5 per groep). De CUM-groep kreeg dagelijks 60 mg/kg curcumine via orale gavage, terwijl de controlegroep een gelijke hoeveelheid zoutoplossing kreeg. De tumordiameters werden elke 7 dagen geregistreerd met een vernierremklauw, en het tumorvolume werd berekend met de formule 1/2 × lengte × breedte2 (mm3). Na 5 weken werden muizen geëuthanaseerd door cervicale dislocatie, en werden tumoren onder steriele omstandigheden geoogst voor gewichtsmeting32.

TUNEL-assay
Tumorweefsels werden 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd in ethanol, ingebed in paraffine en gesneden op μm-dikte. Secties werden ontwaxd en gerehydrateerd, afgespoeld met PBS, behandeld met proteïnase K gedurende 50 minuten voor antigeenextractie, en geïncubeerd met 3% waterstofperoxide. TUNEL-reactiemengsel werd 1 uur aangebracht, gevolgd door een montage met een antifade-reagens. Fluorescentiebeelden werden met microscopie gemaakt en TUNEL-positieve cellen per veld werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.

Immunohistochemie
Paraffine-ingebedde tumorsecties werden gebakken op 6 °C, gedewaxed in xyleen en gerehydrateerd via een gegradueerde ethanolreeks. Antigeenwinning werd uitgevoerd met behulp van een verwarmde EDTA-buffer, gevolgd door het afkoelen van endogene peroxidaseactiviteit. De preparaten werden 's nachts geïncubeerd met het primaire antilichaam van het anti-Ki-67 bij °C. Na 20 minuten incubatie met een secundair antilichaam werden secties 5 minuten gekleurd met diaminobenzidine (DAB) en tegengekleurd met hematoxyline. Na dehydratie en montage met neutrale hars werden de glaasjes onder een microscoop gefotografeerd. Positieve kleuring werd vastgesteld met bruin-gele precipitaat, en Ki-67-positieve cellen werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ27.

Dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleuring
ROS-niveaus werden beoordeeld met DHE-fluorescentiekleuring. Bevroren tumorweefselsecties werden uitgespoeld met PBS. Achtergrondfluorescentie werd afgekoeld en μM DHE werd aan elke sectie toegevoegd gedurende 3 minuten. Na het wassen van PBS werden de delen in het donker verzegeld. Fluorescentie werd waargenomen met een microscoop (excitatie/emissie: 518/605 nm), en er werden vijf willekeurige beelden per groep verzameld. ImageJ werd gebruikt om ROS-niveaus te kwantificeren.

Cu2+ inhouddetectie
De concentratie Cu2+ in GBM-cellen en tumorweefsels werd beoordeeld met behulp van een colorimetrische detectiekit. A172- en U251-cellen werden na de behandeling geoogst en gecentrifugeerd bij 1.500 × g gedurende 10 minuten bij °C. Celpellets werden opnieuw opgehangen in 0. mL gedestilleerd water, gesoniceerd op ijs en opnieuw gecentrifugeerd. Tumorweefsels werden gehomogeniseerd in gedestilleerd water en op vergelijkbare wijze gecentrifugeerd bij 4 °C gedurende 10 minuten. Supernatanten (1 μL) werden overgebracht naar een 96-wellplaat, gemengd met 23 μL chromogeen reagens, verzegeld en 5 minuten geïncubeerd. Optische dichtheid (OD) werd gemeten op 58 nm met een microplaatlezer, en Cu2+ niveaus werden berekendop 14.

Westelijke Vlek (WB)
Eiwitten werden geïsoleerd uit gekweekte cellen en tumorweefsels. Supernatanten werden verkregen via centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C, en eiwitconcentraties werden gekwantificeerd met een BCA-assay. Na denaturatie werden de monsters gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar PVDF-membranen en 1 uur geblokkeerd met 5% magere melk. De membranen werden gewassen in TBST en 's nachts geïncubeerd bij °C met primaire antilichamen tegen FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-catenine, p-β-catenine en β-actine (zie de Materiaaltabel)14,33. Na aanvullende TBST-wasbeurten werden membranen 1 uur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen, ontwikkeld met ECL-reagens en visualiseerd door chemiluminescentie. ImageJ-software werd gebruikt om signaalintensiteit te kwantificeren met behulp van de Rectangle-selectietool en de Gels-analysefunctie. Relatieve eiwitexpressie werd berekend als de verhouding van de grijze waarde van de doelband tot de interne controle (GAPDH). Nucleaire extracten uit A172- en U251-cellen werden bereid met een nucleaire eiwitextractiekit. De expressie van β-catenine en Lamin B1 werd beoordeeld, waarbij Lamin B1 diende als nucleaire belastingsregeling34.

Statistische analyse
Kwantitatieve resultaten weerspiegelen het gemiddelde van drie onafhankelijke replicata. Alle gegevens werden beoordeeld op normale verdeling en homogeniteit van variantie. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc-test werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Een P-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Deze procedures werden gebruikt om datarobuustheid te waarborgen en de betrouwbaarheid van conclusies te ondersteunen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Remming van de levensvatbaarheid van GBM-cellen en geïnduceerde celdood
Ten eerste was er geen significante verandering in de levensvatbaarheid van NHA-cellen na 2 uur, 48 uur en 72 uur CUM-interventie (Figuur 2A), wat aangeeft dat de gebruikte CUM-concentraties geen toxisch effect hadden op normale cellen. Daarentegen was de levensvatbaarheid van GBM-cellijnen (A172, U251, LN229 en SHG-44) significant verminderd bij CUM-concentraties ≥ 1 μM (P < 0,05-0,001) (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het recidiefpercentage van GBM is geassocieerd met zijn kwaadaardige biologische kenmerken36. CUM oefent anti-GBM-effecten uit door oxidatieve stress, apoptose, autofagie, metastase, invasie en belangrijke moleculaire doelen te reguleren37. In deze studie toonden cellulaire experimenten aan dat CUM de sterfte van GBM-cellen significant verhoogde en proliferatie, kolonievorming, migratie en invasie remde – bevindingen die overeenkomen met ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Geen enkele

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% crystal violet staining solutionServicebioG1014Labeling cells
4% paraformaldehydeBeyotimeP0099Fix cells or tissues
AKT inhibitor (MK-2206)Selleck.cn, Shanghai, ChinaS1078Specific AKT inhibitor
Antibodies (primary and secondary antibodies)ABclonal Technology, Wuhan, China / abcam, Cambridge, UK / Servicebio, Wuhan, China / Beyotime, Shanghai, China / Cell Signaling, Danvers, MA, USAA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Detection of protein expression levels
Cell apoptosis detection kitServicebio, Wuhan, ChinaG1021Detection of apoptosis
Cell Trace CFSE dyeInvitrogen,Carlsbad, CA, USAC34570Cell proliferation detection
Chemiluminescence imaging systemBio-Rad, Hercules, CA, USAChemi Doc XRS+Ultra-high sensitivity detection of protein
Cu2+ colorimetric assay kitElabscience, Wuhan, ChinaE-BC-K300-MDetection of Cu2+ content in tumor tissues and GBM cells
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany751944Cuproptosis inducer
Curcumin (CUM)Shanghai source leaf, Shanghai, ChinaS19245Polyphenolic compound
DHE detection kitBeyotime, Shanghai, ChinaS0063Detection of ROS levels
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ServicebioG4101-2Solvent for MTT assay
ECL developerServicebioG2161Used for Western blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Cuproptosis inducer
Flow cytometryBD Biosciences, New Jersey, USABD FACSAria IIIUsed for cell death and CFSE assays
Fluorescence microscopeOLYMPUS, Tokyo, JapanIX73Used for Immunofluorescence, ROS, TUNEL, DHE and MMP assays
Glioblastoma cell lines A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) and SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Human glioblastoma cell lines
GraphPad Prism 9.0 softwareGraphPad Software, LLCVersion 9.0Statistical analysis
ImageJ 1.53k softwareNational Institute of Mental HealthVersion 1.53kstatistical calculation
JC-1 working solutionSolarbio, Beijing, ChinaM8650Detection of MMP
Male BALB/c nude miceSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, ChinaMouse experiment
Microplate readerBio-Tek, Vermont, USAELX-800For OD450 nm value measurement
MicroscopeOLYMPUSBX53Used for cell scratch test, Transwell experiment, and immunohistochemistry assays
MitoSOX probeThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAM36008Used for ROS detection
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Specific labeling of mitochondria in living cells
MTT detection kitServicebioG4101-1Detection of cell viability
Normal human brain astrocyte NHA cells (RRID:CVCL_B0DK )Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaHTX2408Cell line for control experiments
Nuclear protein extraction kitBeyotimeP0027Nuclear protein extraction
Seahorse cell energy metabolism analyzerAgilent,  Beijing, ChinaSeahorse XFUsed for OCR detection
TCF/LEF1 luciferase reporter kitBiolab Technology Co., Ltd, Beijing, ChinaDetection of the activity of Wnt/β-catenin signaling pathway
TUNEL detection kitBeyotimeC1088Detection of apoptosis in tumor tissues
Wnt inhibitor (LGK974)Selleck.cnS7143Specific Wnt inhibitor

Referenties

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Curcumine GlioblastoomAKT routeWnt Beta CatenineInductie van CuproptoseCelproliferatieCelmigratieMitochondriale Oxidatieve StressFlowcytometrieWestern BlotXenograftmodel

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.