Visualisatie van leeftijdsafhankelijke elektrotaxis van stamcellen afkomstig van menselijke vetstoffen onder gelijkstroomvelden

Summary

In een kleine groep vrouwelijke donoren verminderde veroudering de elektrotactische migratie van hADSC's. DCEF veranderde genexpressie (747 omhoog, 624 omlaag), verrijkte natriumtransport/kanaal GO-termen en PI3K-Akt KEGG-routes, wat wijst op betrokkenheid bij leeftijdsgebonden elektrotaxis, zonder causaliteit vast te stellen.

Abstract

Stamcellen afkomstig van humane vetstoffen (hADSC's) zijn essentieel voor weefselregeneratie en wondgenezing, en hun gerichte migratie is een voorwaarde om deze therapeutische effecten te kunnen uitoefenen. Elektrische velden (EF's) worden goed herkend als belangrijke aanwijzingen die celmigratie tijdens wondherstel sturen, maar het elektrotactisch gedrag van hADSC's – vooral hoe donorkenmerken (bijv. leeftijd) dit gedrag en de onderliggende moleculaire mechanismen reguleren – blijft slecht begrepen. Deze kenniskloof beperkt de geoptimaliseerde toepassing van hADSC's in regeneratieve geneeskunde. In deze studie valideerden we eerst het bestaan van elektrotaxis in hADSC's en bevestigden we de spanningsafhankelijkheid: onder gelijkstroomvelden (DCEF's) van 100-200 mV/mm migreerden hADSC's richtingsgebonden naar de anode, met sterkere EF-intensiteiten die zowel migratierichting als snelheid verhoogden (in tegenstelling tot 0 mV/mm controle). Vervolgens vergeleken we hADSC's van jonge vrouwelijke donoren (27,00 ± 4,58 jaar) en oudere vrouwelijke donoren (62,33 ± 4,04 jaar) met RNA-sequencing (RNA-seq) na 200 mV/mm DCEF-stimulatie. Transcriptomische analyse identificeerde 747 upregulatieve en 624 downgereguleerde genen in oudere hADSC's, met differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) verrijkt in biologische processen/routes die cruciaal zijn voor elektrotaxis – waaronder natriumiontransmembraantransport, spanningsgestuurde natriumkanaalactiviteit (GO-termen) en de PI3K-Akt signaalweg (KEGG-route). Functioneel vertoonden oudere hADSC's significant verminderde anodale migratie (verminderde opgebouwde afstand, Euclidische afstand en directheid) vergeleken met jonge hADSC's onder DCEF-stimulatie. Deze studie levert het eerste bewijs van leeftijdsafhankelijke elektrotaxis in hADSC's en toont aan dat donorleeftijd correleert met een verminderde elektrotactische capaciteit. Het onthult verder dat de disreguliere natriumkanaalactiviteit en PI3K-Akt-signalering mogelijk ten grondslag liggen aan deze leeftijdsgerelateerde achteruitgang. Deze bevindingen wijzen op de mogelijke regulerende mechanismen van hADSC-elektrotaxis en bieden nieuwe inzichten voor het afstemmen van op hADSC-gebaseerde therapieën (bijvoorbeeld het selecteren van optimale donoren of het richten op natrium/PI3K-Akt-routes) om weefselregeneratie en wondgenezing te verbeteren.

Introduction

Adipos-afgeleide stamcellen (ADSC) beschikken over een sterk zelfvernieuwingsvermogen en een aanzienlijk regeneratief potentieel. Onder geschikte inductieomstandigheden kunnen ze differentiëren in osteoblasten, chondrocyten en adipocyten, onder andere¹. Via paracriene signalering kan ADSC ook de vorming van bloedvaten en lymfevaten^{ondersteunen 2,3}, littekenvorming remmen⁴ en immuunregulerende effecten vertonen⁵. Daarom wordt ADSC beschouwd als een ideale zaadcel voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde.

De functie van ADSC wordt beïnvloed door verschillende donorkenmerken, die hun potentiële effectiviteit in celtherapieën kunnen beïnvloeden, waaronder donorleeftijd, body mass index, geslacht en andere⁶. ADSC afkomstig van oudere donoren vertoont meer uitgesproken verouderingskenmerken, met een verminderd adipogenisch differentiatiepotentieel, osteogeen differentiatiepotentieel en migratiecapaciteit ^7,8,9. Bovendien is het vermogen om keratinocytproliferatie te bevorderen en de zelfherstelmechanismen van het lichaam te stimuleren¹⁰ verminderd.

Celgerichte migratie is een belangrijk fysiologisch mechanisme bij wondgenezing en weefselregeneratie, waarbij elektrische velden (EF's) een belangrijke rol spelen in het sturen van celmigratie en het bevorderen van wondherstel¹¹. Wanneer bijvoorbeeld de epitheelbarrière beschadigd is, worden er onmiddellijk endogene elektrische velden gegenereerd die aanhouden totdat de wond geneest en de epitheelbarrièrefunctie wordt hersteld 12,13,14. Als een van de signalen die gerichte celmigratie sturen, is aangetoond dat elektrische signalen een hogere prioriteit hebben dan andere co-bestaande signalen, zoals contactremming, mechanische krachten en chemotactische factoren^15,16. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om wondgenezing en weefselregeneratie te bevorderen, bijvoorbeeld via medicijnen en externe elektrische stimulatieapparaten die de endogene elektrische velden in het menselijk lichaam versterken of nabootsen^17,18. Het vermogen van cellen om te migreren volgens een elektrische veldgradiënt staat bekend als elektrotaxis. In vitro-studies hebben aangetoond dat veel verschillende celtypen in staat zijn tot gerichte migratie in elektrische velden. Sommige cellen migreren naar de anode, zoals zoogdierlijke hersenneurale crestcellen, menselijke astrocyten en menselijke borstkankercellen 19,20,21. Andere cellen migreren naar de kathode, zoals menselijke niertubulaire epitheelcellen, menselijke dermale fibroblasten en menselijke neutrofielen 22,23,24. ADSC kan worden geleid om naar de anode te migreren in gelijkstroomvelden (DC), en onder langdurige kweekomstandigheden is aangetoond dat exogene gepulseerde elektrische stroom effectief de directionele migratie van ADSC naar de anode bevordert, terwijl cellevensvatbaarheid^{behouden blijft}. Tot op heden zijn studies naar de elektrotaxiskenmerken van stamcellen afkomstig van humane vetstoffen schaars, en zijn de onderliggende mechanismen die hun elektrotactisch gedrag reguleren nog niet volledig begrepen.

Wij zijn de eersten die systematisch leeftijdsafhankelijke elektrotactische verschillen in hADSC's van jonge versus oudere vrouwelijke donoren onder gradiënt gelijkstroom-elektrische velden (DCEF) onderzoeken, en die verder de onderliggende mechanismen (betrokken bij natriumkanaalactiviteit en PI3K-Akt-signalering) blootleggen met behulp van transcriptomische analyse. In deze studie onderzochten we de effecten van DCEF op hADSC's. Met behulp van RNA-sequencing en differentiële genverrijkingsanalyse vergeleken we genexpressieprofielen tussen twee hADSC-groepen – afgeleid van jonge en oudere vrouwelijke donoren – na DCEF-stimulatie om leeftijdsgebonden transcriptieverschillen te identificeren. We stelden de hypothese op dat donorveroudering de elektrotactische responsiviteit van hADSC's aantast, en dat deze leeftijdsgerelateerde achteruitgang verband houdt met veranderde natriumkanaalactiviteit en PI3K-Akt-signalering.

Protocol

Geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de weefselverzameling. Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de China Medische Universiteit (Goedkeuringsnr.: [2018]2018-110-2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de weefselverzameling

hADSC-isolatie en cultuur
Weefselverzameling: Menselijke buikvetweefselmonsters werden afgenomen tijdens routinematige electieve liposuctieprocedures die werden uitgevoerd op de afdeling Plastische Chirurgie van het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de China Medical University. Alle donoren waren gezonde vrouwelijke vrijwilligers die cosmetische buikliposuctie ondergingen, en er werden geen aanvullende chirurgische ingrepen uitgevoerd voor onderzoeksdoeleinden. Weefselmonsters werden direct na aspiratie door de opererende chirurg onder steriele omstandigheden verzameld en binnen 30 minuten in steriele containers op ijs naar het laboratorium gebracht.

Steekproefgrootte: In totaal werden 6 donoren in deze studie opgenomen, bestaande uit 3 jongere donoren (leeftijd: 27,00 ± 4,58 jaar) en 3 oudere donoren (leeftijd: 62,33 ± 4,04 jaar).

Weefselverwerking: Verwijder vetweefselfragmenten in een 50 mL conische buis, centrifugeer op 1.800 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, en aspireer voorzichtig de bovenste oliefase (om overtollige lipiden te verwijderen). Voeg 0,2% collagenase Type IV toe (eindvolume: 5-10 mL per 1 g vetweefsel) aan de weefselpellet, en plaats de buis vervolgens 45 minuten in een 37 °C waterbad of incubator. Beweeg de tube voorzichtig elke 10-15 minuten tijdens de spijsvertering om een gelijkmatig contact tussen collagenase en weefsel te garanderen. Na de vertering wordt de reactie beëindigd door een low-glucose DMEM toe te voegen, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine (volumeverhouding van neutralisatiemedium tot collagenaseoplossing = 1:1).

VOORZICHTIG: Draag bij het hanteren van collagenase wegwerphandschoenen, een labjas en veiligheidsbril om huid- en oogcontact te vermijden, bereid het reagens voor en gebruik het in een biologische veiligheidskast (BSC) om aerosolbesmetting te voorkomen, en bij mors, veeg onmiddellijk af met 75% ethanol en doe besmet materiaal als biologisch afval.

Celisolatie: Centrifugeer het geneutraliseerde verteringsmengsel op 1.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleten. Verwijder het supernatant, suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in een erytrocytenlysebuffer (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; volume: 2-3 mL per pellet) en incubeer bij kamertemperatuur (22-25 °C) gedurende 5 minuten om resterende rode bloedcellen te lyseren. Filter de celsuspensie sequentieel door 200 μm zeefjes om onverteerd weefselafval te verwijderen en een single-cell suspension te verkrijgen.

Celtelling: Voor het zaaien werden celnummers gekwantificeerd met een hemocytometer. Kort gezegd werden hADSC's losgemaakt met 0,25% trypsine-EDTA, opnieuw gesuspendeerd in groeimedium en 1:1 gemengd met 0,4% trypanblauwe oplossing. Levensvatbare cellen (niet-gekleurd) werden handmatig geteld met een Neubauer-hemocytometer onder een lichtmicroscoop, en het totale aantal levensvatbare cellen werd berekend als: celaantal/mL = (gemiddeld getelde cellen x verdunningsfactor x 10⁴).

Celcultuur: Zaad de gefilterde cellen met een dichtheid van 5 x 10^{3 cellen}/^cm2 in groeimedium (DMEM met weinig glucose + 10% FBS + 1% penicilline/streptomycine) en incubeer bij 37 °C met 5% CO-2. Vervang het medium elke 2-3 dagen om niet-hechtende cellen te verwijderen en optimale kweekomstandigheden te behouden. Alle hADSC's die voor latere experimenten werden gebruikt – inclusief celkarakterisering (oppervlaktemarkeringsdetectie, trilineagedifferentiatie-assays), DCEF-stimulatie, migratie- en morfologieanalyse, senescence/proliferatie-assays en RNA-sequencing – bevonden zich bij passage 3 tot passage 5.

hADSC-karakterisering
Expressie van celoppervlakmarkers: Kweek cellen tot 70% confluentie, en dissocieer vervolgens adherente cellen met 0,25% trypsine-EDTA (incubeer bij 37 °C gedurende 3 minuten). Centrifugeer de celsuspensement op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 1x PBS (volume: 1-2 mL). Aliquot 1 x 10⁵ cellen per monster (opnieuw gesuspendeerd in 100 μL van 1x PBS) en voeg fluorescentief-geconjugeerde antilichamen toe bij de gespecificeerde verdunningen: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) en anti-CD105 (1:20)^1,4,7. Incubeer het antistof-celmengsel bij 4 °C gedurende 30 minuten in het donker om fluorofoorafkoeling te voorkomen. Na de incubatie centrifugeer je op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en aspireer je het supernatant volledig. Susseer de pellet opnieuw in 1-2 mL 1x PBS, centrifugeer opnieuw op 1.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en herhaal dit wasproces 2x om ongebonden antilichamen te verwijderen. Tot slot wordt de celpellet opnieuw opgehangen in 200 μL verse 1x PBS, fluorescentiegegevens verzameld met een flowcytometer en kwantitatieve analyses uitgevoerd met de FlowJo-software (v10). De gatingworkflow volgde standaard MSC-fenotyperingsprocedures: FSC-SSC-poort om puin uit te sluiten en de hoofdcelpopulatie te selecteren op basis van grootte en granulariteit, gevolgd door doublet-uitsluiting met FSC-A vs. FSC-H en SSC-A vs. SSC-H plots om single-cell events te garanderen. Vervolgens werd live cell gating uitgevoerd om trypan blue-positieve of PI-positieve dode cellen uit te sluiten. Fluorescentiegating werd toegepast voor enkelgekleurde controles, en ongekleurde controles werden gebruikt om drempels te stellen voor CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (positieve markers) en CD34, CD45 (negatieve markers). Vertegenwoordigende gating-plots werden geëxporteerd en geanalyseerd om de identiteit van hADSC's te bevestigen.

Differentiatiepotentiaal
Adipogene differentiatie: Oogst P3-generatie hADSC's bij 85% confluentie met 0,25% trypsine-EDTA, zaait ze vervolgens in 24-wellplaten met een dichtheid van 1 x 10⁵ cellen per put (met volledig DMEM-medium) en incubeer bij 37 °C met 5%_CO2 totdat cellen weer 85% confluentie bereiken. Voor inductie gebruik je de adipogenese-differentiatiekit, waarbij je component A (Adipogenic inducer) en component B (Adipogenic maintainer) reconstitueert volgens de handleiding, en gebruik component A de eerste 3 dagen voordat je overschakelt naar component B voor 1 dag. Herhaal deze cyclus drie weken. Voor het kleuren aspireer je het inductiemedium, was je cellen voorzichtig met 3 mL 1x PBS (voorkom verstoring van cellagen), fixeer je cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, en incubeer je vervolgens met 0,3% Oil Red O-oplossing (bereid in 60% isopropanol) op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was cellen 3x met 1x PBS om overtollige kleurstof te verwijderen, en beeld vervolgens de lipide druppels af met een omgekeerde lichtmicroscoop (20x).

Osteogene differentiatie: Zaad hADSC's in 12-wellplaten met een dichtheid van 1 x 10⁵ cellen per put, en wanneer cellen 85% confluentie bereiken, gebruik dan de osteogenesedifferentiatiekit voor inductie – reconstitute kit component A (osteogene inducer) en component B (osteogeen supplement) in low-glucose DMEM (eindconcentraties: 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 0,1 μM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat, 0,05 mM ascorbinezuur-2-fosfaat) en vernieuw het medium elke 3 dagen gedurende 3 weken. Voor de kleuring fixeer je cellen met 4% PFA op kamertemperatuur gedurende 15 minuten, spoel je 3x met 1x PBS, en incubeer je dan met 2% Alizarin Red S-oplossing (pH 4,2, bereid in gedeioniseerd water) op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was cellen 3x met 1x PBS om ongebonden kleuring te verwijderen, beeld vervolgens calciumafgezet knobbels af onder een fasecontrastmicroscoop (20x) en kwantificeer mineralisatie door het oppervlak van Alizarin Red S-positieve knobbels te meten met ImageJ-software.

Chondrogene differentiatie: Centrifugeer 250.000 hADSC's bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een 15 mL conische buis om een celpellet te vormen, voeg 500 μL volledig DMEM-medium toe aan de buis en incubeer een nacht bij 37 °C met 5%_CO2 om de pellet te stabiliseren. De volgende dag gebruik je de chondrogenese-differentiatiekit voor inductie – reconstitueer de kit component A (chondrogene inducer) in een_{CO-2-onafhankelijk} medium (eindconcentraties: 1% penicilline/streptomycine, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL ascorbinezuur-2-fosfaat, 100 μg/mL natriumpyruvat) en ververs het medium voorzichtig elke 3 dagen (verstoor de pellet niet). Na 3 weken inductie fixeer je de celpellet met 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, aspireer je het fixatiemiddel, incubeer je met 0,1% (w/v) Toluidine Blue O-oplossing (bereid in 0,1 M natriumacetaatbuffer, pH 4,0) op kamertemperatuur gedurende 15 minuten, aspireer je de kleur, spoel je de pellet 3x af met gedeïoniseerd water om overtollige kleurstof te verwijderen, vervolgens beeld ik af onder een brightfield-microscoop (20x) en kwantificeer ik de ophoping van gesulfateerde proteoglycanen door de gemiddelde optische dichtheid (OD) van Toluidine Blue O-kleuring te meten met behulp van de ImageJ-software.

VOORZICHTIG: Bij het hanteren van 4% PFA (een giftig en corrosief reagentia) moet je uitsluitend in een afzuigkap werken met wegwerphandschoenen, een labjas en veiligheidsbril om inhalatie van damp of contact met huid en ogen te voorkomen – spoel bij contact direct 15 minuten met stromend water en zoek medische hulp. Voor de verwijdering van gevaarlijk afval verzamel je gebruikte PFA- en PFA-besmette materialen (bijv. pipettoppen, platen) in een speciale chemische afvalcontainer met het label PFA-afval en voer je deze weg met institutionele protocollen voor gevaarlijk afval, waarbij je ervoor zorgt dat het niet mengt met biologisch afval.

Electrotaxis-kamerassemblage: Boor twee gaten (0,75 cm in diameter) aan tegenovergestelde uiteinden van de middenlijn op een 10 cm petrischaaldeksel, geplaatst 1 cm van de rand van de schaal (om agar-zoutbruggen te kunnen plaatsen). Breng een dunne laag vacuümvet (≤ 2 cm lang, ≤ 1 cm breed) aan op de onderkant van de petrischaal langs de middenlijn, 4 cm vanaf elke rand (Figuur 1A). Met steriele, fijn getipte pincetten plaats je een steriele glazen deklaag van 1 cm x 2 cm op elke vetplek en druk je zachtjes om een strakke afdichting te garanderen (voorkom breuk door dekmantel; Figuur 1B-C). Breng een dunne laag vacuümvet aan bovenop elke bevestigde deklaag en plaats vervolgens een tweede steriele glazen deklaag van 1 cm x 2 cm direct op het vet om een dubbele dekmantelstapel te vormen. Druk zachtjes om een strakke afsluiting tussen de twee dekfolies te garanderen (voorkom middelmatige lekkage; Figuur 1D). Langs de diagonale lijn die de linkerbovenhoek van een dekmantelstapel verbindt met de dichtstbijzijnde schotelrand, en de rechterbenedenhoek van de tegenoverliggende stapel met de dichtstbijzijnde rand, breng vacuümvet aan om een doorlopende barrièremuur te vormen. De wand moet stevig aan de bodem van de schaal worden bevestigd (geen openingen) en ongeveer 2 cm hoog en 0,5 cm breed zijn (Figuur 1E). Steriliseer de samengestelde kamer onder UV-licht gedurende 20 minuten (om microbiële besmetting te elimineren), bewaar daarna bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden tot gebruik (Figuur 1F).

DCEF-stimulatie: Plaats steriele glazen glaasjes (voor celzaaien) in een 10 cm petrischaal en breng ze een nacht uit bij 37 °C met 5%_CO2 om de glaasjes voor te conditioneren (celadhesie te bevorderen). Bereid de oplossing van Steinberg voor door 10 mL van 10x voorraadoplossing te verdunnen in 90 mL ddH₂O (steriel; eindconcentraties: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O, 0,83 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Voeg 0,3 g agar toe aan 20 mL van de voorbereide Steinberg-oplossing, microgolf gedurende 20 seconden totdat de agar volledig is opgelost en de oplossing helder is, vul vervolgens direct aangepaste glas-zoutbruggen met het hete agar-Steinberg-mengsel en laat het bij kamertemperatuur stollen. Na het stollen steriliseer je de zoutbruggen onder UV-licht gedurende 15 minuten, en steriliseer je twee bekers (elk met 30 mL Steinberg-oplossing) onder UV-licht gedurende 15 minuten. Zaad P3-generatie hADSC's op de voorgeconditioneerde steriele glaasjes met een dichtheid van 2 x 10⁴ cellen/cm², incubeer bij 37 °C met 5%_CO2 gedurende 24 uur om celadhesie mogelijk te maken, Vervolgens worden de celzaad-glaasjes overgebracht naar de startbaan van de gemonteerde elektrotaxiskamer en worden ze vastgezet met steriele zijgeleiders (om beweging te voorkomen). Sluit de startbaan af door een glazen afdeklaag van 3 cm x 2 cm over het vacuümvet te plaatsen, zachtjes te drukken voor een strakke afsluiting, en extra vacuümvet aan te brengen langs de randen van de bovenste afdekker om een barrière te vormen (middelmatige verdamping te voorkomen). Vul de reservoirs van de kamer met een_{CO2-onafhankelijk} medium (aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine; volume: 5-8 mL per reservoir), plaats de gesteriliseerde agar-zoutbruggen door de gaten in het petrischaaldeksel (met één uiteinde ondergedompeld in het medium reservoir van de kamer en het andere uiteinde in de met oplossing gevulde bekers van de Steinberg), en sluit de bekers aan op een stroomvoorziening via Ag/AgCl-elektroden (om een stabiele gelijkstroom te leveren). Pas een DC-veld (DCEF) van 2 V/cm toe gedurende 4 uur, meet de spanning elke 15 minuten met een digitale multimeter (indien nodig aanpassen om een constante veldsterkte te behouden), en maak time-lapse beelden van celmigratie elke 5 minuten bij 4 willekeurige velden met de software (5x objectief, bright-field modus).

OPMERKING: Zorg ervoor dat de voeding en elektroden droog zijn en op een niet-geleidend oppervlak bij het gebruik van elektrische apparatuur, zodat elektrische schokken worden voorkomen. Draag geïsoleerde handschoenen bij het aansluiten of loskoppelen van elektroden, zet de stroom uit voordat je de opstelling aanpast, en bij middelmatige lekkage op elektrische componenten zet direct de stroom uit en veeg af met absorberend papier dat doordrenkt is met 75% ethanol. In deze studie werd door het minimaliseren van de dikte van de elektroforesekamer en het houden van deze op ongeveer 1 mm, samen met het uitvoeren van multipuntsspanningmetingen aan beide uiteinden van de kamer, de variatie in veldsterkte binnen 10% gecontroleerd. Onder deze omstandigheden wordt aangenomen dat de elektrische veldverdeling binnen het cultuurgebied in wezen uniform^{is 26}.

Migratie- en morfologieanalyse
Live beeldvorming: Voor hADSC's onder DCEF-stimulatie importeer je de time-lapse beeldreeksen (5-minuten intervallen) in de ImageJ-software, volg handmatig 100 cellen over 4 onafhankelijke velden van het begin (t=0) tot het einde van de stimulatie (t=4 uur) met de Manual Tracking-plugin, en bereken je de gemiddelde migratiesnelheid (μm/min) en richting (D/T-verhouding, waarbij D = rechte lijn afstand van begin tot eind, T = totale padlengte) met behulp van de Chemotaxis Tool-plugin (ImageJ).

Tracking: Bereken de volgende migratieparameters om elektrotactisch gedrag te kwantificeren: Gerichtheid (Σcosθi/n, waarbij θi de hoek is tussen de verplaatsingsvector van de cel en de richting van het elektrische veld (EF), en n het totale aantal gevolgde cellen, variërend van -1 tot 1 met waarden dichter bij 1 die wijzen op sterkere anodegerichte migratie), Accumulatieve afstand (totale padlengte die elke cel aflegt tijdens de stimulatieperiode, in μm), Spoorsnelheid (opgebouwde afstand gedeeld door stimulatietijd, in μm/u), en Euclidische afstand (rechtlijnige begin-tot-eindverplaatsing van elke cel, in μm, wat de nettomigratie weerspiegelt).

Morfometrie: Na DCEF-stimulatie wordt cellen vastgesteld met 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, 3x gewassen met 1x PBS, het cytoskelet gekleurd met Phalloidine-TRITC (1:500 verdunning in 1x PBS; volume: 200 μL per put voor 24-putplaten) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (om F-actine te labelen), en kernen tegengekleurd met DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; volume: 100 μL per put) gedurende 5 minuten. Cellen werden gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop met 20x vergroting (met representatieve hoogresolutiebeelden die 40x zijn gemaakt). Phalloidine-TRITC werd gevisualiseerd met een excitatiegolflengte van 540-555 nm en een emissiegolflengte van 565-580 nm, terwijl DAPI werd afgebeeld met een excitatiegolflengte van 358-405 nm en een emissiegolflengte van 420-480 nm. Meet vervolgens de volgende morfologische parameters in ImageJ: Lange As (maximale Feret-diameter, de langste afstand tussen twee punten aan de celrand), Verticale Lengte (breedte van de cel loodrecht op de lange as) en Verticaliteit (sinα, waarbij α de hoek is tussen de lange as van de cel en de richting van de EF, waarbij hogere waarden een grotere uitlijning met de EF aangeven).

Verouderings- en proliferatie-assays
SA-β-Gal beitsing: Gebruik een senescence detectiekit om senescentiecellen (blauwgekleurde cellen) te identificeren onder een brightfield-microscoop (20x objectief). Zaad P3-generatie hADSC's in 6-wellplaten met een dichtheid van 2 x 10⁵ cellen per put, kweek tot 80% confluentie, aspireer het medium, was de cellen voorzichtig 3 keer met 1x PBS, voeg 1 mL fixatieve oplossing (in de kit meegeleverd) per put toe en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten, was cellen 3x met 1x PBS om de resterende fixatieve middelen na fixatie te verwijderen, voeg 0,5 mL SA-β-gal kleuringswerkoplossing toe (bereid door 50 μL SA-β-gal substraat te mengen met 450 μL kleuringsbuffer volgens de handleiding van de kit) per put, sluit de plaat af met transparante folie (om verdamping te voorkomen), incubeer een nacht (16-18 uur) bij 37 °C (vermijd CO2-blootstelling, omdat dit de pH verandert en enzymactiviteit remt), Maak de volgende dag helderveldbeelden van ≥10 willekeurige velden per put (10x objectief), tel het aantal blauw gekleurde (SA-β-gal⁺) cellen en het totale aantal cellen, en bereken het percentage verouderde cellen als (Aantal SA-β-gal⁺ cellen / Totaal aantal cellen) x 100.

Ki67 immunokleuring
Na SA-β-gal kleuring, aspireer je de kleuringsoplossing, was je cellen 2x met 1x PBS, permeabiliseer celmembranen met 0,1% Triton X-100 (bereid in 1x PBS; 1 mL per put) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, en blokkeer je niet-specifieke antistofbinding met 5% BSA (in 1x PBS; 1 mL per put) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met het primaire antilichaam Anti-Ki67 (1:200 verdunning in 1% BSA/PBS; 500 μL per put) bij 4 °C gedurende de nacht. De volgende dag werden de cellen 3x gewassen met 1x PBS (5 minuten elk), verwijderen van ongebonden primaire antistoffen en geïncubeerd met Alexa Fluor 488 488-geconjugeerd secundair antilichaam (1:500 verdunning in 1% BSA/PBS; 500 μL per put) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. De cellen werden opnieuw 3 keer gewassen met 1x PBS en 5 minuten gekleurd met DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; 200 μL per put). Fluorescentiebeelden werden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop met 20x vergroting (met representatieve hoge-resolutiebeelden gemaakt bij 40x). Alexa Fluor 488-gelabelde Ki67⁺ -cellen werden gevisualiseerd met een excitatiegolflengte van 485-495 nm en een emissiegolflengte van 515-545 nm, terwijl DAPI-gekleurde kernen werden gefotografeerd met een excitatiegolflengte van 358-405 nm en een emissiegolflengte van 420-480 nm. Het percentage proliferatieve cellen werd berekend als: (Aantal Ki67⁺ cellen / Aantal DAPI⁺ kernen) x 100.

OPMERKING: Bij het hanteren van primaire en secundaire antilichamen werk je in een BSC om besmetting te voorkomen, aliquot antistoffen in wegwerpvolumes om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen, en verzamel antistofbesmette materialen (bijv. pipetpunten, platen) in een speciale autoclaveerbare biologische afvalzak voor sterilisatie door autoclaving vóór verwijdering.

Leeftijdsafhankelijke elektrotaxisanalyse van hADSC's: Gebruik een DC-pulsvoeding om DCEF van drie intensiteiten te genereren: 0 mV/mm (controle), 100 mV/mm en 200 mV/mm, gebruik een live-cell werkstation om celmigratie in realtime te observeren en vast te leggen, en vergelijk voor elke EF-intensiteit kwantitatief de anodale migratiecapaciteit van hADSC's van jonge en oudere vrouwelijke donoren door het meten van de Accumulated Distance, Euclidische afstand, spoorsnelheid en gerichtheid, met drie onafhankelijke biologische replicaties per groep om de betrouwbaarheid van het resultaat te waarborgen. Elektrotactische migratieparameters werden gekwantificeerd met behulp van de Manual Tracking en Chemotaxis Tool-plugins in ImageJ (NIH). Individuele cellen werden handmatig gevolgd gedurende de gehele 4-uur stimulatieperiode, en de volgende parameters werden berekend volgens standaardmethoden: Accumulated Distance: de totale padlengte die elke cel tijdens de opnameperiode heeft afgelegd. Euclidische afstand: de rechte lijn tussen de begin- en eindposities van de cel. Spoorsnelheid: opgebouwde afstand gedeeld door de totale volgtijd (μm/u). Gerichtheid: berekend als de gemiddelde cosinus van de hoek (θ) tussen elke verplaatsingsvector en de elektrische veldvector (waarden variëren van -1 tot 1; waarden dichter bij 1 geven sterke anodale migratie aan).

RNA-sequencing
RNA-extractie en -voorbereiding: Steriliseer een met ijs gevulde container onder UV-licht gedurende 15 minuten (om de RNA-stabiliteit te behouden) en voer alle volgende stappen op ijs uit. Breng hADSC-gezaadde glazen glaasjes (1 cm x 2 cm) over van de elektrotaxiskamer naar een steriele petrischaal, was cellen 3x met 3 ml ijskoude 1x PBS (voeg PBS voorzichtig toe, roer lichtjes en aspireer volledig om het resterende medium te verwijderen), voeg dan 1 mL TRIzolreagens toe aan elke glaasje en incubeer op kamertemperatuur gedurende 20 minuten om cellen volledig te laten lyseren (zorg dat het lysaat de hele cellaag bedekt). Breng het lysaat over in een RNase-vrije 1,5-mL centrifugebuis, voeg 0,2 mL chloroform toe, vortex krachtig gedurende 15 seconden om fase-scheiding te induceren, incubeer de buis 15 minuten op ijs, en centrifugeer dan 15 minuten op 12.000 x g bij 4 °C. Dit scheidt het lysaat in drie lagen: de bovenste waterige fase met RNA, de middelste eiwitlaag en de onderste organische fase. Voorzichtig de bovenste waterige fase (≈ 0,5 mL) overbrengen naar een nieuwe RNase-vrije buis (vermijd het aanraken van de middelste laag), voeg 0,5 mL isopropanol toe, vortex voorzichtig om RNA neer te slaan, incubeer 10 minuten op ijs, en centrifugeer dan op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C; RNA vormt een witte pellet aan de onderkant van de buis. Gooi het supernatant weg, herhaal de isopropanolprecipitatie één keer om de RNA-zuiverheid te verbeteren, aspireer het supernatant volledig, laat de RNA-pellet aan de lucht drogen in een BSC op kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten (niet te veel drogen, want dit vermindert de oplosbaarheid), suspendeer de RNA-pellet opnieuw in 30 μL DEPC-behandeld water, incubeer bij 55 °C gedurende 10 minuten om de oplossing te vergemakkelijken, RNA-zuiverheid kwantificeren door de A260/A280-verhouding (doel: 1,8-2,0) te meten met een spectrofotometer, RNA-integriteit te beoordelen met een RNA-nanochip; doelwit: RNA Integriteitsnummer [RIN] > 8,0, en bewaar gekwalificeerde RNA-monsters bij -80 °C tot sequencing.

VOORZICHTIG: Trizol en chloroform zijn giftig, vluchtig en kankerverwekkend, dus behandel ze uitsluitend in een afzuigkap terwijl je nitrilhandschoenen, een labjas en veiligheidsbril draagt – vermijd inademing van dampen, veeg met een papieren handdoek en spoel 10 minuten met zeep en water als het op de huid wordt gemorst, en meng het niet met bleekmiddel of andere oxiderende middelen (omdat dit giftige gassen kan produceren). Voor de verwijdering van gevaarlijk afval gerelateerd aan RNA-extractie verzamelt u mengsels, isopropanol-supernatanten en verontreinigde buizen in een afgesloten, chemisch resistente container met het label RNA Waste (niet mengen met waterig of biologisch afval) en voer u af volgens institutionele protocollen voor gevaarlijk afval, waarbij u ervoor zorgt dat er niet in afvoeren wordt gestort.

Datapreprocessing en kwaliteitscontrole: Bereid sequencingbibliotheken voor met de VAHTS mRNA-seq Library Prep Kit volgens het protocol van de fabrikant – verrijk mRNA met oligo(dT) magnetische kralen, fragment mRNA in fragmenten van 200-300 bp met behulp van divalente kationen, synthetiseer eerste-streng cDNA met willekeurige hexamers gevolgd door tweede-streng cDNA, voer eindreparatie uit, voeg A-tails toe, ligate-sequencingadapters, amplifiseer bibliotheken met PCR en zuiver met kralen. Sequencen de bibliotheken op een sequencingplatform (150 bp gepaarde eindlezingen), waarbij ongeveer 50 miljoen ruwe lezingen per monster worden geproduceerd, en vervolgens een software gebruikt om laagwaardige leesopdrachten te trimmen (verwijder leesopdrachten met >50% bases met een Phred-kwaliteitsscore <20) en adaptersequenties, waarbij ongeveer 48 miljoen schone lezingen per monster behouden blijven (Q30 > 90%) voor downstream analyse na het trimmen.

Bio-informatica analyse: Lijn de schone reads uit op het menselijke referentiegenoom (GRCh38/hg38) met Hisat2 v2.2.1-software en sla aligneringsresultaten op als BAM-bestanden, gebruik htseq-count v0.13.5-software om het aantal reads dat aan elk gen is toegewezen te tellen (gebaseerd op Ensembl-genannotaties), normaliseer gentellingsgegevens met behulp van de estimateSizeFactors-functie uit het DESeq (2012) R-pakket om batcheffecten en verschillen in sequencingdiepte te elimineren, en differentiële expressieanalyse uitvoeren met behulp van de nbinomTest-functie (DESeq-pakket), waarbij differentieel tot expressie gedrukte genen (DEGs) worden geselecteerd met behulp van de drempelwaarden van vouwverandering (FC) > 2 en aangepaste p-waarde (padj) < 0,05. Voer Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse uit (biologisch proces, moleculaire functie, cellulaire component) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeverrijkingsanalyse op DEG's met behulp van clusterProfiler v4.0 R-pakket, met focus op verrijkingen gerelateerd aan celmigratie (bijv. celadhesie, celmigratie), ionentransport (bijv. natriumiontransmembraantransport) en signaalroutes (bijv. PI3K-Akt signaalroute). Voer ongecontroleerde hiërarchische clustering uit op DEG's met behulp van het pheatmap v1.0.12 R-pakket en visualiseer genexpressiepatronen over monsters met een heatmap (rijschaalde z-scores).

Statistische analyse: Alle experimentele gegevens worden gepresenteerd als Gemiddelde ± Standaardfout van het Gemiddelde (Gemiddelde ± SEM), met ten minste 3 onafhankelijke biologische replicaties per groep (n ≥ 3). Gebruik de Student's t-test om verschillen tussen twee groepen te vergelijken (bijv. jonge versus oudere donoren) en eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoc test om verschillen tussen drie of meer groepen te vergelijken (bijv. verschillende EF-intensiteiten), statistische analyses uit te voeren met SPSS 23.0-software en statistische significantie als volgt te definiëren: *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.

Results

De toepassing van elektrische velden stuurt de richtingsmigratie van hADSC's en verbetert hun migratiecapaciteit
De geëxtraheerde hADSC's vertoonden typische mesenchymale stamceloppervlaktemarkers (bijv. CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) en hadden trilineagedifferentiatiepotentieel (adipogeen, osteogeen, chondrogen; Figuur 2A), die voldoet aan de standaardcriteria voor hADSC-identificatie. We pasten gelijkstroomvelden (DCEF's) toe bij intensiteiten van 0 mV/mm, 100 mV/mm en ...

Discussion

Vroeg in het herstel en regeneratieproces van weefselletsel verschijnen elektrische velden als een van de vroegste fysieke signalen die in de microomgeving worden vastgesteld. Hun directionele eigenschappen zijn ruimtelijk en tijdelijk gecorreleerd met de rekrutering van cellen naar de letselplaats²⁷. Endogene elektrische velden ontstaan uit het transepitheliale potentiaal dat wordt gegenereerd door gepolariseerd ionentransport in epitheelweefsels. Wanneer de epit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4°C/-20°C/-80°C Refrigerator	Haier, China	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
Agar	HUSHI, China	10000561
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Verenigde Staten	G2939BA
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	A5533
Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	1300 A2 1.5 m
CaNO3·4H2O	HUSHI, China	10013960
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	X4R Pro
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	Forma Steri-Cycle 3307
Collagenase Type IV	Biosharp, China	BS076
Confocal Microscope	ZEISS, Duitsland	LSM 900
DC Pulse Power Supply	Daedo Powertronics, Korea	DDP-500
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	D4902
Digital Multimeter	Fluke, Verenigde Staten	FLUKE-175
DMSO	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	D2650
Electronic Balance	Sartorius, Duitsland	BSA224S-CW
FBS	Gibco, Verenigde Staten	10270-106
Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	A24858
IBMX (1-Methyl-3-isobutylxanthine)	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	I7018
Indomethacin	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	I5500
Inverted Microscope	ZEISS, Duitsland	Axio Observer 7 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	I3146
KCl	HUSHI, China	10019318
KH2PO4	HUSHI, China	10019320
Linoleic Acid	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	L1376
Live Cell Station	Live Cell Instrument, Korea	Chamlide TC
Low-glucose DMEM	Gibco, Verenigde Staten	11885084
MgSO4·7H2O	HUSHI, China	10019322
Na2HPO4·12H2O	HUSHI, China	10019324
NaCl	HUSHI, China	10019318
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	ND-2000
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	O0625
Penicillin/Streptomycin	Gibco, Verenigde Staten	15140122
Pipettes	Eppendorf, Duitsland	4920000061
SYBR Premix EX Taq	Takara, China	RR420A
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	T3260
Tris	HUSHI, China	10019326
TRIzol	Beyotime, China	R0016
Trypsin-EDTA	Gibco, Verenigde Staten	25200056
Upright Microscope	ZEISS, Duitsland	415200-0000-000
Vacuum Grease	DOW CORNING, Verenigde Staten	1597418
Vitamin C	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	A4544
Water Purification System	Thermo Fisher Scientific, Verenigde Staten	GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-Glycerophosphate	Sigma-Aldrich, Verenigde Staten	G9422