Methodenartikel

Validatie van het hyperbare druksysteem met Xenonanesthesie voor Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/69671

⸱

20 februari 2026

 , 
1Clore Laboratory, University of Buckingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gassen die onschadelijk lijken bij atmosferische druk kunnen gedrag zoals narcose veroorzaken onder hyperbare omstandigheden. Conventionele hyperbare drukkamers zijn kostbaar en arbeidsintensief. Deze studie presenteert een eenvoudige, goedkope methode om de effecten van xenon op Drosophila melanogaster bij matige drukken onder 4 atm te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder hyperbare omstandigheden kunnen de verhoogde concentraties van de omgevingsgassen bij verschillende dieren een reeks gedragsreacties oproepen. Een aanzienlijk deel van deze gedragingen vertegenwoordigt veranderingen in cognitieve toestanden die nog slecht begrepen zijn. Een opvallend voorbeeld is algehele anesthesie. Het gedragseffect van verschillende gassen onder hyperbare omstandigheden in algehele anesthesie, of narcose, is een langdurige wetenschappelijke onderzoek, ondanks het overweldigend frequente gebruik van de medicijnen in de geneeskunde. Xenon, geclassificeerd als een edelgas en een verdovend middel, wordt beschouwd als een van de veiligste opties voor algehele narcose bij mensen. Onder normobare omstandigheden verdooft het vliegen echter niet. Hier hebben we een eenvoudige experimentele opstelling opgezet die de omgevingsdruk verhoogt tot ~3 atm en het bestuderen van xenonanesthesie mogelijk maakt in een van de populairste modelorganismen, Drosophila melanogaster. Deze experimentele opstelling vergemakkelijkt verder de studie van andere gassen en hun effect onder hyperbare omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De twee uiterste uitersten van gedragseffecten die bij dieren onder hyperbare omstandigheden zijn waargenomen, zijn een stuiptrekking door zuurstof en narcose door stikstof 1,2. Opmerkelijk genoeg zijn cognitieve stoornissen zoals hallucinaties en geheugenstoornissen gerapporteerd met stikstof en waterstof bij drukwaarden vóór het bewusteloosheidsniveau 3,4. Anesthesie geïnduceerd door xenon, krypton en lachgas onder hyperbare omstandigheden is eerder gerapporteerd als 5,6.

Algehele anesthesie is zowel een hoeksteen van de geneeskunde als een fenomeen van groot wetenschappelijk belang. Ondanks het lange en wijdverspreide gebruik blijft ons begrip beperkt over hoe bepaalde chemicaliën precies de tijdelijke afwezigheid van beweging, geheugen, pijn en bewustzijnveroorzaken. Xenon, als edelgas, kon worden aangewezen als het meest eigenaardige lid onder de anesthesiemiddelen. Het wordt beschouwd als een veilige optie voor anesthesie, met snelle inleiding en herstel, minimale fysiologische verstoring en slechts milde bijwerkingen zoals postoperatieve misselijkheid 8,9.

Gezien het medische belang van anesthesie en de ongebruikelijke chemische eigenschappen van xenon, is deze studie bedoeld om xenon-geïnduceerde anesthesie te onderzoeken met behulp van het eenvoudige diermodel Drosophila melanogaster. Er zijn diverse onderzoeksstudies uitgevoerd waarbij fruitvliegjes werden gebruikt om algehele narcose te bestuderen, met veel voorgestelde opstellingen en het gebruik van diverse vluchtige verdovingsmiddelen 10,11,12,13. Er is echter geen melding van xenonanesthesie bij Drosophila. Onder normobare omstandigheden veroorzaakt xenon geen verdowing bij Drosophila melanogaster, algemeen bekend als fruitvliegen. Om deze beperking aan te pakken, biedt deze studie een hyperbaar systeem dat gecontroleerde manipulatie van de omgevingsdruk tussen 1 atm en ongeveer 4 atm mogelijk maakt. Er zijn verschillende studies gedaan met hyperbare kamers om soortgelijke nieuwsgierigheden te beantwoorden14,15. De meeste commerciële hyperbare kamers profiteren echter van stevige, lekvrije materialen, maar ze hebben een groot volume (~3 L) en zijn systematisch ingewikkeld te bedienen en duur. In plaats daarvan is de in dit artikel beschreven methode eenvoudig en goedkoop, waardoor de effecten van verschillende gassen en hun combinaties worden onderzocht. Het biedt een opstelling die geschikt is voor kleine diermodellen zoals D. melanogaster en C. elegans.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Drosophila melanogaster bereiding

  1. Verzamel 20 vrouwelijke en 20 mannelijke vliegen van 1-3 dagen oud voor elk experiment metCO2.
  2. Laat de geselecteerde vliegen minstens 24 uur voor het experiment in een flesje met voedsel rusten bij een temperatuur van ~22 °C.

2. Anesthesietoediening

  1. Breng de gassen uit hun gascilinders over naar de lekdichte gaszakken voor experimenteel gebruik. Voor de directe overdracht van gas van de container naar de zakken gebruik je siliconen slangen.
  2. Bevestig 25 mm (3,4 mm diameter) siliconenbuis aan de polypropyleenspuit. Verbind vervolgens de polypropyleenspuit met de gaszakken en met de driewegskraan. Ter duidelijkheid zal de polypropyleenspuit in de rest van de tekst aangeduid worden als spuit #1.

3. Assemblage van de hyperbare opstelling (Figuur 1)

  1. Plaats de LED-lichttafel in landschapsgeoriënteerde stand op de tafel (lange rand horizontaal ten opzichte van het tafeloppervlak).
  2. Plaats de injectiepomp naast een van de korte zijden van de LED-lichttafel, zodat de oriëntatie van de pomp het toestaat dat de experimentele spuit boven de achtergrondverlichting uitsteekt.
  3. Plaats de camera boven de opstelling om het gebied te bedekken waar de experimentele spuit zich bevindt.
  4. Knip een siliciumbuis van 75 mm lang (3,4 mm diameter). Verbind de driewegskraan met de manometer via de siliconen slang van de centrale nozzle.
  5. Gebruik slangveerklemmen op de nozzle aan de zijkant van de manometer en de driewegskraan om te zorgen dat de buis strak zit.
  6. Met de knop die wordt gemarkeerd door een dubbele pijl in de besturingseenheid van de injectiepomp, stel je de snelheid in op 80 mm/m en de duur op 38 s voor de automatische compressie of decompressie van de zuiger.

4. Procedure voor Xenon-anesthesie

  1. Beperk het omgevingslicht in de experimenteerruimte en zet de LED-lichttafel aan en stel de helderheid in op niveau 3. Dit helpt het contrast in de video te vergroten.
  2. Verwijder de zuiger van de polycarbonaatspuit. Doe een kleine hoeveelheid katoen in de tepel van de spuit om te voorkomen dat vliegen ontsnappen. Voor de duidelijkheid wordt de polycarbonaatspuit in de rest van de tekst aangeduid als spuit #2.
  3. Om 40 vliegen van hun flesje naar spuit #2 over te brengen, haal je eerst het deksel van het flesje eruit en plaats je het spuitvatje verticaal bovenop het flesje. De loopflens moet samensmelten met de bovenkant van het flesje zodat de vliegen de spuitloop kunnen binnenkomen. Draai de constructie 180° en tik. Dit plaatst de vliegen onderin de spuitbuis. Plaats de plunjer weer terug. Plaats de spuit met de vliegjes in de injectiepomp.
  4. Oriënteer de loopsporen van de spuit aan de zijkant voor een beter zicht op de vliegen vanuit het cameraperspectief.
  5. Bevestig de spuit van de loop en de zuigerkop aan de injectiepomp met de verstelbare schroeven.
  6. Verwijder het katoen van de punt van spuit #2 en verbind het met de 3-weg tap.
  7. Begin met de video-opname. Zet de manometer aan. Draai de stopkraan om de manometer met spuit #2 te verbinden en controleer 0 kPa druk in de spuit met behulp van de manometer.
  8. Draai de 3-weg tap naar de laterale positie om luchtuitwisseling met de spuit mogelijk te maken vóór het experiment.
  9. Verplaats de zuiger van de 20 naar de 2 mL via de handmatige bedieningsoptie van de injectiepomp, die is ontworpen om de snelste optie mogelijk te maken.
  10. Aspireer 18 mL van het verdovingsgas uit de gaszak naar spuit #1. Verbind spuit #1 met de driewegtap van de laterale luervergrendeling. Om het juiste volume te beoordelen, zou 18 mL anesthetiegas in een totale hoeveelheid van 20 mL mengsel 90% van het gaspercentage opleveren. Dit kan worden aangepast volgens het gewenste eindgaspercentage.
  11. Zet de zuiger terug naar de 20 mL lijn via de handmatige optie van de injectiepomp.
  12. Draai aan de stopkraan om de manometer met spuit #2 te verbinden. Meestal geeft de manometer ~-3 kPa druk aan na het vullen van het anestheticum.
  13. Beweeg de zuiger automatisch, met snelheids- en tijdinstellingen ingesteld op 80 mm/s en 38 s. De pomp zal naar verwachting de 5 mL baring van de loop in 38 seconden bereiken. Wanneer de zuiger stopt, moet de maximale druk ~200 kPa zijn.
  14. Laat de zuiger 20 seconden op de 5 mL positie. Let op de piekdruk.
  15. Tik op de spuit om eventuele vliegjes los te maken die aan de zuiger vastzitten, zodat ze roerloos onderaan blijven liggen.
  16. Begin de automatische decompressie na 20 seconden. Beëindig het experiment wanneer de plunjer weer op de 20 mL bar staat. Let op de uiteindelijke druk voor de lekbeheersing.

5. Data-analyse

OPMERKING: In dit experiment werd anesthesie-emergentie als eindpunt gebruikt. De vliegbewegingen werden gekwantificeerd vanaf het beginmoment van de plunger-decompressie. Er werden twee verschillende analysemethoden ontwikkeld: pixelanalyse en vliegvolging. Elke analysemethode had zijn nadelen, die in de discussie worden gecommuniceerd.

  1. Pixelanalyse
    1. Gebruik ScreenFlow om de video's te bewerken. Snijd elke video bij op het interessegebied (ROI), dat wil zeggen de eerste 5 mL van de spuitloop.
    2. Knip de video tot de eerste 20 seconden na de decompressie van de spuit. Exporteer de bewerkte video's als GIFs. Dupliceer de GIF.
    3. Met Fiji verwijder je het eerste frame van het ene duplicaat en verwijder je het laatste frame van het andere duplicaat. Om dit te bereiken, selecteer je Afbeelding > Videobewerking > Frames verwijderen.
    4. Maak elke GIF-binaire in Fiji zodat vliegen wit lijken op een zwarte achtergrond. Om dit te bereiken, selecteer je Proces > Binair > Maak binair.
    5. Open beide GIFs in Fiji. Bereken het pixelverschil tussen de GIFs. Om dit te bereiken, selecteer je Proces > Afbeeldingscalculator. Deze bewerking creëert een pixelverschil-GIF.
    6. Bewaar de pixelverschil-GIF. Analyseer het deeltje in de verschillende GIFs. Om dit te doen, selecteer je Analyseren > Deeltjes analyseren in Fiji. Pas de pixelgroottedrempels aan om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
    7. Na analyse van deeltjes geeft Fiji een CSV met pixelverschillen per frame. Bewaar de CSV. CSV-gegevens kunnen worden gebruikt om de beweging per frame uit te zetten. Gebruik cumulatieve beweging door frames om statistische verschillen tussen de experimenten toe te wijzen.
  2. Vliegtracking
    OPMERKING: Voor de vliegvolgmethode werd AI-technologie gebruikt om het zwaartepunt van elke vlieg in de experimentele video's te detecteren en te volgen. Hiervoor werden twee modellen gecombineerd: YOLO (You Only Look Once) voor detectie en MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) voor tracking. De modellen werden uitgevoerd op Google Colab met een Tesla T4 GPU.
    1. Installeer de Ultralytics YOLO-bibliotheek in Colab en laad dan het yolo11n.pt model. Gebruik CVAT (Computer Vision Annotation Tool) om vliegen te annoteren in frames die uit de video's zijn gehaald, en exporteer vervolgens de dataset in YOLO-formaat voor training. Gedetailleerde installatie- en trainingsprocedures worden beschreven in de online repository.
    2. Installeer de MASA-repository in Google Colab en verwerk een Kalman-filter om objecttracking uit te voeren over opeenvolgende frames. Integreer het getrainde YOLO-detectiemodel met het MASA-trackingframework.
    3. Gebruik FixTrack om handmatig de tracklets te bekijken die door de gecombineerde MASA+YOLO-pijplijn worden gegenereerd. Identificeer en voeg verkeerd gefragmenteerde tracklets samen of corrigeer identiteitsmismatches om continue trajecten voor individuele vliegen te verkrijgen. Gedetailleerde installatie- en trainingsprocedures worden beschreven in de FixTrack-repository.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in dit artikel beschreven methode maakt het mogelijk zowel het tijdstip als de omvang van de locomotorische activiteit bij vliegen onder hyperbare omstandigheden te monitoren. Deze configuratie maakt het mogelijk dat gassen zoals xenon en lachgas, die onder normale omstandigheden geen verdovende eigenschappen hebben, anesthesie produceren in Drosophila melanogaster. Om dit te demonstreren, experimenteerden we met verschillende concentraties xenon en lucht. We begonnen het pro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze eenvoudige, goedkope opstelling maakt hyperbare gedragstests in Drosophila breed toegankelijk, waardoor snelle, reproduceerbare experimenten zonder gespecialiseerde drukvaten mogelijk zijn. Toch kent het een paar beperkingen. Een van de belangrijke compromissen is de lagere maximale druk ten opzichte van bestaande opstellingen. De hoogste druk die we met deze opstelling kunnen induceren is ~4 atm, terwijl drukvaten voor Drosophila ongeveer het dubbele bereiken, en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd financieel ondersteund door de TBD (Tiny Blue Dot) Foundation. We danken Jennifer Sun en Ting Liu van Google DeepMind voor hun hulp en begeleiding bij het volgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Luchtdichte gaszakken (0,5 L)Techinstro7440440
CameraAppleIphone 15
Dubbele draaddrukveerklemmensourcing mapa24120200ux2109
Drosophila voedselmixAdvanced HusbandaryDM900
Drosophila melanogasterDarwin BiologicalLZ-210
InjectiepijpAitoserleaB09M8G5BQ8
LED lichttafelLairiM1-3878368
ManometerDwyeromega477AV-8
Metalen driewegcompressiemoerkraan Sigma Aldrich Z182184
Polycarbonaatspuit (20 mL)DMC MedicalFD-1031NS
Polypropyleen spuit (20 mL)BD301031
Siliconen slang
Xenon gasChengdu Taiyu Industrial Gases

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bert, P. Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).
  2. Grover, C. A., Grover, D. H. Albert Behnke: nitrogen narcosis. J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).
  3. Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis. Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).
  4. Clark, J. E. Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities. Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).
  5. Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol. 105, 197-204 (1946).
  6. Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics. Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).
  7. Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).
  8. Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. Xenon: no stranger to anaesthesia. Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).
  9. Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).
  10. Krishnan, K. S., Nash, H. A. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).
  11. Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).
  12. Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster. Anesthesia Res. 2, 12(2025).
  13. Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).
  14. Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. High pressure effects in anaesthesia and narcosis. Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).
  15. Koblin, D. D., et al. Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics). Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).
  16. Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila. J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).
  17. Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice. Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).
  18. Gunning, C. FixtrackV2 at SingleVid. , Github. (2025).
  19. Allada, R., Nash, H. A. Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hyperbaric PressureXenon AnesthesiaDrosophila MelanogasterAnesthetic GasesBehavioral ResponsePressure ChamberVideo AnalysisPixel DifferenceFly MovementModel Organisms

Gerelateerde artikelen