Efficiënte regeneratie-gebaseerde agrobacterium-gemedieerde transformatie van een aseksuele amfibische Brassicaceae-soort, Rorippa aquatica

Samenvatting

We presenteren een efficiënt, geoptimaliseerd protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van een aseksuele amfibische Brassicaceae-soort, Rorippa aquatica, zonder resource-intensieve steriele weefselkweekprocedures. Het gebruik van een visuele transformatiemarker en een scheutregeneratiepijpleiding genereerde succesvol bijna klonale transformanten, waardoor toekomstige studies van de aanpassing van planten aan de onderwateromgeving werden bevorderd.

Samenvatting

Stabiele genetische transformatie van planten, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens, is een krachtig hulpmiddel geweest voor fundamenteel plantbiologisch onderzoek en plantbiotechnologieën die direct invloed hebben op gewasverbetering. Eenvoudige en effectieve transformatiepijplijnen, zoals de floral-dipping methode voor Arabidopsis, hebben grootschalige analyses van genfunctie drastisch vooruit geholpen. Zo'n pijplijn kan echter niet worden toegepast op plantensoorten die geen seksuele voortplanting ondergaan. Rorippa aquatica is een opkomende amfibische modelsoort van Brassicaceae die heterofile, drastische veranderingen in blad- en plantvorm vertoont in terrestrische of onderwateromgevingen. R. aquatica plant zich uitsluitend vegetatief voort. De hier geïntegreerde pijplijn biedt een efficiënte en betrouwbare Agrobacterium-gemedieerde R. aquatica-transformatie die geen steriele weefselkweek vereist. Bladstekken worden kort ondergedompeld in Agrobacterium, opgehangen in transformatiebuffer met een binaire vector die een visuele marker, RUBY, onder de constitutieve promotor uitdrukt. Vervolgens worden de inoculanten gekweekt op een met water doordrenkt filterpapier in een groeikamer. Vervolgens worden regenererende plantentjes met RUBY-rode pigmentatie gescheiden en in een pot gezet in de grond. Die initiële T1-regeneraties (R1-T1) drukken rode sectoren uit. Door het uitsnijden van de rode sector en het herhalen van de regeneratiestappen, worden in de volgende R2-T1-generatie een groot aantal transgene broers en zussen geproduceerd, waarvan sommige bijna uniform rood zijn; wat aangeeft dat de RUBY-expressie aanduidt. Deze eenvoudige transformatiepijplijn kan worden toegepast bij R. aquatica en mogelijk andere vegetatief voortplantende plantensoorten om genen van belang te introduceren die hun functies in de aanpassing aan terrestrische versus terrestrische versus aquatische omgevingen.

Inleiding

Stabiele genetische transformatie, dat wil zeggen de introductie en expressie van genen van belang bij een bepaalde plantensoort, is centraal in de basisplantwetenschap en plantenbiotechnologie. Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie is verreweg de meest gebruikte methode voor plantengenetische modificatie vanwege de betrouwbare generatie van stabiele transformanten¹. De ontwikkeling van een binair vectorsysteem, waarin de T-DNA kloonvector en het ontwapende vir-helperplasmide in twee entiteiten worden gescheiden, revolutioneerde de door Agrobacterium gemedieerde transformatie ^1,2. Voor de modelplant Arabidopsis thaliana maakte een eenvoudige, kosteneffectieve florale diptransformatieprocedure een hoogdoorvoer-generatie van klonale (hemizygote) transformanten mogelijk voor functionele genetica en genomica ^3,4. Zo'n benadering is echter niet haalbaar voor plantensoorten die voornamelijk of uitsluitend vegetatief voortplanten.

Amfibische planten vertonen een uniek vermogen om te gedijen in zowel terrestrische als aquatische (onderwater) omgevingen⁵. Rorippa aquatica is een amfibische Brassicaceae-soort die heterofyllie vertoont. In een terrestrische omgeving ontwikkelt R. aquatica ronde bladeren met een epidermis bestaande uit wegdekcellen en huidmondjes. Daarentegen vertonen hun aquatische bladeren morfologieën die goed zijn aangepast aan de onderwateromgeving: sterk gedissecteerde, naaldachtige bladeren met een epidermis zonder cuticulated wegdekcellen of huidmondjes ^6,7. Fylogenetisch is R. aquatica nauw verwant aan Arabidopsis thaliana; beide behoren tot dezelfde familie, Brassicaceae⁶. Samen met de beschikbaarheid van volledige genoomsequentiegegevens en een hoge sequentiebehoud van coderende genen tussen R. aquatica en A. thaliana, dient R. aquatica als een opkomende amfibische modelplant om de moleculaire basis van aanpassing aan land^{en water te} bestuderen. Recente fysiologische en genexpressiestudies suggereren inderdaad dat het herbedraden van de licht- en hormoonsignaleringsroutes cruciaal is voor de heterofilie van R. aquatica ^7,8.

Om de moleculaire functies van kandidaatgenen en -routes te testen, is genetische transformatie absoluut essentieel. R. aquatica plant zich vegetatief^{voort in} de natuur ^8,9. Daarom kan de Agrobacterium florale diptransformatie niet worden toegepast op R. aquatica, in tegenstelling tot A. thaliana. Opmerkelijk genoeg regenereert R. aquatica gemakkelijk hele plantjes uit losgekomen bladeren zonder exogene aanvulling van fytohormonen¹⁰. Kort gezegd, binnen enkele dagen na het loslaten van het bladsegment wordt celproliferatie actief in het vasculaire weefsel aan het proximale uiteinde van het snijvlak. Binnen een week regenereren zowel wortels als scheuten zich, waardoor uiteindelijk jonge plantjes (rosette plantletjes) ontstaan. Individuele planten kunnen gescheiden en tot volwassenheid worden gekweekt¹⁰. Dit spontane regeneratieproces van de hele plantlet kan gemakkelijk worden gebruikt voor een genetische transformatie van R. aquatica.

De hier gerapporteerde geoptimaliseerde pijplijn maakt een efficiënte en betrouwbare Agrobacterium-gemedieerde transformatie van R. aquatica mogelijk door gebruik te maken van het vermogen tot spontane regeneratie na bladloslating. Voor een gemakkelijke selectie van transformanten zonder de noodzaak van kostbare steriele kweekprocessen werd een niet-invasieve visuele selectiemarker RUBY gebruikt, een synthetische vector met drie genen die leiden tot de biosynthese van betalaïne¹¹. Door de omstandigheden van bacteriële kweek, inoculatiestappen en incubatieprocessen van bladstekken voor regeneratie te optimaliseren, werden betrouwbaar transgene R. aquatica-planten tot volwassenheid geproduceerd. Bijna alle eerste transformanten bij de R1-T1-generatie vertonen rode sectoren, wat aangeeft dat het heterogene, genetische mozaïeken zijn. Door de RUBY+ rode bladsectoren uit te sluiten en de regeneratieprocessen te herhalen, is het mogelijk om volledig rode rozetplanten, dus bijna klonale, R. aquatica-transformanten bij de daaropvolgende R2-T1-generatie te genereren. Deze transformatiepijplijn kan gemakkelijk worden toegepast om vreemde genen van belang in R. aquatica te introduceren/uitdrukken, waardoor de moleculaire genetische studies van heterofilie en plantadaptatie aan extreme omgevingen worden versneld.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van plantmaterialen

1. Excise en gesneden, volledig gelobde, volwassen gezonde bladeren in 1-2 cm lange stukken van twee maanden oude, volwassen moederplanten (Figuur 1A).
2. Bekleed een plantenvermeerderschalen (20 x 30 cm Perma Nest Trays) met twee lagen autoclaveerde gevouwen papieren handdoeken. Verzadig keukenpapier met steriel water, zodat er een dun laagje water bovenop zit.
3. Plaats stekken met de adaxiale zijde omhoog met ruimte rond elke explant om overlapping te voorkomen (Figuur 1A).
4. Besproei de stekjes lichtjes en bedek de tray stevig met plasticfolie.
5. Plaats schalen in de groeikamer bij 25 °C-28 °C met 16 uur licht- en 8 uur donkerperiode onder vochtige omstandigheden en een lichtintensiteit van 50 μmol/m²/s.
6. Controleer en onderhoud schone, vochtige propagatiebakken 2-3 keer per week.
   1. Voeg steriel water toe om een dun laagje water over verzadigde papieren handdoeken te houden.
   2. Vervang plasticfolie die geen hechting heeft verloren en/of tekenen van verontreiniging vertoont (bijvoorbeeld zichtbare troebelheid van het water).
7. Met behulp van microschaar of scalpel verwijder je zorgvuldig geregenereerde, gezonde rozetplanten die zowel een scheut als een wortel dragen tussen 14-21 dagen na vestiging (Figuur 1B).
   OPMERKING: Zorgvuldige excisie is nodig om een enkele rozetplant te verkrijgen met scheut en wortel intact. Rorippa-rozetplantentjes vermenigvuldigen zich dicht langs het stippunt van de bladexplant en de middennerf, wat de identificatie van individuele rozetplantjes bemoeilijkt. De scheut van een rozetplantje groeit adaxial, terwijl wortels onder het bladoppervlak groeien, wat de zichtbaarheid van het hele rozetplantje bemoeilijkt (Figuur 1B).
8. Plant individuele rozetplanten in potten met een vochtig bodemmedium (2:1:1 verhouding potgrond: Vermilculiet: Perlite) aangevuld met een langzaam vrijkomende meststof (Figuur 1B).
9. Water met kraanwater aangevuld met 0,25 g/L gegranuleerde NPK-meststof en bedek met een vochtige koepel of plasticfolie om vochtige omstandigheden te behouden.
10. Plaats trays in de groeikamer onder voorafgaande omstandigheden (25 °C-28 °C met 16 uur licht- en 8 uur donkerperiode onder vochtige omstandigheden en een lichtintensiteit van 50 μmol/m²/s)
    OPMERKING: Het is cruciaal om vochtige bodemcondities te behouden. Houd een dun laagje water onder de potplanten.

2. Agrobacteriumculturen voor transformatie

1. Streep A. tumefaciens stamt GV3101 met het Ti-plasmide pMP90 (pTiC58DT-DNA) dat de RUBY-vector bevat op een 30 mL LB-plaat met rifampicine (0,03 mg/mL), gentamycine (0,025 mg/mL) en spectinomycine (0,05 mg/mL) en groeit bij 28°C gedurende 48-72 uur totdat er enkele kolonies zichtbaar zijn.
2. Selecteer een enkele kolonie en inoculeer 5 ml MG/L-bouillon met biotine en eerdere selectieve antibiotica (Tabel 1) en incubeer in een 28 °C roterende shaker bij 200 toeren per minuut gedurende 16 uur.
3. Transplanteer inoculum in een conische kolf met 250 MG/L bouillon en incubeer in een 28 °C roterende shaker bij 200 rpm gedurende 16 uur.
4. Zorg ervoor dat de vloeistofcultuur een minimale OD₆₀₀ van 1,2 heeft met behulp van een spectrofotometer. Pellet de bacteriën door centrifugatie op 3396 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 22 °C). Vul de inoculumbouillon aan met 200 μM acetosyringon (AS).
   OPMERKING: Aliquots van filter-steriele AS worden bereid in DMSO bij een werkzame concentratie van 100 mM en opgeslagen bij -20 °C. Inoculumbouillon moet vers worden gemaakt. AS wordt direct voor de centrifugatiestap toegevoegd om degradatie te minimaliseren. Mediabeschrijvingen en componenten zijn opgenomen in Tabel 1.
5. Om directe verstoring van de bacteriële pellet te vermijden, gooi je het supernatant weg en suspendeer je de pellet opnieuw in inoculumbouillon.
6. Draai de kolf met de hand zodat de oplossing een OD₆₀₀ van ongeveer 0,8 heeft.
7. Incubeer inoculum op een shaker bij 90 toeren per minuut gedurende 2,5 uur bij omgevingstemperatuur (ongeveer 22 °C).
8. Recordrelevante omstandigheden (kweek en inoculum OD₆₀₀, AS-concentratie en oppervlakteactieve stofhoeveelheid, inoculatieperiode en aantal experimentele eenheden dat nodig is voor transformatie-efficiëntie).
   OPMERKING: Optimale concentraties van bacteriële en resuspensionkweek zijn essentieel om de transformatie-efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd overmatige bacteriële groei te minimaliseren. Voor centrifugatie moet de bacteriecultuur minimaal een OD600 van 1,2 hebben; herschort tot een inoculum OD600 van 0,8. Aanpassingen aan de inductiebouillon zijn geoptimaliseerd om de transformatie te verbeteren zonder de levensvatbaarheid van regeneratieve middelen in te spelen. De aanbevolen concentraties zijn 150-225 μM voor AS en 0,005% voor oppervlak-actieve stof.
   VOORZICHTIG: Verwijder alle transgene bacteriën en planten in aangewezen biogevaarlijke afvalcontainers.

3. Transformatie van bladstekken van R. aquatica

1. Terwijl de inoculum-resuspendatiecultuur wordt gebroed, selecteer je verschillende twee maanden oude boomplanten die gezonde bladeren met volledige randen vertonen.
2. Bereid een plantenvermeerderingsbak voor (20 x 30 cm Perma Nest Trays) met 2 lagen autoclaved papieren handdoeken. Vouw papieren handdoeken. Verzadig keukenpapier met steriel water, zodat er een dun laagje water bovenop zit.
   OPMERKING: Stel een negatieve controlebak in waarin niet-geïnënte explanten identieke omgevingsomstandigheden ondergaan.
3. Zorg ervoor dat de laboratoriumbank is uitgerust met 100-500 mL ddH₂O, steriele containers die geschikt zijn voor het verwachte volume van het opnieuw opgehangen inoculum, een micropipet en tips.
4. Voorafgaand aan het beëindigen van de incubatiefase, verwijder snel tien bladeren aan de basis van de bladsteel van de geselecteerde plantplanten. Plaats explants in een petrischaal met steriel water.
   OPMERKING: Het is cruciaal om vers verwijderd weefsel te gebruiken voor bladinoculatie om uitdroging van bladeren te voorkomen.
5. Na 2,5 uur pipetteer je 50 μL tenactiviteit in 1 L resuspendieoplossing (0,005% tensidconcentratie) en draai je voorzichtig de kolf om te mengen (Figuur 2A). Zorg voor toegankelijkheid van een propagatiebak om de explants na de inoculatie te plaatsen (Figuur 2B).
6. Plaats het blad met de abaxiale zijde naar boven en snijd loodrecht langs de middennerf in stukken van 1 cm lang met een scalpel (Figuur 2C).
7. Plaats onmiddellijk vers gesneden bladeren in een 50 mL buis, geschikt voor de roterende buismixer, om als inoculatie-explants te dienen.
8. Giet inoculum in de explantbuis in een volume om al het materiaal te verzadigen en roer vervolgens 10 minuten in een roterende mixer op kamertemperatuur voor inoculatie (Figuur 2D, E).
9. Verwijder alle geïënfde bladeren uit de oplossing met een tang en plaats ze direct in de voorbereide propagatiebak.
10. Verdeel en verspreid de geweekte explants zodat ze gedeeltelijk, maar niet volledig, in de dunne laag water bovenop de verzadigde papieren handdoeken zijn (Figuur 2F).
    VOORZICHTIG: Houd aseptische omstandigheden in stand en vermijd contact met oppervlakken of gereedschappen die tijdens de Agrobacterium-procedures worden gebruikt vóór hun desinfectie.
11. Sluit elke tray af met plasticfolie en broeed drie dagen in het donker bij de omgevingstemperatuur (22°C).
12. Na afloop van de donkere periode zorg je ervoor dat de trays zijn afgesloten met transparante plasticfolie en voeg je de trays aan met ddH₂O om het vochtgehalte te behouden.
13. Verplaats inoculatietrays naar een groeikamer onder vegetatieve vermeerdering.
    VOORZICHTIG: Consponneer inoculumafval in een afvalcontainer, behandel het met een bleekoplossing van 10% en voer het af volgens de bioveiligheidsrichtlijnen.

4. Regeneratie van rozettenplanten en vestiging van de R1-T1-generatie

1. Controleer de inoculatiebakjes 2-3 keer per week om een schone en vochtige condities te garanderen.
   1. Voeg ddH₂O toe met een knypfles. Indien beschikbaar, spray dan de explants met een spuitfles voordat je de bakjes weer afsluit.
   2. Houd de luchtvochtigheid hoog door plasticfolie te vervangen die zijn hechting heeft verloren of tekenen van verontreiniging vertoont (bijvoorbeeld zichtbare troebelheid van water).
2. Inspecteer visueel geregenereerde rozetplanten op geschiktheid voor verplanting. Ideale regeneratieve planten vertonen een intacte scheut met meerdere bladeren en wortels van minstens 2-3 mm lengte (Figuur 2G).
   OPMERKING: Transgene rozetplanten regenereren doorgaans langzamer en bereiken meestal de geschiktheid voor transplantatie 21-28 dagen nadat ze in de groeikamer zijn geplaatst.
3. Exciseren en intacte transgene rozetplanten onder dezelfde omstandigheden als WT klonale regeneraties planten.
4. (Optioneel) Noteer het aantal geregenereerde transformanten en correleer met hun transformatiecondities om de efficiëntie te beoordelen.
   OPMERKING: Wees extra voorzichtig tijdens de selectie. Transgene regeneraties zijn vaak klein en gemakkelijk over het hoofd te zien. Inspecteer zorgvuldig zowel de adaxiale als abaxiale bladoppervlakken met een tang om de opbrengst te maximaliseren en schade te minimaliseren.
5. Exciseer de rozetplant, maar vermijd het aanraken van transgene bladeren. Knip overtollig blad direct rondom het transgene blad af. Verplant één plant per pot.
6. Bemest, water en besproei elke plant snel en plaats deze onder een plastic koepel om vocht vast te houden (Figuur 2G, H).
7. Label en registreer elk transgeen zaailing.
8. Breng explants terug die transformanten bevatten zonder scheuten, wortels of te klein lijken om in de propagatiebak te verplanten voor verdere screening. Transplanteer extra transformanten wanneer groei voldoende is.
9. Mist- en watertransplantaties worden de eerste week dagelijks getransplanteerd. Zorg ervoor dat er altijd water in de tray zit.
10. Verwijder en verwijder alle transplantaties die zijn gesenesceerd of geen RUBY-pigmentexpressie meer vertonen.
    VOORZICHTIG: Verwijder alle transgene materialen volgens institutionele bioveiligheidsvoorschriften.

5. Latere regeneratie en vestiging van de bijna-klonale R2-T1-generatie

1. Zodra rozetplanten zich ontwikkelen tot grote, gezonde planten (2 maanden), snijd je uitgebreide RUBBY-expressieve bladeren van een enkele zaailing (Figuur 2H).
   OPMERKING: Hoewel RUBBY-expressieve bladeren uniform rood kunnen lijken, zijn ze vaker chimerisch. Beide fenotypes zijn geschikt voor voortplanting. Ga door met de standaard vegetatieve voortplantingsmethoden in de volgende stappen.
2. Verdeel de getransformeerde bladstukken en plaats ze in een propagatiebak. Label elke propagatietray duidelijk met de bijbehorende zaailingdonor-ID.
   VOORZICHTIG: Meng geen bladeren van meerdere zaailingen in dezelfde tray. Elke zaailing vertegenwoordigt een uniek transgeen evenement en moet als aparte generatie worden gevolgd.
3. Transplanteerde geregenereerde R2-T1 planten (14-28 dagen na vermeerdering). Ken elke plant een nieuwe identificatie toe die de tweede status weerspiegelt. Ga door met de standaard zorg na transplantatie zoals eerder beschreven (Figuur 2I, J).

Resultaten

Parameters van de transformatie van A. tumefaciens werden geoptimaliseerd om met succes RUBYN-expressieve transgene, R. aquatica-planten te produceren, waarbij de beperkingen op basis van steriliteit werden omzeild en tegelijkertijd werd geprofiteerd van de snelle aseksuele regeneratiesnelheid (Figuur 1 en Figuur 2). Nadat bladstuk-explanten waren geïnënt en blootgesteld aan een daaropvolgende donkerbehandeling van 72 uur, begonnen geregenereerde plantjes binnen 2 weken onder de beschreven omstandigheden te groeien. Geregenereerde plantjes met chimere RUBY-sectoren die groot genoeg waren om te transplanteren, werden gevonden tussen 3-5 weken na de inoculatie (Figuur 3) en waren iets kleiner dan die niet-expressieve rozetplantletjes. Er werden geen RUBY-geregenereerde plantjes gevonden op de controle-, wildtype-trays, wat bevestigt dat dit fenomeen verschilde van de fysiologie van R. aquatica . Het type bacteriële cultuurbouillon, het type resuspendie-inoculumbouillon, de infiltratiemethode en de inentingsperiode verschilden niet significant in hun vermogen of snelheid om transformanten te genereren (Tabel 2 en Tabel 3). Behandelingsfactoren die de transformatie-efficiëntie positief beïnvloedden, waren onder andere een verhoogde AS-concentratie en auxine-blootstelling voorafgaand aan de inenting van bladexplantatie. Een verhoogde oppervlakteactieve concentratie beïnvloedde het opbrengst negatief en werd ongeschikt bevonden.

R-versie 4.4.2 12,13,14,15 werd gebruikt om Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM) analyse van gegevens van het aantal rosette plantletten uit te voeren. In Experiment D (Tabel 2D), waar door RUBY uitgedrukte regeneratiemiddelen werden onderzocht voor een 15 minuten durende inoculatie aangepast met 150 μM AS of 225 μM AS, schond het model de aannames vanwege onderdispersie, en werd in plaats daarvan een negatieve binomiale GLMM toegepast.

De effecten van verschillende bacteriële bouillon- en kweekcondities op transformatie-efficiëntie werden zorgvuldig onderzocht. Van de vijf experimentele replica's resulteerde het gebruik van Miller's LB-bouillon of transformatie-specifiek, MG/L-bouillon in transformanten die RUBY onder vrijwel identieke parameters expressief maakten en niet significant verschilden in hun effecten (Tabel 2A). De middelen waarop RUBY geregenereerde rozetplantjes uit individuele bladstukken uitdrukte, bestaande uit 15-60 explants per behandeling, varieerden van 1,61 ± 0,71 regeneratiemiddelen geproduceerd uit experimenten met LB- en niet-MS-gebaseerde cultuurresuspensionsbouillon (Control Induction Broth, Tabel 1) en 3,23 ± 1,13 regeneratiemiddelen uit die experimenten met MG/L en de Geoptimaliseerde Inductiebouillon. Ondanks het ontbreken van een significant verschil werden door subjectieve waarnemingen de MG/L-cultuur en de Geoptimaliseerde Inductiebouillon (Tabel 1) geselecteerd voor toekomstige optimalisatie-experimenten.

Vervolgens testten we factoren die de bacteriële belasting en het vermogen om meristematisch plantweefsel te bereiken beïnvloeden. Van acht replicaten (Tabel 2B) vertoonden geïnëntopeerde explants met een verhoogde oppervlakteactieve concentratie van 0,01% extreme stress een maand later, wat resulteerde in kleine, grotendeels niet-levensvatbare regeneratiemiddelen. Er leken geen geregenereerde transformanten te zijn onder deze replicaten, hoewel het gestresste regeneratieve fenotype van de explants kastanjebruin, bruin en geel pigmentatie had, dus er mogelijk potentiële transformanten waren. Hoe dan ook, de niet-levensvatbaarheid van de regeneratiemiddelen bevestigde het handhaven van een oppervlakteactieve concentratie van 0,005%.

Twee mechanistische technieken, agitatie of vacuüminfiltratie, werden vergeleken in hun effect om het gewenste DNA in de waardplant te introduceren. De controle-infiltratiemethode, waarbij explants werden ondergedompeld in 50 ml geresuspendeerd inoculum en geroteerd in een buismixer, was succesvol in het produceren van door RUBY gedrukte regeneratiemiddelen over de genoemde behandelingen. Toegepaste vacuüminfiltratie produceerde ook door RUBY gedrukte regeneratiemiddelen, maar verschilden niet in transformatie-efficiëntie vergeleken met de controlemethode (p = 0,478, Tabel 2D). Ongeveer 2-5 door RUBBY uitgedrukte regeneratiemiddelen per propagatiebak werden waargenomen, hetzij geïnënt via vacuüminfiltratie of fysieke agitatie.

De gecorrigeerde Acetosyringon (AS)-concentratie van bacteriële inoculum verschilde duidelijk in effect op de transformatie-efficiëntie. Het verhogen van de AS-concentratie van 150 μM naar 225 μM verbeterde de productie van RUBY significant door transgene explants tot expressie te brengen (p = 0,000309, 0,000458; Tabel 3C,D). Van de vier experimenten bestond elke behandeling uit een tray met 40 identiek behandelde geïnënfte explanten. Degenen die bij de hogere concentratie werden geïnoideerd, hadden gemiddeld bijna 5 RUBY-gedrukte regeneratieve middelen in plaats van 1 transformant per controle-AS-tray (Tabel 3C). Bovendien leek het AS-effect los te staan van de inentingsperiodes.

Van de drie experimenten met een inoculatieduur van 15 minuten, waarbij explanten werden aangepast met 225 μM AS, werd een gemiddelde van 7,28 ± 4,13 RUBYN-exprimeerde regeneratiemiddelen gevonden, wat duidelijk hoger was dan de 150 μM-behandelingen, waarbij 2,03 een regeneratiesnelheid van 1,32 was ± (Tabel 3D). Er leek geen duidelijk effect op het tijdsinterval te zijn bij controlebehandelingen van 150 μM AS (p = 0,676), waarbij de gemiddelde inoculatiesnelheid van 10 minuten 1,48 ± 0,954 was, vergeleken met 1,84 ± 1,230 regeneratieve middelen bij 15 minuten inentingen (Tabel 3B). Evenzo regenereerden 10 min, 225 μM behandelde inoculanten ongeveer 5 RUBY-exprimeerde rosettplantletten per behandeling, wat niet duidelijk verschilde van 15 minuten inentingsbehandelingen, waarbij 6-7 regeneratiemiddelen voor de behandeltray waren geïndiceerd (Tabel 3A).

Bovendien werd het plantaardige hormoon auxine, dat de regeneratie van planten in het algemeen bevordert, getest. Het blootstellen van vers verwijderde bladstukken aan een pulsauxinebehandeling vóór de inoculatie had een duidelijk positief effect op verhoogde RUBY-regeneratie vergeleken met die in ddH₂O (p = 0,00969, Tabel 2C). Wanneer geplaatst in ddH₂0 gecorrigeerd met 285 μM indol-3-azijnzuur (IAA), vertoonden explants een gemiddelde transformatiesnelheid van 6,67 ± 1,490 per behandeling vergeleken met de auxinevrije behandeling, die gemiddeld een regeneratiesnelheid van 2,00 ± 0,816 opleverde.

De onmiddellijk geregenereerde transgene lijn werd aangeduid als de R1-T1-generatie (Figuur 2), met individuele regeneraties als lijnen. Alle oorspronkelijke R1-T1 rozetplantjes vertoonden RUBYN-expressie in de vorm van chimerische bladeren, met verschillende chimerische patronen. Meestal drukten 1-3 bladbladen van plantjes duidelijke chimera's uit, waarbij door RUBIJN en niet-uitgedrukt weefsel uit elkaar gingen bij de middennerf. De meerderheid van de een maand oude R1-T1-zaailingen behield chimerische expressie (Figuur 3A), maar er werd een klein aantal zaailingen gevonden die volledig RUBY-expressief waren.

Aseksueel vermeerderde RUBY-pigmenteerde chimerische sectoren uit R1-T1 zaailbladstukken (Figuur 3B) regenereerden binnen 2-4 weken na excisie volledig RUBY- of chimerische R1-T1 rozetplanten. Na een maand vertoonden de meeste R2-T1-zaailingen voornamelijk RUBY-bladeren, met sommige met kleine niet-uitgedrukte chimerische gebieden (Figuur 3D, E).

Figuur 1: Vegetatieve propagatieprotocol en tijdlijn. Representatieve afbeeldingen illustreren de productiepijplijn die wordt gebruikt om aseksuele rozetplantentjes te regenereren. (A) Volwassen, gezonde, hele lobbbladeren van gevestigde moederplanten verwijderen en in 2-3 stukken snijden. (B) Het plaatsen van explants in een kweekbak en het onderhouden ervan onder gespecificeerde omstandigheden. Na 3 weken werden de rozetplantenblaadjes uit de explanten verwijderd en in de bodem verplant. Hieronder staat een echte foto van de geregenereerde rozetten die nog steeds (roze pijlen) aan de moederbladknipsel vastzitten. Deze plantjes bevinden zich in het optimale stadium voor transplantatie. Schaalbalk: 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Transformatie van R. aquatica-bladstekken en regeneratie van transformanten die RUBY-transcripten uitdrukken. Grafisch overzicht van het transformatieproces en de productie van getransformeerde regeneratieve stoffen. (A) Het verkrijgen van bacteriële inoculum. (B) Een propagatiebak voorbereiden met steriel filterpapier en water. (C) Bladeren in explantstukken snijden. (D) Uitlopers onderdompelen in inoculum. (E) Bewegen in een roterende mixer gedurende 20 r/1 min gedurende 10 minuten. (F) Verzadigde explants in de tray verspreiden, bedekken met een plastic koepel, en 72 uur onder donkere omstandigheden incuberen. (G,H) Na 1 maand intact verwijderen van getransformeerde regeneratieve stoffen uit Agrobacterium-blootgestelde explants en verplanten om volwassen planten te vestigen. (I,J) Herhaal de voortplantingsstap (G,H) om een bijna klonale R2-T1-generatie te produceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Aseksueel voortgeplante generaties van een RUBY transgene lijn. (A) Volgroeide R1-T1-zaailing met chimerische bladeren die RUBYN-expressie dragen. Schubbalk: 1 cm. (B) Twee van de twintig explants vers geplaatst in een kweekbak van de drie maanden oude zaailing zoals getoond in (A). De explants vertonen een chimere patroon van RUBY die gescheiden is bij de middenrib. Schubbalk: 1 cm. (C) Geregenereerde R2-T1 rozetplantletten met verschillende graden van chimere RUBYN-expressie , één maand na excisie, vóór transplantatie. Gegenereerde RUBY-positieve wortels (marronpijl). Schubbalk: 2 cm. (D) R2-T1 zaailing 1 maand na het uitplanten, met RUBY-expressie . Schubbalk: 2 cm. (E) Volwassen R2-T1 zaailing 3 maanden na uitplant met kleine sectoren (groene pijlen). Schaalbalk: 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Stroomdiagram van de geoptimaliseerde pijplijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Mediaformuleringen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Effect van vier optimalisatieparameters op de transformatie-efficiëntie van R. aquatica. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Effect van de concentratie van inoculum acetosyringone op de transformatie-efficiëntie vanR. aquatica. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

In deze studie hebben we een eenvoudige, directe, op regeneratie gebaseerde Agrobacterium-gemedieerde stabiele transformatie van R. aquatica vastgesteld, een amfibische plant van Brassicaceae die uitsluitend aseksueel voortplant. Er is geen grondige transformatiepijplijn van vegetatief vermeerderde amfibische planten vastgesteld, noch is de praktische transformatiemogelijkheid van R. aquatica benut met een visuele markering. Opvallend is dat deze pijpleiding geen arbeidsintensief, steriel plantweefselkweekproces of gespecialiseerde plantenkweekincubators vereist. Als zodanig kan dit protocol breed worden toegepast in diverse experimentele omgevingen, van wetenschappelijke onderzoekslaboratoria tot het klaslokaal.

Onder de verschillende geteste inentings- en incubatiecondities zorgden enkele factoren voor een significante verbetering in de transformatie-efficiëntie. Opmerkelijk is dat een iets hogere acetosyringon (AS) concentratie evenals de indol-3-azijnzuurconcentratie (IAA) de transformatie-efficiëntie positief beïnvloedden (Tabel 1 en Tabel 2). AS is een fenolverbinding die Agrobacterium aantrekt en is aangetoond dat het de efficiëntie van planttransformatie verbetert in Arabidopsis¹⁷. Het fytohormoon auxine is centraal voor de herprogrammering van plantcellen. Een snelle toename van auxine-gerelateerde genexpressie werd waargenomen tijdens de wondgeïnduceerde regeneratie¹⁰. Om deze reden kan men aannemen dat exogeen toegepaste auxine (IAA) tijdens explant-inoculatie de regeneratie-efficiëntie verhoogt. Echter, er werden geen verschillen waargenomen in het waargenomen aantal geregenereerde plantjes uit drie onderzoeken (57, 7,55 versus 59,67, 5,51 voor controle versus behandeling). Daarom kan auxinebehandeling waarschijnlijk het transformatieproces ondersteunen in plaats van regeneratie zelf.

Een niet-ionisch surfactivant, Alkoxylateerde trisilaan (bekend als Silwet L-77), verhoogt de transformatie-efficiëntie van Arabidopsis aanzienlijk via de floral-dip methode³, en wordt daarom veel gebruikt binnen de plantenbiologiegemeenschap. Er werd minimale plantstress waargenomen bij explants geaccrediteerd met Silwet L-77 op 0,005% (de aanbevolen concentratie voor bloemdip). Toen deze dosis werd verdubbeld (0,01%), raakten de bladstekken van R. aquatica ernstig beschadigd, waardoor vrijwel geen transformanten werden teruggevonden (Tabel 2B). Tijdens het dompelen in de bloemen van Arabidopsis vermindert het gebruik van oppervlakteactieve stoffen de oppervlaktespanning van inoculanten en verbetert het de toegang tot bloemknoppen. Daarentegen ontwikkelt R. aquatica als amfibische plantensoort gladde bladeren zonder trichomen of dikke nagelriemen⁵. Verhoogde oppervlakteactieve stof veroorzaakte bladweefselschade, wat erop wijst dat andere factoren dan tenactiv prioriteit moeten krijgen voor transformatie-efficiëntie in niet-behaarde bladweefsels. Tenactiviteit is relevanter voor het puberale fenotype, waar het de weefselpenetratie vergemakkelijkt. Na het integreren van alle geteste parameters wordt een pijplijn met de meest optimale omstandigheden geleverd als stroomdiagram (Figuur 4).

Het gebruik van een visuele marker, RUBY, is essentieel voor deze transformatiepijplijn. RUBY is een synthetische reporter die codeert voor drie coderende genen (CYP76AD1, DODA en glucosyltransferase) die een felrood pigment, betalaïne¹¹, synthetiseren. Wanneer de RUBY-expressie werd waargenomen in R1-T1 regeneratieve stoffen, vertoonde deze expressie als rode sectoren, wat aangeeft dat ze hoogstwaarschijnlijk chimerisch zijn (Figuur 2 en Figuur 3). Een eerdere studie toonde aan dat de regeneratie van R. aquatica afkomstig is van een vasculair cambium van een gesneden bladsectie¹⁰. Opvallend is dat R1-T1-regeneraties af en toe een chimerische grens langs de middenader vertonen, waarbij de helft van het bladblad rood is en de andere helft groen (Figuur 3A,B). Regeneratie uit RUBY-sectoren leverde af en toe volledig rode plantjes met rode wortels op (Figuur 3C, kastanjebruine pijl), die vervolgens werden uitgegroeid tot uniform rode R2-T1 planten (Figuur 3D). Er werden geen nadelige effecten van RUBY-overexpressie op de groei en ontwikkeling van R. aquatica waargenomen (Figuur 3). Ter ondersteuning werden geen waarneembare verschillen waargenomen in de grootte en vorm van R1-T1 rozetbladeren met RUBYN-sectoren (bijv. Figuur 3B). Het is mogelijk dat elk sterk, constitutief, promotor-gedreven transgeen de normale plantengroei en fysiologische respons kan verstoren.

Soms ontwikkelden deze 'bijna klonale' RUBYN-planten groene sectoren (Figuur 3E, groene pijlen), wat wijst op terugval of transgen-stilte. Dit geeft aan dat het hebben van een zichtbare marker zoals RUBY onmisbaar is voor buitenbaarmoederlijke expressie of het stilleggen (bijv. RNAi) van een gen van belang voor toekomstige moleculaire, mechanistische studies. Men kan een transgeen van belang introduceren in de RUBY-cassette en de fenotypes in de rode, RUBY-sectoren waarnemen. Samenvattend is het benutten van de door bladafsnijding geïnduceerde directe herprogrammering en een niet-invasieve zichtbare marker, een eenvoudige, efficiënte transformatiepijplijn geoptimaliseerd voor R. aquatica, een vegetatief voortplantende Brassicaceae. Hoewel het buiten de reikwijdte van dit protocol valt, kan toekomstig begrip van de exacte oorsprong van de regeneratie van getransformeerde R. aquatica inzicht geven in cellulaire herprogrammering in planten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1000 µL Low Retention LTS Filtered Pipet Tips	Rainin	30389213
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Bacto Yeast Extract, Technical	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Dehydrated Tryptone	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Biotin lyophilized powder	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Clear Domes for PermaNest Trays	Grower's Solution	GD221
Clear Plastic Wrap	Thomas Scientific	22-305654
Coarse Vermiculite	Bectine
di-Potassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	105109
Disposable Petri Dishes 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Folded paper towels 9.3” x 10.5”	Kimberly-Clark	2920
GENESYS 30 Visible Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-277000
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnesium sulfate, Heptahydrate	Sigma-Aldrich	M9546-250G
MaxQ 6000 Incubator Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS), powder	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotisserie Tube Rotator	Scilogex	824222019999
myo-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Percival Growth Chamber	Percival	AR36L3
Perlite Planting Soil Additive	PVP Industries	PVP105408
Perma-Nest Plant Trays 8''x12''	VWR International	470150-476
pH meter Seven Compact 5220	Mettler Toledo	30019028
Protected Scalpel	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Smart Release Fertilizer Plant Food	Osmocote	B0071CZTBA
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Spray Bottles with Pump Vaporizer	Thomas Scientific	1141V43
Square 3.5" GAGE pots	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sunshine #4 Professional Growing Mix Soil	Sun GRO Horticulture	1341CFL0028P S
Surfactant- Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Vacuum Desiccator	The Lab Depot	55207
Water Soluble All Purpose Plant Food	Miracle-Gro	160101