Geautomatiseerde HPLC-scheiding met LC-mate: een geïntegreerde repetitieve autosampler en fractieverzamelaar voor microschaalzuivering

Samenvatting

Er werd een geïntegreerde autosampler en fraction collector (LC-mate) ontwikkeld om herhaalde HPLC-scheidingen te automatiseren. Compatibel met HPLC-detectoren die analoge signalen uitzenden, verbetert LC-mate de prestaties van handmatig bediende systemen en versnelt onderzoekswerkprocessen die afhankelijk zijn van hoogpresterende vloeistofchromatografie.

Samenvatting

Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) speelt een cruciale rol bij de zuivering van hoogwaardige verbindingen en voldoet aan de toenemende eisen van chemie- en biologiedisciplines in zowel academische als industriële omgevingen. Herhaalde handmatige injectie en fractionele verzameling tijdens microschaalzuivering beperken echter de efficiëntie en reproduceerbaarheid aanzienlijk. Om deze bottleneck te overwinnen, hebben we een geïntegreerd autosampler en fraction collector-systeem ontwikkeld, tijdelijk LC-mate genoemd, dat herhaalde scheidingen automatiseert door direct te reageren op analoge signalen van de HPLC-detector. Het instrument is opgebouwd rond een hogedruk-zespoorts schakelklep voor monsterinjectie en een selectorklep voor fractieverzameling, waarbij operationele parameters worden bediend via een intuïtieve touchscreen-interface. LC-mate is compatibel met commerciële HPLC-detectoren die analoge uitgang kunnen leveren en kan ook herhaalde scheiding van gradiëntelutiemodus bereiken via synchrone signaaltriggering. Demonstratie-experimenten bevestigden stabiele werking en reproduceerbare scheidingen voor natuurlijke productzuivering, wat een duidelijke vermindering van de handmatige verwerkingstijd aantoonde. Het systeem biedt een praktische en toegankelijke oplossing om de automatisering in conventionele HPLC-workflows te verbeteren, waardoor de kloof wordt overbrugd tussen handmatige en volledig geautomatiseerde zuiveringssystemen.

Inleiding

Chromatografie, geïntroduceerd door M.S. Tswett in het begin van de 20e eeuw, evolueerde in de jaren zestig tot moderne high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) met vooruitgang in instrumentatie ^1,2,3.

Tegenwoordig speelt HPLC een cruciale rol bij de zuivering van hoogwaardige verbindingen, waarmee het voldoet aan de groeiende vraag van biomedicine, chemie en biologie in zowel academische als industriële vakgebieden. In academisch onderzoek hangt de microschaalzuivering van natuurlijke producten en de resolutie van chirale moleculen kritisch af van semi-preparatieve HPLC-technieken 4,5,6,7,8. In de meeste praktische gevallen injecteren onderzoekers een deel van de monsteroplossing tegelijk in een HPLC-kolom in plaats van in de geheel, om onvoorziene monsterverlies te voorkomen of vanwege de beperking van de kolomgrootte, waardoor herhaalde monsterinjectie en fractieverzameling onvermijdelijk is. Ondanks de uitzonderlijke scheidingscapaciteit blijft het gebruik van HPLC voor monsterzuivering beperkt door inherente beperkingen in de huidige instrumentatie en workflows. Een belangrijke bottleneck ligt in de sterke afhankelijkheid van handmatige interventie, met name bij monsterinjectie en fractionele verzameling. Deze processen zijn niet alleen tijdrovend en arbeidsintensief, maar ook vatbaar voor menselijke fouten, waardoor de doorvoer, reproduceerbaarheid en de algehele operationele efficiëntie wordt aangetast ^9,10.

Commerciële autosamplers en fraction collectors van grote HPLC-fabrikanten, zoals Agilent, Shimadzu en Waters, bieden betrouwbare en precieze automatisering, maar zijn doorgaans beperkt tot propriëtaire hardware- en softwareecosystemen. Zo zijn de Agilent 1260 Infinity II autosampler en de G1364F fraction collector naadloos geïntegreerd in de HPLC-systemen van Agilent, wat uitstekende reproduceerbaarheid biedt maar beperkte cross-platform compatibiliteit. Evenzo bieden Shimadzu's SIL-20A/40C autosamplers en FRC-40/FRC-10A fraction collectors een hoge doorvoer en uitstekende mechanische precisie, maar zijn ze afhankelijk van Shimadzu's LC-20 en Nexera besturingsarchitecturen. De Waters Alliance HPLC autosampler en fraction collector III-modules leveren ook robuuste prestaties en flexibele verzamelformaten (tot 300 mL/min), maar blijven afgestemd op de eigen UHPLC- en LC-MS-omgevingen van Waters. Daarnaast kunnen traditionele autosamplers die vertrouwen op injectienaalden het monsterherstel verminderen, en buisgebaseerde fractieverzamelaars kunnen onhandig zijn voor het verwerken van grote eluentvolumes. Voor de meeste andere HPLC-instrumenten is semi-preparatieve scheiding nog steeds afhankelijk van saaie, repetitieve handmatige bediening.

Deze uitdagingen benadrukken de noodzaak van een innovatieve aanpak om de zuivering van monsters in HPLC-workflows te automatiseren. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we LC-mate ontwikkeld, een compact en veelzijdig instrument dat autosampler en fraction collection modules integreert in één platform. De vloeistofkern van LC-mate bestaat uit twee hoofdcomponenten: een hogedruk zespoorts schakelklep (SKVA-3130-S) van SUS 316 roestvrij staal met een debiet van 0,4 mm en ondersteunende werkdruk tot 45 MPa, met een capaciteit voor nauwkeurige controle van de monsterinjectie, en een 10-kanaals multi-positie selectieklep met minimaal dode volume (27,5 μL port-to-port, 5 μL rotorgroef) met een doorstromingskanaaldiameter van 1,2 mm voor efficiënte fractieverzameling. Deze configuratie minimaliseert het dode volume en vermindert het risico op kruisbesmetting. Voor gedetailleerde instrumentspecificaties verwijs u naar Tabel 1. LC-mate kan analoge uitgang ontvangen van HPLC-detectoren en het HPLC-instrument via een synchroon signaal activeren, waardoor onafhankelijke controle mogelijk is van zowel monsterinjectie als fractieverzameling.

Tabel 1: LC-mate gerelateerde instrumentparameters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Het instrument is uitgerust met gebruiksvriendelijke besturingssoftware en een intuïtieve touchscreen-interface waarmee analoge chromatografische signalen in realtime visualisatie mogelijk zijn. LC-mate ondersteunt zowel isocratische als gradiëntseparatiemodi, waardoor gebruikers belangrijke parameters kunnen configureren - waaronder injectievolume, aantal herhalingstijden, intervaltijd van elke injectie en verzamelmodus [drempel-, tijd-gebaseerd of Collect All (verzamelfracties zowel boven als onder de drempel)], en volledig geautomatiseerde operaties met één enkele opdracht kunnen starten. Dit elimineert de noodzaak van herhaalde handmatige ingrepen en verhoogt de efficiëntie van HPLC-zuivering aanzienlijk.

Figuur 1 illustreert het algemene uiterlijk, het werkingsprincipe en de configuratie van de LC-mate geïntegreerd met een HPLC-systeem.

Figuur 1: Ontwerp en opstelling van het LC-mate-systeem. (A) Schematische indeling. (B) Instrumentendiagram. (C) Praktische opzetfoto. (D) Aansluiting van de signaaltransmissielijn tussen de UV-detector en de LC-mat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Het controleren van de verbinding

1. Controleer de solventleidingsverbindingen tussen de HPLC, LC-mate en chromatografische kolom om de juiste stromingspaden te garanderen (Figuur 1A).
2. Controleer de verbinding van de signaaltransmissielijn tussen de UV-detector en LC-mate, zoals weergegeven in Figuur 1D.
   1. Verbind de zwarte draad met de rode aansluiting en de witte draad met de zwarte aansluiting om de polariteit van de analoge signaaluitgang te matchen.
   2. Bekijk het LC-mate-display. Als de analoge signaalgolfvorm verschijnt, is de verbinding correct.
      OPMERKING: Als er geen golfvorm zichtbaar is, draai dan de verbindingen om: verbind de zwarte draad aan de zwarte aansluiting en de witte draad aan de rode aansluiting.
3. Controleer de aansluiting van de triggerverbinding tussen UV-detector en LC-mate.
   1. Steek het ene uiteinde van de datakabel in de uitvoerpoort van de UV-detector.
   2. Verbind de zwarte en witte draden van het andere uiteinde met respectievelijk de blauwe en zwarte triggerterminals van de LC-mate.
   3. Draai de aansluiting en trigger strakker aan om een stevige verbinding te garanderen.

2. Opstart van het geïntegreerde scheidingssysteem

1. Zorg voor een goede opstart van de HPLC.
2. Zorg voor een correcte start van de LC-mate.
   1. Bij het opstarten van het LC-mate-systeem klik je op het LC-mate-icoon op de interface om automatisch het zelftestprogramma uit te voeren en belangrijke hardwaremodules te initialiseren.
   2. Wacht op de korte Di-prompttoon (ongeveer 0,5 s) en het verdwijnen van de "Zelftest"-prompt op het scherm nadat de zelftest is voltooid, omdat deze aangeven dat de initialisatie is voltooid.

3. Condition-optimalisatie

1. Configureer de HPLC-scheidingsvoorwaarde en begin met elutie om kolomevenwicht te realiseren.
2. Klik op het Testicoon aan de linkerkant van het scherm van LC-mate, en de volgende interface wordt op het scherm weergegeven (Figuur 2A). Parameters voor het invoerinjectievolume, de elutietijd en herhalingstijden , en druk op het Start-icoon ; het draaien van autosampler, fraction collector en HPLC wordt gestart. In dit geval stroomt het eluent alleen via poort 10 van het selectorventiel naar buiten en kan handmatig worden opgevangen of weggegooid.
3. Identificeer de haalbare scheidingsvoorwaarden, waaronder resolutie, looptijd, retentietijd, injectievolume en UV-golflengte, enzovoort, om de daaropvolgende scheiding en fractieverzameling onder geschikte modi te vergemakkelijken.

4. Automatisch draaien

OPMERKING: Op basis van het chromatogram van haalbare scheidingsvoorwaarden kan men een geschikte manier van fractieverzameling kiezen uit de opties Threshold, Timing Collection en Collect All aan de linkerkant van de interface.

1. Fractioneel verzamelen op basis van drempelwaarde
   1. Selecteer de Threshold-functiemodule aan de linkerkant van de interface, en het systeem zal de parameterinstellingsinterface weergeven zoals weergegeven in Figuur 2B.
   2. Voer het Injectievolume, Herhalingstijden, Drempel en Elutietijd in en druk op Start; de HPLC en LC-mate draaien automatisch. Fracties met chromatografische pieken boven de drempel worden verzameld in verschillende verzamelflessen.
   3. Monitor de statusindicatoren die verticaal op het display zijn gerangschikt: Observe Injection in Progress om te bevestigen dat de introductie van het monster is gestart. Controleer de Separation in Progress om te verifiëren dat de chromatografische scheiding plaatsvindt. Let op "spuitleegen" om aan te geven wanneer de spuit restvloeistof wegspoelt. Let op blauwe markering van de bijbehorende tekst om te bevestigen welke operationele status momenteel actief is.
      OPMERKING: Tijdens het scheidingsproces toont het indrukken van het "Chromatogram"-icoon het chromatogram en de drempellijn op een nieuwe interface, en het chromatogram is identiek aan dat op het scherm van de computer die de HPLC aanstuurt.
2. Breukenverzameling op basis van tijdsperiode
   1. Selecteer de Timing Collection-module aan de linkerkant van de interface om het parameterinstellingsmenu te openen (Figuur 2C).
   2. Voer de vereiste parameters in: Injectievolume, Herhalingstijden, Elutietijd en een reeks benodigde verzameltijden.
   3. Druk op de Startknop om de geautomatiseerde sequentie te starten, waarna het HPLC-systeem en LC-mate herhaaldelijk draaien volgens de ingestelde parameters.
3. Fraction-verzameling met de "Collect All"-modus
   1. Selecteer de Collect All-functiemodule aan de linkerkant van de interface, het systeem zal de parameterinstelling weergeven zoals weergegeven in Figuur 2D.
   2. Stel een verzameldrempelwaarde in, en chromatografische pieken boven of onder de drempel worden allemaal afzonderlijk verzameld, wat mogelijk garandeert dat er geen verbinding in een mengsel verloren gaat.
      OPMERKING: Acetonitril is een brandbaar en giftig oplosmiddel. Alle procedures waarbij acetonitril of andere organische oplosmiddelen worden gebruikt, moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde laboratoriumruimte. Personeel moet te allen tijde passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen, waaronder chemische splash-bril en oplosmiddelbestendige handschoenen. Afvalacetonitril en andere organische oplosmiddelen moeten worden verzameld in aangewezen, correct gelabelde containers voor gevaarlijk chemisch afval. Deze afvalstromen werden afgehandeld volgens het milieu-, gezondheids- en veiligheidsprotocol van onze instelling door een erkende verwijderingsdienst.

5. Pijpleidingreiniging

OPMERKING: Het schoonmaken van de pijplijn zorgt ervoor dat er geen monster in de pijplijn overblijft wanneer de autosampler de volgende keer wordt gebruikt.

1. Bereid een klein flesje schoon oplosmiddel voor en plaats de injectiepijplijn van de autosampler in het oplosmiddel.
2. Selecteer de reinigingsmodule via de linkerinterface om het parameterinstellingsmenu te openen (Figuur 2E).
3. Reinigen van injectorpijpleiding
   1. Stel het injectievolume in tussen 0-1000 en stel de herhalingstijden in (zonder limieten).
   2. Klik op de Reinigingsfunctie onder "Reinigen voltooid" om de reiniging van de injectorpijplijn te starten.
   3. Houd het aantal "Cyclus" in de gaten om het aantal voltooide wascycli bij te houden.
4. Zuivering van de verzamelpijplijn
   1. Stel de reinigingstijd in (zonder limieten).
   2. Klik op de Zuivering onder de "Huidige Pijplijn" om de reinigingspijplijn van de collectie te starten.
   3. Monitor het weergave van de huidige pijplijn om te bevestigen welke pijplijn wordt opgeschoond, terwijl het systeem sequentieel verwerkt van pijplijn 0 tot pijplijn 10.

Figuur 2: LC-mate touchscreen-interface voor methode-werking. (A) Optimalisatiescherm. (B) Drempelmodus. (C) Timingmodus. (D) Verzamelmodus. (E) Pijpleidingreiniging. (F) Instellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Instructies voor gegevensopslag

1. Schakel automatisch opslaan in. Het systeem slaat het chromatogram automatisch op na voltooiing van elke eluatiecyclus.
2. Voer handmatig opslaan uit. Klik op de opslaan-knop nadat de elutie is voltooid. Voer de benodigde metadata in het dialoogvenster in om het bestand op te slaan.
3. Selecteer opslaglocatie. Kies ervoor bestanden op te slaan in de lokale opslag van het apparaat, een SD-kaart of een externe USB-stick.
   OPMERKING: Gebruik een externe USB-stick voor alle gegevensopslag om capaciteitsbeperkingen te vermijden en gemakkelijke data-toegang te garanderen.

Resultaten

Zuivering van 2"-O-galloyl-hyperoside
2"-O-Galloyl-hyperoside (2-GH) is een belangrijk wateroplosbaar bestanddeel van Euphorbia helioscopia L., een traditionele Chinese geneeskunde met een lange geschiedenis van gebruik voor het oplossen van slijm en vochtigheid¹¹. De chemische structuur is weergegeven in Figuur 3. Onlangs werd vastgesteld dat 2-GH een an...

Discussie

Deze resultaten tonen aan dat het LC-mate-systeem autonoom continue monsterinjectie en fractieverzameling kan uitvoeren volgens de vastgestelde parameters, waardoor handmatige interventie aanzienlijk wordt geminimaliseerd en de scheidingsefficiëntie wordt verbeterd. Het systeem beschikt over een gebruiksvriendelijke interface, waarvoor alleen een initiële hardware-installatie gevolgd door intuïtieve touchscreenbediening vereist is.

Om experimenteel succes te g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
High performance liquid chromatograph-EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd.. Webpagina van het instrument EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Een modulair preparatief HPLC-systeem dat in het protocol wordt gebruikt. Het omvat een oplosmiddelpomp, een UV/VIS-detector en een handmatige injectieklep. Dit systeem vormt de kern van de scheidingseenheid die de LC-mate automatiseert.
(Vloeistofchromatografische kolom) Sharpsil-U C18 150 mm (L) × 30 mm (I.D.) S-10 µm, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Omgekeerde fase C18 chromatografische kolom met een deeltjesgrootte van 10 μm en een poriëngrootte van 100 Å. Het is ontworpen voor de scheiding van kleine moleculen (zoals geneesmiddelen, organische verbindingen) en heeft een goede reproduceerbaarheid en stabiliteit. De kolomdimensies (lengte 150 mm, binnendiameter 30 mm) maken het geschikt voor preparatieve of semi-preparatieve chromatografie.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd.. Voor alle vragen over  het instrument LC-mate, neem contact op met de corresponderende auteur met E-mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Hulpapparatuur voor vloeistofchromatografiesystemen, waarschijnlijk gebruikt voor monsterinjectie, beheer van mobiele fase of gegevensverzameling. Het kan worden geïntegreerd met HPLC-systemen om de automatisering en efficiëntie van experimentele processen te verbeteren