Evaluatie van multimodale functionaliteit van chimerische antigeenreceptor T-cellen bij enkelcelresolutie door optofluidica-analyse

Summary

Adoptieve T-celtherapie met CAR-T-cellen toont veelbelovende resultaten bij de behandeling van bloedkanker, hoewel de duurzame reacties inconsistent zijn. Polyfunctionele T-cellen correleren met remissieduurzaamheid, maar standaardassays verhullen belangrijke subpopulaties. We presenteren een single-cell workflow met behulp van een optofluidica-platform om zeer functionele CAR-T-cellen te identificeren en te isoleren voor verder onderzoek.

Abstract

Adoptieve T-celtherapie is een nieuw behandelparadigma waarbij autologe T-cellen genetisch worden aangepast om een tumorgerichte chimerische antigeenreceptor (CAR) tot expressie te brengen voorafgaand aan ex vivo uitbreiding en herinfusie in de patiënt. Ondanks opmerkelijke demonstraties van antitumorpotentie bij patiënten met gevorderde hematologische maligniteiten, manifesteren langdurige reacties zich niet in een aanzienlijk deel van de gevallen. Hoewel verschillende idiosyncratische factoren kunnen bijdragen aan de variabiliteit in klinische uitkomsten, is er steeds meer bewijs dat het percentage polyfunctionele T-cellen in het pre-infusie CAR-T-celproduct sterk correleert met de duurzaamheid van kankerremissie. Helaas zijn standaardevaluaties van CAR-T-celproducten momenteel afhankelijk van bulkpopulatiemetingen of terminale assays, waardoor het vermogen om subpopulaties met verhoogde functionele eigenschappen te isoleren en te bestuderen beperkt wordt. Hier demonstreren we een workflow die gebruikmaakt van een optofluidica-platform om zowel het cytokinesecretieprofiel als de activatie via CD137-expressie van individuele CAR-T-cellen te evalueren, wat optioneel gecombineerd kan worden met cytotoxische activiteitsbeoordeling. Cellen met de grootste mate van multimodale functionaliteit kunnen worden geïsoleerd voor verdere analyses ter ondersteuning van het ontwerp van volgende generatie CAR-T-celtherapieën.

Introduction

Chimerische antigeenreceptor (CAR)-expressieve T-cellen hebben opmerkelijke antitumorpotentie aangetoond bij patiënten met gevorderde hematologische maligniteiten ^1,2. Echter, aanzienlijke aandelen behandelde patiënten vallen uiteindelijk terug, wat de noodzaak benadrukt om CAR-T-celproducten met een grotere functionele persistentie^{te ontwikkelen 3,4,5,6}. Hoewel veel idiosyncratische factoren kunnen bijdragen aan de variabiliteit in klinische uitkomsten, is er steeds meer bewijs dat het percentage polyfunctionele T-cellen in het pre-infusie CAR-T-celproduct sterk correleert met de duurzaamheid van kankerremissie. Daarom kunnen strategieën om CAR-T-cellen met een grotere polyfunctionaliteit te verrijken of te ontwikkelen therapeutische producten opleveren met een verhoogd potentieel om langdurige klinische responsen te mediëren ^6,7,8. Helaas zijn de huidige methoden om CAR-T-celfuncties te karakteriseren grotendeels afhankelijk van bulkpopulatiemetingen of terminale assays. Deze beperken het vermogen om specifieke subpopulaties met verhoogde multifunctionele eigenschappen te isoleren en te bestuderen. Zo wordt cytokinesecretie doorgaans beoordeeld via bulksupernatanten of via intracellulaire kleuring. Dat laatste vereist celfixatie in ruil voor informatie op enkelcelniveau⁹. Evenzo wordt cytotoxisch potentieel meestal geëvalueerd voor bulkpopulaties van CAR-T-cellen door het verlies van doelcel-levensvatbaarheid na T-cel/doelcel co-cultuur¹⁰ te kwantificeren. Het vermogen om de cytokinesecretie, activatie en cytolytische activiteit van levensvatbare CAR-T-cellen bij single-cell resolutie te evalueren, kan de ontwikkeling van therapeutische producten met een duurzamere anti-tumor effectiviteit stimuleren.

Hier presenteren we een methode om gelijktijdig individuele CAR-T-cellen te profileren voor multimodale functionaliteit via een optofluidisch single-cell platform (Figuur 1). Het systeem maakt gebruik van opto-elektrische positionering (OEP) om cytokinevangkralen en individuele cellen in ruimtelijk gescheiden pennen te verplaatsen, waardoor functionele beoordelingen van afzonderlijke CAR-T-cellen mogelijk zijn (Figuur 2A). In dit protocol demonstreren we een workflow om CAR-T-cellen te genereren via niet-virale genoverdracht en evalueren we de cytokinesecretie en activatie via CD137 van individuele CAR-T-cellen tijdens co-kweek met antigeenexpressieve en antigeen-negatieve doelcellen (Figuur 3 en Figuur 4)¹¹. Het potentieel om cytokine- en activatieprofielen tussen gemodificeerde celproducten te onderscheiden, wordt geïllustreerd door het vergelijken van standaard CAR-T-cellen met c-Jun-cellen die overexpressen⁶. Cytotoxische activiteit tegen single target-cellen kan ook worden beoordeeld met caspase- of fluorescentie-gebaseerde uitlezingen op het optofluidicaplatform (Figuur 2B). Echter, time-lapse analyse is vereist om de interactiekinetiek te bepalen, die aanzienlijk kan variëren voor elk CAR-construct en experiment. Evenzo vereisen repetitieve doden-assays die chronische stimulatie nabootsen een alternatieve werkwijze. Daarom beschrijven we in dit artikel de basisprocedure voor het uitvoeren van cytotoxiciteitsbeoordeling, maar bespreken we de gedetailleerde toepassingen niet.

Op basis van de gekozen beoordeling en doelkenmerken kunnen levende CAR-T-cellen met de grootste mate van multimodale functionaliteit uit het instrument worden gehaald en overgedragen aan individuele putten in 96-put plaat(en) voor verder onderzoek (Figuur 2C).

Protocol

OPMERKING: De buffer- en mediavoorbereiding zijn weergegeven in Tabel 1.

1. CD8 T-cel isolatie uit de kegel(s) van het leukocytenreductiesysteem

OPMERKING: Voer alle stappen uit met steriele, aseptische techniek in een weefselkweek bioveiligheidskast. Alle media voor verdunningen, washes en resuspensionen moeten gedurende de hele procedure op 4 °C worden gehouden.

1. Voeg 15 mL celseparatiemedium (dichtheid 1,077 g/mL) toe aan elk van twee 50 mL conische buizen (scheidingsbuis).
2. Houd een leukocytenreductiesysteem (LRS) kegel (kegelvormige kant naar beneden) boven een open 50 mL conische buis. Knip met een gesteriliseerde schaar de plastic buis die onder de LRS-kegel uitsteekt. Laat de LRS-kegel rusten bovenop de open 50 mL conische buis en snijd de plastic buis erboven. Verzamel ongeveer 8-10 ml bloed in de 50 mL conische buis.
3. Vul de 50 mL conische buis tot 50 mL met PBS + EDTA (bereid zoals aangegeven in de lijst van media en buffers) en pipetteer om het verdunde bloed te mengen. Verdeel het verdund bloed gelijkmatig over de twee scheidingsbuisjes.
4. Centrifugeer de scheidingsbuizen met verdund bloed op 750 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT), met 9 als versnelling en 2 als vertraging.
5. Met een 10 mL serologische pipette verzamelt en brengt u de buffy-laag zorgvuldig van elke scheidingsbuis in een verse 50 mL conische buis.
6. Vul elke 50 mL conische buis tot 40 mL met PBS + EDTA en suspenseer opnieuw om single-cell suspenties te verkrijgen. Centrifugeer de single-cell suspenties op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
7. Sussen en combineer de celpellets in 40 mL PBS + EDTA. Centrifugeer de single-cell suspension op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
8. Sussen de celpellet opnieuw in PBS + EDTA en bepaal de levensvatbare celdichtheid van de perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) suspensie via Trypan Blue-kleuring.
   OPMERKING: Trypan Blue is een levende-cel ondoordringbare kleurstof die DNA kleurt. Daardoor blijven zowel levende PBMC's als niet-genucleeerde cellen (d.w.z. rode bloedcellen) ongekleurd. Het is belangrijk om kleine cellen (bijv. rode bloedcellen) uit te sluiten bij het bepalen van de levensvatbare PBMC-dichtheid.
9. Breng het gewenste aantal PBMC's over naar een verse 50 mL conische buis voor magnetische verrijking van CD8⁺ T-cellen. Schat het aantal gewenste CD8⁺ T-cellen tienvoudig als de starthoeveelheid PBMC's die nodig is voor magnetische verrijking. Houd reagentia koud tijdens de ingreep.
10. Centrifugeer de PBMC-celsuspensie op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant. Sussie de celpellet opnieuw in 40 μL MACS-buffer (bereid zoals aangegeven in de lijst van media en buffers) per 1 x 10^{7 cellen} .
11. Voeg 10 μL CD8⁺ T-cel Biotine-Ab Cocktail toe per 1 x 10^{7 cellen} . Meng door te pipetteren en incubeer 5 minuten op 4 °C.
12. Voeg 30 μL MACS Buffer toe per 1 x 10^{7 cellen} . Voeg 20 μL CD8⁺ T-cel Microbeads toe per 1 x 10^{7 cellen} . Meng door te pipetteren en 10 minuten te bebroeden op 4 °C.
13. Plaats voorgekoelde LS-kolom(s) op een magneet. Plaats een 15 mL conische buis eronder om vloeistofdoorstroming op te vangen. Evenwicht elke LS-kolom met 3 mL MACS-buffer.
14. Met dezelfde 15 mL conische buis als de verzamelbuis breng je de celsuspensie aan op de evenwichtige LS-kolom. Was de kolom 3x met 1 ml MACS Buffer. Laat elke 1 mL wash volledig door de LS-kolom gaan voordat je de volgende wash aanbrengt.
15. Suspenseer de verzamelde cellen zorgvuldig opnieuw en bepaal de levensvatbare celdichtheid van de verrijkte CD8⁺ T-celsuspensie via Trypan Blue-kleuring.

2. Kraal-gebaseerde activatie van CD8⁺ T-cellen

1. Bereken het aantal menselijke CD3/CD28-kralen dat nodig is voor een 1:1 verhouding van T-cellen:kralen. De activatiekorrel bevat 1 x 10^{6 kralen} per 25 μL.
2. Laat de activatiekralen voorzichtig minstens 30 seconden vortexen voordat het berekende volume van de korrelsuspensie wordt overgebracht naar een 15 mL conische buis. Voeg een gelijke hoeveelheid medium toe om de kralen en vortex minstens 5 seconden te wassen.
3. Plaats de 15 mL conische buis 1 minuut in de betreffende magneet om de kralen aan de zijkanten van de buis te verzamelen. Aspireer en gooi het supernatant weg.
4. Bereken het volume medium dat nodig is voor een uiteindelijke T-celconcentratie van 1 x 10 6 T-cellen/mL. Verwijder de 15 mL conische buis uit de magneet en stil hem opnieuw in het berekende volume van het kweekmedium. Voeg recombinant humaan IL-2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 50 U/mL.
5. Breng het volledig aangevuld medium over naar de buis met de T-cellen en sussen opnieuw. Zaad de celsuspensie in een geschikt celkweekformaat (bijv. 1 mL in 48-wellplaten, 2 mL in 24-wellplaten) en incubeer gedurende 40 uur.

3. CAR-T-celgeneratie door niet-virale genoverdracht via nucleofectie

OPMERKING: Voorverwarming van media (37 °C), reagentia (RT) en de centrifuge (RT) is cruciaal om een hoge genoverdrachtsefficiëntie te garanderen.

1. Bereid een plaat met 48 putjes voor met 1 ml celkweekmedium voor elke nucleofectieconditie. Incubeer de plaat minstens 30 minuten om een warme en CO2-gecorrigeerde medium met een fysiologische pH te creëren.
2. Schakel de Nucleofector in en selecteer de posities die genucleofecteerd moeten worden binnen de 16-well-strip. Kies het juiste programma (bijv. FI-115 om hoge efficiëntie te prefereren of EO-115 voor een hogere levensvatbaarheid).
3. Haal de celkweekplaat met T-cellen uit de couveuse en gebruik een microscoop om het visuele uiterlijk van de cellen te controleren, om een eerste indruk te krijgen of de activatie succesvol was. Succesvol geactiveerde T-cellen zouden gelijkmatige clustervorming en een vergrote celvorm moeten vertonen. Een medium kleur die verschilt van verse medium naar een licht oranje tint geeft aan dat activatie heeft geleid tot een actievere metabole toestand en wordt als een goed teken beschouwd. Op dit punt kan een flowcytometrische analyse van vroege activatiemarkers CD25 en CD69 de activatie valideren.
4. Suspensie, oogst en tel geactiveerde T-cellen. Bereken het aantal benodigde T-cellen door 1,2 tot 2 x 10 6 T-cellen per conditie te beschouwen. Breng het berekende volume over naar een verse 15 mL conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT.
5. Aspireer en gooi supernatant weg en was T-cellen met 10 ml warme PBS. Centrifugeer op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gebruik de centrifugatietijd om de CAR-coderende plasmiden te ontdooien, die doorgaans een concentratie van 1 μg/μL DNA bevatten. Assembleer transposase-codeerend (SB100x) plasmide (1,0 μg) of minicirkel (0,5 μg) samen met CAR-coderende plasmide (1,0 μg) of minicirkel (0,6 μg) in een individueel DNAse-vrij 1,5-mL microcentrifugatiebuisje per nucleofectieconditie.
6. Bereid een voldoende hoeveelheid P3 Nucleofectoroplossing met toegevoegd supplement (volgens voorwaarden: 16,4 μL Nucleofectoroplossing + 3,6 μL supplement).
7. Haal de 15 mL conische buis met de T-cellen uit de centrifuge, aspireer supernatant en centrifugeer 1 minuut op 200 x g om restvloeistof op de bodem op te vangen. Neem een 200 μL pipet om voorzichtig zoveel mogelijk buffer te verwijderen zonder de celpellet aan te raken.
8. Ga direct verder met het opnieuw opsuspensjoneren van de T-celpellet in 20 μL P3-buffer (zoals aangegeven in de materiaallijst) volgens conditie. Overbreng 20 μL celsuspensie in P3-buffer naar de 1,5 mL microcentrifugatiebuis met de respectievelijke constructies, meng voorzichtig zonder lucht toe te voegen, en breng de celsuspensie over naar de nucleofectiestrip met 16 putjes. Tik zachtjes om eventuele lucht uit de bodem van de put te verwijderen.
9. Plaats de 16-well-strip in het 4D-nucleofectorsysteem en start de nucleofectieprocedure. Na succesvolle nucleofectie zou er een groen kruis op het scherm moeten verschijnen voor elke gekozen put.
10. Voeg onmiddellijk 100 μL voorverwarmd medium toe van de voorbereide 48-put plaat voordat je de 16-put strip 10 minuten in de incubator incubeert.
11. Voorzichtig 2 tot 3 keer opnieuw ophangen, de celsuspensie overbrengen in de voorbereide plaat met 48 bronnen en deze terug in de broedmachine plaatsen.
12. Na 4-5 uur verwijder je zorgvuldig 500 μL uit elke put en voeg je voorzichtig 500 μL vers en voorverwarmd kweekmedium toe, aangevuld met 50 U/mL recombinant humaan IL-2.
13. Voer regelmatige mediawissels om de dag uit om de cellen uit te breiden, waarbij een celdichtheid tussen 0,5 en 2 x 10 6 T-cellen/mL behouden blijft.
14. Op dag 6 verwijder je de CD3/CD28 activatiekralen. Oogst T-cellen door voorzichtig 10 keer opnieuw te suspenderen en de celsuspensie over te brengen naar een 15 mL conische buis. Plaats de 15 mL conische buis 1 minuut in de betreffende magneet.
15. Aspireer de celsuspensie, plaats deze op een verse kweekplaat en voed cellen met een vers celkweekmedium aangevuld met IL-2 tot een uiteindelijke concentratie van 50 U/mL. Kralen moeten zichtbaar blijven in de zijwanden van de 15-mL conische buis die nog in de magneet zit.
16. Analyseer de genoverdrachtsefficiëntie op dag 7 via flowcytometrische analyse van de respectieve expressie van CAR- of surrogaatmarkers voordat u op dag 8 overgaat tot magnetische sortering van transgen-positieve CAR T-cellen (Gating Strategy in aanvullende figuur 1).

4. Magnetische verrijking van transgen-positieve T-cellen

OPMERKING: Voer alle stappen uit met steriele, aseptische techniek in een weefselkweek bioveiligheidskast. Alle media voor verdunningen, washes en resuspensionen moeten gedurende de hele procedure op 4 °C worden gehouden.

1. Oogst T-cellen door voorzichtig opnieuw te suspenderen en over te brengen naar 15 mL conische buizen. Tel T-cellen, neem het aantal cellen dat magnetisch verrijkt moet worden en centrifugeer 10 minuten op 300 x g.
2. Aspireer en verwijder supernatant en wash door opnieuw te suspenderen in 10 mL MACS-buffer. Centrifugeer 10 minuten op 300 x g. Aspiraat en gooi supernatant weg.
3. Bereken de hoeveelheid biotinyleerde antilichamen gericht tegen de surrogaatmarker (bijv. tEGFR) die nodig is. Typisch moet het antilichaam worden getitreerd tot 1 μL per 1 x 10^{6 cellen} .
4. Sussifiseer T-cellen opnieuw met een dichtheid van 1 x 10^{7 cellen} per ml en tel de berekende hoeveelheid biotinyleerde antilichamen op. Incubeer 20 minuten op 4 °C.
5. Spoel door 10 mL MACS-buffer toe te voegen en centrifugeer 10 minuten op 300 x g. Aspiraat en gooi supernatant weg.
6. Sussief T-cellen op 1 x 10^{7 cellen} per 80 μL MACS-buffer. Voeg antibiotine-microkorrels toe met een volume van 20 μL per 1 x 10^{7 cellen} . Meng goed en laat het 15 minuten incuberen op 4 °C.
7. Spoel door 10 mL MACS-buffer toe te voegen en centrifugeer 10 minuten op 300 x g. Aspiraat en gooi supernatant weg. Suspensieer cellen opnieuw in 500 μL MACS-buffer.
8. Plaats voorgekoelde LS-kolom(s) op een magneet. Plaats een 15 mL conische buis eronder om vloeistofdoorstroming op te vangen.
9. Evenwicht elke LS-kolom met 3 mL MACS-buffer. Met dezelfde 15 mL conische buis als de verzamelbuis breng je de celsuspensie aan op de evenwichtige LS-kolom.
10. Was de kolom 3x met 1 ml MACS Buffer. Laat elke 1 mL wash volledig door de LS-kolom gaan voordat je de volgende wash aanbrengt.
11. Om transgeen-positieve cellen te verzamelen, neem je de LS-kolom van de magneet en plaats je deze in een verse 15 mL conische buis. Voeg 5 mL MACS-buffer toe en duw de vloeistof voorzichtig uit de kolom.
12. Tel de geïsoleerde cellen en centrifugeer 10 minuten op 300 x g. Sussief de transgen-positieve cellen opnieuw in een passend volume medium aangevuld met IL-2 en incubeer tot functionele en/of fenotypische beoordelingen worden uitgevoerd. Voer een zuiverheidscontrole uit voordat je de workflows start door te kleuren voor de CAR- of surrogaattransductiemarker (Aanvullende Figuur 2).

5. Systeemvoorbereiding

1. Zet het instrument aan en open de Cell Analysis Suite (CAS)-software. Zorg ervoor dat de afvalcontainer leeg is. Controleer of er water in de luchtbevochtigerkolom zit.
2. Ga naar het workflows-paneel. Open de Full Clean-workflow (vooraf geladen tijdens de systeeminstallatie).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Full Clean-workflow binnen 72 uur na het starten van een experiment op het instrument uit te voeren.
3. Voer alle controles uit en ga verder door op Start te klikken. Wissel bij verzoek de conische buizen en reagensflessen in elk van de reagentiavakken door verse containers met BLI reinigingsoplossing. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
4. Op verzoek verwissel je de conische buizen en reagensflessen in elk van de reagentenbay-slots door verse containers met steriel water. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
5. Open de Pre-flight Check-workflow (vooraf geladen tijdens de installatie van het systeem). Voer alle controles uit en ga verder door op Start te klikken.
6. Bereid een 50 mL conische buis voor met 2 mL bevochtigingsoplossing. Bereid een aparte 50 mL conische buis voor met 39,6 mL 1x DPBS en 400 μL Wettingadditief.
7. Als je erom vraagt, vervang je de Flush-chip door een optofluidica-chip. Klik op het Run-icoon om verder te gaan. Maak het oppervlak van de optofluidica-chip en de nestferrules zorgvuldig schoon met 70% ethanol voordat je de nesten sluit.
8. Vervang bij verzoek de conische buizen en reagensflessen in elk van de reagentenbay-sleuven voor verse containers met de juiste oplossingen.

6. Assay-workflowcreatie

1. Ga naar het workflows-paneel. Selecteer Create new workflow (+), selecteer Opto T-celprofilering, en selecteer vervolgens MCA en Cytotoxicity Assay in het dropdownmenu.
2. Dubbelklik op Multiplex Cytokine Bead Load om de lijst met kralenbelastingen uit te breiden. Als je minder dan 3 cytokinedoelen test, klik dan op de X om cytokineparel(s) uit de lijst met kralen te verwijderen.
3. Werk elk veld bij met het juiste type kraal, het cytokinedoel en de importlocatie.
   OPMERKING: De CAS-software laadt automatisch elke cytokine-capture-kraal in volgorde van afnemende Cy5-helderheid, ongeacht hoe de laaditems van de parelen zijn gerangschikt.
4. Klik dubbel op Prioritized APC Load met Control om de load lijst van de doelcel uit te breiden. Als je meer dan 1 controle-doelcel en 1 monster doelcellijn test, voeg dan extra cellaadstappen toe.
5. Werk elk veld bij met de gewenste naam van de doelcellijn, het gewenste veld van weergaven (FOV's) om te penen, en de APC-selectiecriteria (door het sjabloonbestand van de doel-pen selectie (TPS) te specificeren).
6. Selecteer T-cel belastingconfiguratie en selecteer meerdere cellijnen. Dubbelklik op Prioritized T Cell Load om de T-cel load lijst uit te breiden.
7. Werk elk veld bij met de gewenste T-cel lijnnaam, gewenste FOV's om te markeren en T-cel selectiecriteria (door het TPS-sjabloonbestand te specificeren).
8. Dubbelklik op Cytotoxicity Assay om de instellingen voor cytotoxiciteitsassay uit te breiden. Werk de workflow-specifieke Imaging Settings-velden bij met de gewenste Assay Duration (h).
9. Dubbelklik fenotype- en cytokine-assays om het kleuringsprotocol voor de cytokinesecretie-assay uit te breiden.
10. Werk de On Chip Staining-velden bij met de juiste importlocatie voor de primaire en secundaire kleurstoffen.
11. Klik dubbel op T-cel ontladen om de uitlaadlijst uit te breiden. Werk het # van exporten per chip (inclusief blanco's) veld bij naar het gewenste aantal exporten. Sla de nieuw aangemaakte workflow op en open hem.

7. Cytokinevangstlading

1. Sonicate en/of vortex elk kraalflesje om de vangkralen volledig opnieuw te laten hangen. Bepaal de kraalconcentratie via een celteller.
2. Stel de korreldichtheden aan op 4,5 x 10⁶ ballen/mL (Type A kralen) of 4 x 10⁶ ballen/mL (Type B kralen) in 30 μL Bead Dilution Buffer.
3. Bewaar de kraalsuspensies bij 4 °C totdat je wordt gevraagd om in de laadruimte van het monster te laden. Voer alle controles uit en ga verder door op Start te klikken.
4. Wanneer daarom wordt gevraagd, meng je de cytokine-parelophanging met een 20 μL pipet en laad je de kraalophanging op de juiste importlocatie. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
5. Wanneer daarom wordt gevraagd, inspecteer visueel verschillende FOV's om te verifiëren dat de vangkralen met een gelijkmatige verdeling over de vloeistoffen kanalen zijn geladen met een passende dichtheid. Als de belastingverdeling en/of dichtheid suboptimaal waren, selecteer dan Flush en Import om opnieuw te proberen de bead te laden. Als de belastingverdeling en dichtheid voldoende waren, selecteer dan Doorgaan om te beginnen met het pennen van kralen.
6. Herhaal stap 7.3 voor elke cytokinevangstkraal.

8. Doelcelbelasting

1. Bepaal de levende celdichtheid van elke doelcellijn met behulp van Trypan Blue-kleuring.
   OPMERKING: Deze workflow gaat ervan uit dat de doelcellen afkomstig zijn van actieve culturen. Als in plaats daarvan gecryopreserveerde cellen worden gebruikt, zorg er dan voor dat de cellen ten minste één passage na het ontdooien zijn gekweekt en voor minstens 90% levensvatbaar zijn.
2. Oogst 1 x 10 van⁶ doelcellen in een microfugebuis van 1,7 mL. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspireer het supernatant.
3. Sussief elke doelcelpellet opnieuw in 100 μL Annexine V kleuringsoplossing. Incubeer 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
4. Voeg 400 μL 1x Annexin V Binding Buffer toe en hersuspendeer door te pipetteren. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspireer het supernatant.
5. Suss elke doelcelpellet opnieuw in 250 μL laadmedium + CaCl₂. Bewaar de suspenties van de doelcel op 4 °C totdat je wordt gevraagd om in de laadruimte van het monster te laden.
6. Wanneer daarom wordt gevraagd, skort je de doelcellen opnieuw met een 200 μL pipet en laad je de doelcel-suspensie op de juiste importlocatie. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
7. Wanneer daarom wordt gevraagd, inspecteer visueel verschillende FOV's om te verifiëren dat de doelcellen met een gelijkmatige verdeling over de vloeistofkanalen zijn geladen met een geschikte dichtheid. Als de belastingverdeling en/of dichtheid suboptimaal waren, selecteer dan Flush en Import om opnieuw te proberen doelcel te laden. Als de belastingsverdeling en dichtheid voldoende waren, selecteer dan Doorgaan om te beginnen met TPS-gating.
8. Wanneer daarom gevraagd wordt, navigeer dan naar Manual Operations, klik dan op TPS en laad de gevraagde TPS-template.
9. Specificeer de optische filter(s) en FOV's die gefotografeerd moeten worden voor het definiëren van TPS-poorten, en klik vervolgens op Alleen vastleggen om beeldverwerving te starten.
10. Open de Gating Configuration Editor, klik op het selectievakje voor Annexin en selecteer het juiste kanaal voor Annexin V-kleuring voor de X-parameter. Selecteer in het dropdownmenu Log (Delta Median Brightness). Selecteer OEP voor de Y-parameter. Selecteer in het keuzemenu 'Dichtstbijzijnde buurman'.
11. Sleep de hoeken van de resulterende poort om Annexin V^high en Nearest Neighbor^low cellen uit te sluiten, en sla vervolgens de TPS-template op zonder de bestandsnaam te wijzigen.
12. Ga terug naar Workflows en klik op Doorgaan om verder te gaan met het schrijven. Herhaal stappen 8.7-8.11 voor elke doelcellijn.

9. T-celbelasting

1. Bepaal de levende celdichtheid van elke T-cellijn via Trypan Blue-kleuring.
   OPMERKING: Deze workflow gaat ervan uit dat de T-cellen afkomstig zijn van actieve culturen. Als in plaats daarvan cryopreserveerde cellen worden gebruikt, zorg er dan voor dat de cellen na ontdooiing 's nachts zijn gekweekt en minstens 90% levensvatbaar zijn.
2. Oogst 1 x 10 cellen van⁶ T in een microfugebuis van 1,7 mL. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspireer het supernatant.
3. Sussief elke doelcelpellet opnieuw in 100 μL Annexine V kleuringsoplossing. Incubeer 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
4. Voeg 400 μL 1x Annexin V Binding Buffer toe en hersuspendeer door te pipetteren. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Aspireer het supernatant.
5. Suspendeer elke T-celpellet opnieuw in 250 μL laadmedium + CaCl₂. Bewaar de T-cel suspenties bij 4 °C totdat je wordt gevraagd om in de laadruimte te laden.
6. Wanneer daarom wordt gevraagd, suspenteer je de doelcellen opnieuw met een 200 μL pipet en laad je de T-cel suspensie op de juiste importlocatie. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
7. Wanneer daarom wordt gevraagd, inspecteer visueel verschillende FOV's om te verifiëren dat de T-cellen met een gelijkmatige verdeling over de fluïdische kanalen zijn geladen met een geschikte dichtheid. Als de belastingsverdeling en/of dichtheid suboptimaal waren, selecteer dan Flush en Importeren om opnieuw te proberen T-cel belasting te doen. Als de belastingsverdeling en dichtheid voldoende waren, selecteer dan Doorgaan om te beginnen met TPS-gating.
8. Wanneer daarom gevraagd wordt, navigeer dan naar Manual Operations, klik dan op TPS en laad de gevraagde TPS-template.
9. Specificeer de optische filter(s) en FOV's die gefotografeerd moeten worden voor het definiëren van TPS-poorten, en klik vervolgens op Alleen vastleggen om beeldverwerving te starten.
10. Open de Gating Configuration Editor, klik op het selectievakje voor Annexin en selecteer het juiste kanaal voor Annexin V-kleuring voor de X-parameter. Selecteer in het dropdownmenu Log (Delta Median Brightness). Selecteer OEP voor de Y-parameter. Selecteer in het keuzemenu 'Dichtstbijzijnde buurman'.
11. Sleep de hoeken van de resulterende poort om Annexin V^high en Nearest Neighbor^low cellen uit te sluiten, en sla vervolgens de TPS-template op zonder de bestandsnaam te wijzigen.
12. Ga terug naar Workflows en klik op Doorgaan om verder te gaan met het schrijven. Herhaal stappen 9.7-9.11 voor elke T-cellijn.

10. Cytotoxiciteitstest

1. Bereid perfusiemedium voor in een 50 mL conische buis door 100 μL voorontdooid NucView 530 Caspase-3 reagens toe te voegen aan 20 mL T-celmedia (voorraadconcentratie 1 mM, eindconcentratie 5 μM).
2. Wanneer daarom wordt gevraagd, vervang de juiste conische buis in de reagentia-sleuven met de voorbereide conische buis met perfusiemedia. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
   OPMERKING: 20 mL perfusiemedium is voldoende om een enkele optofluidica-chip voor 24 uur te perfuseren. Bereid extra perfusiemedium voor als de cytotoxiciteitstest langer dan 24 uur zal duren.
3. Indien gewenst, beëindig eventuele resterende cytotoxiciteitsassay-beeldvormingsstappen op elk moment na 14 uur door te klikken op 'Sla de rest van de TPS-beeldvorming over' en ga verder met de workflow.

11. Fenotype en cytokinetest

1. Bereid de primaire kleuringsoplossing voor in een 1,7 mL microfugebuis door 76 μL multiplex Human CD8/NK Panel Detection Antibodies en 4 μL anti-CD137_BV421 te mengen.
2. Meng door te pipetteren en bewaar op 4 °C totdat je wordt aangemoedigd om te laden. Op verzoek mengt u de primaire kleuringsoplossing met een 20 μL pipet en laadt u op de juiste importlocatie. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.
3. Bereid de secundaire kleuringsoplossing voor in een aparte 1,7-mL microfugebuis door 72 μL 1x DPBS te mengen met 8 μL van de multiplexkit SA-PE.
   OPMERKING: De secundaire kleuroplossing moet van tevoren worden voorbereid, zodat deze direct na het primaire kleuren klaar is om te laden.
4. Meng door te pipetteren en bewaar op 4 °C totdat je wordt aangemoedigd om te laden. Wanneer daarom wordt gevraagd, meng je de secundaire kleuringsoplossing met een 20 μL pipet en laad je op de juiste importlocatie. Klik op het Run-icoon om verder te gaan.

12. Assayanalyse

1. Ga naar het bureaublad en open de Assay Analyzer-software . Selecteer Assay Analyzer, selecteer Workflows en selecteer vervolgens het workflowtype dat geanalyseerd moet worden.
2. Gebruik welke gewenste criteria dan ook om de pens van belang voor het lossen te definiëren. Genereer de ontlaadlijst volgens de gewenste criteria, ga dan terug naar de CAS-software en selecteer 'Continue selected workflow'.
3. Controleer of het selectievakje voor de Create exportlist met Assay Analyzer is aangevinkt: [optofluidics Chip ID] is aangevinkt.

13. Lossen

1. Bereid een 96-put ronde bodemplaat voor met 50 μL T-cel media per put. Klik op Doorgaan om door te gaan met het uitladen van de cel.
2. Als daarom gevraagd wordt, open dan de laadruimte van de chip, open het deksel van het nest en verwijder de optofluidicachip. Plaats de chip in een steriele petrischaal, met de bovenrand van de optofluidica-chip >1° verhoogd om te voorkomen dat cellen uit de pennen rollen. Bewaar in een steriele weefselkweek-incubator tijdens de volgende spoelstap.
3. Plaats een steriele Flush-chip in het lege nest, sluit het nestdeksel en sluit dan de chipbay. Klik op Klaar en ga dan door.
4. Als je daarom vraagt, open je de chiplaadruimte, open je het nestdeksel en verwijder je de Flush-chip. Plaats de optofluidica-chip terug in het lege nest, sluit het deksel van het nest en sluit dan de chipruimte. Klik op het run-icoon om verder te gaan.
5. Wanneer daarom gevraagd wordt, selecteer Open om het menu Laad-/Ontlaadbare Put Plate te tonen. Klik op Ontladen om de vorige plaat te verwijderen. Werk de putplaat-ID en het type putplaat bij, selecteer Laden en vervolgens Klaar.
6. Klik op Doorgaan om door te gaan met het uitladen van de cel. Zodra alle gewenste pennen zijn uitgeladen, navigeer je naar Handmatige Bedieningen en open je de chipruimte om de plaat met de cellen van belang te pakken.

Results

Met het beschreven protocol hebben we individuele mock-nucleofecte, CAR- en c-Jun-overexpressieve CAR T-cellen bestreden met antigeen-negatieve of antigeen-positieve Figuur 3 K562 tumorcellen, of deze niet gestimuleerd (alleen T-cel). Doelcellen werden beoordeeld op hun homogene expressie van het antigeen als voorwaarde voor reproduceerbare resultaten (Aanvullende Figuur 3). Door hun isolatie in enkele nanopennen konden we de cytokine-expressieprofielen van deze cellen karakteriseren als enkel-, dubbel- of drievoudige producenten, afhankelijk van de geteste conditie (Figuur 3). Deze resultaten werden geverifieerd met ELISA als gevestigde methode voor cytokinedetectie (Aanvullende Figuur 4).

Zoals verwacht bleef de meerderheid van de mock-nucleofect T-cellen negatief voor alle drie de gemeten cytokines (TNF-α, IFN-γ en IL-2). Onder standaard CAR T-cellen werden dubbel-, drievoudige- en enkel-positieve IFN-γ cytokineproducenten, evenals kleine fracties TNF-α- en IL-2-afscheidende cellen, gedetecteerd bij antigeenuitdaging, terwijl blootstelling aan antigeen-negatieve tumorcellen geen multicellulaire cytokinesecretie veroorzaakte. Interessant genoeg verhoogde overexpressie van c-Jun het aandeel van dubbel- en drievoudige cytokineproducenten, evenals enkel-cytokine producerende cellen, bij de ontmoeting met het doelwit, waardoor het totale aandeel cytokine-negatieve cellen vergeleken met standaard CAR T-cellen werd verlaagd. Deze resultaten zijn consistent met eerdere rapporten die de fenotypische modulatie van CAR T-cellen beschrijven door gedwongen expressie van deze transcriptiefactor⁶. Opmerkelijk is dat we een groter aandeel IFN-γ–positieve cellen in de T-cel-only groep waarnamen dan in de antigeen-negatieve tumorcelgroep, wat mogelijk te wijten is aan het kleinere aantal cellen dat in die toestand werd geanalyseerd.

Om T-celactivatie verder te onderzoeken, hebben we de expressie van CD137 onderzocht in individuele mock-nucleofecte, CAR- en c-Jun-overexpressieve CAR T-cellen, behandeld zoals hierboven beschreven (Figuur 4 en aanvullende tabel 1). De uitdaging van CAR T-cellen met antigeen-expressieve K562-doelcellen resulteerde in een verhoogde CD137-expressie vergeleken met mock-nucleofecten cellen. Bovendien zagen we een trend naar een iets hoger aandeel CD137-positieve cellen onder c-Jun-overexpressieve CAR T-cellen vergeleken met het standaard CAR-product.

Concluderend maakte het beschreven protocol de beoordeling van cytokinesecretie en activatie van CAR T-cellen op enkelcelniveau mogelijk, waardoor de identificatie van eencellige en meercellige cytokineproducenten en het repracituleren van fenotypische trends op bulkniveau⁶ mogelijk werd.

Figuur 1: Schematische workflow voor multimodale profilering via een optofluidicaplatform. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve afbeeldingen van verschillende functies van optofluidica-platforms. (A) Importeer de reeks van losse deeltjes in individuele pennen via OEP. De pennen in het linkerdeel van de afbeeldingen zijn in de vorige volgorde geladen. (B) Het doden van gebeurtenissen in drie individuele hokken over de tijd, waarbij GFP-expressieve antigeen-expressieve tumorcellen worden getoond. (C) Export van een individuele cel uit één pen via OEP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve analyse van cytokinesecretieprofielen op enkelcelniveau. Individuele mock-nucleofected T-cellen of CAR-T-cellen werden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van antigeen-negatieve of antigeen-positieve K562-tumorcellen binnen nanopennen met cytokinevangstkorrels voor TNF-α, IL-2 en IFN-γ. Taartdiagrammen tonen de verhoudingen van individueel geanalyseerde CAR-T-cellen met het aangegeven cytokinesecretieprofiel na 24 uur co-cultuur (eindpuntanalyse). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve analyse van CD137-expressie op enkelcelniveau. Individuele mock-nucleofect T-cellen of CAR-T-cellen werden gekleurd op CD137-oppervlakteexpressie op de optofluidicachip, 24 uur na kweek in aanwezigheid of afwezigheid van antigeen-negatieve of antigeen-positieve K562-tumorcellen. Vioolgrafieken tonen de fluorescentieintensiteit van CD137-expressie op nep-nucleofecteerde T-cellen en CAR-T-cellen na 24 uur kweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

T-cel medium componenten (Steriel gefilterd met 0,22μM vacuümfilterunits)	Volume (eindconcentratie)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilline/Streptomycine (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoethanol (50mM)	0,5 mL (45μM)
Menselijk Serum (hitte-geïnactiveerd)	50 mL (9%)
GlutaMAX supplement (100x)	5 ml (0,9x)
Componenten van tumorcelmedium	Volume (eindconcentratie)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilline/Streptomycine (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Fetaal Kalfserum (hitte-geïnactiveerd)	50 mL (9%)
MACS-buffercomponenten	Volume (eindconcentratie)
DPBS (Mg2+-vrij, Ca2+-vrij)	500 mL
Fetaal Kalfserum (hitte-geïnactiveerd)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
PBS/EDTA-buffercomponenten	Volume (eindconcentratie)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Laadmediacomponenten	Volume (eindconcentratie)
T-celmedium	18 mL
Laadreagens	2 mL
Media+CaCl 2-componenten laden	Volume (eindconcentratie)
Laadmedia	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Perfusiemedia+Caspase-substraat	Volume (eindconcentratie)
T-celmedium	20 mL
NucView 530 Caspase-3 Substraat (1 mM in DMSO)	100 μL
Componenten van de kraalverdunningsbuffer	Volume (eindconcentratie)
DPBS	800 μL
BSA (2% met toeval)	100 μL (0,2% w/v)
Pre-20 (10% met relatie)	10 μL (0,1% w/v)

Tabel 1: Media- en buffervoorbereiding.

Aanvullende Figuur 1. Voorbeeldige gatingstrategie om de genoverdrachtsefficiëntie te beoordelen vóór magnetische verrijking. Voorbeeldige contour- en histogramgrafieken tonen de gatingstrategie om CAR-expressieve (tEGFR-positieve) CAR T-cellen te identificeren nadat genoverdracht is uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Zuiverheidscontrole na sortering. Voorbeeldige contourgrafieken tonen het aandeel CAR-expressieve (tEGFR-positieve) CAR T-cellen nadat magnetisch sorteren is uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3. Antigeenexpressie op doeltumorcellen. Representatieve histogramgrafieken tonen WT K562 tumorcellen of zijn ontworpen om ROR1 te expresseren, gekleurd met isotype of ROR1-targeting antistof via flowcytometrie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4. Cytokinedetectie met standaard ELISA. IL-2 en IFN-γ concentraties in supernatant na 24 uur co-kweek met K562^ROR1 tumorcellen bij E:T van 4:1, gemeten via ELISA voor CAR versus CAR+cJ T-cellen. Statistische significantie zoals bepaald door een ongepaarde t-test met *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Cellen geanalyseerd. De tabel geeft het aantal individuele cellen aan dat per conditie is geanalyseerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De gedemonstreerde workflow maakt evaluatie mogelijk van de cytokinesecretie en activatieprofiel van individuele CAR-T-cellen tijdens co-kweek met antigeen-positieve en antigeen-negatieve doelcellen, die optioneel gecombineerd kunnen worden met cytolytische activiteitsbeoordeling. Hoewel het vermogen om multimodale functionele data op single-cel resolutie vast te leggen een manier biedt om de prestaties van CAR T-cellen met ongekende precisie te analyseren, is de kwantificeerbaarheid van de metingen sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de OEP-technologie bij het laden van hetzelfde aantal cytokinevangstkorrels, doelcellen en CAR-T-cellen in elke pen. Het is daarom cruciaal om ervoor te zorgen dat de laaddichtheid en TPS-criteria van elk reagens of celmonster geoptimaliseerd zijn om single-bead en/of single-cell lading in elke pen mogelijk te maken. Hoewel het aanpassen van de concentratie van de korrel of celsuspensie in de fluidicakanalen voldoende penladen mogelijk maakt, dienen de Flush- en Import-opties van het platform als een extra strategie om het laadproces opnieuw te proberen.

Een voordelig kenmerk van het optofluidica-chipontwerp is de scheiding van de penindeling in 22 verschillende FOV's. Door T-cellen die met verschillende CAR-constructies zijn ontworpen in verschillende FOV's binnen de optofluidicachip te laden, konden we ook beoordelen of een alternatief construct dat c-Jun-overexpressie afdwingt, de generatie van CAR-T-cellen met multimodale functionaliteit kon verbeteren, vergeleken met een standaard CAR-construct (Figuur 3 en Figuur 4). Op deze manier biedt een optofluidicaplatform middelen om snel kandidaat-CAR-constructen te identificeren die mogelijk de duurzaamheid van door CAR-T-cellen geïnduceerde kankerremissie kunnen vergroten. Opmerkelijk is dat de analyse van interactie tussen doel- en effectorcellen op enkelcelniveau cruciale controle vereist van belangrijke parameters, bijvoorbeeld de heterogeniteit van doelantigeenexpressie op tumorcellen en zuiverheid van de CAR-T-celpopulatie (Aanvullende Figuur 2 en Aanvullende Figuur 3).

Hoewel we ons hebben gericht op het evalueren van IL-2, TNF-α en IFN-γ secretie, maakt het brede scala aan oplosbare analyten die kunnen worden gedetecteerd met commercieel verkrijgbare multiplex cytokine-capture panels aanzienlijke aanpassing van de workflow mogelijk. Recente ontwikkelingen tonen aan dat het vakgebied ook vordert richting hoogdimensionale flowcytometrie, wat nieuwe mogelijkheden opent voor synergieën met functionele profilering van verschillende immuunceltypen^12,13. Toekomstige toepassingen kunnen bijvoorbeeld screeningscampagnes omvatten om polyfunctionele CAR-expressieve regulerende T-cellen (Tregs) te identificeren. Deze scheiden meerdere ontstekingsremmende cytokines uit, zoals TGF-β en IL-10¹⁴. Zo kan de aanpassingskracht van een optofluidicasysteem de weg vrijmaken voor cruciale inzichten naarmate cellulaire immunotherapieën zich uitbreiden naar nieuwe grenzen in de behandeling van niet-kwaadaardige ziekten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-D Nucleofector	Lonza
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-096-495
CELLSTAR 15-ml conical tubes (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
CELLSTAR 50-ml conical tubes (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap	Corning	430720U
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3526
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3548
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	for in-house conjugation (biotin)
EGFR Antibody (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Fetal Bovine Serum, Value	Thermo Fisher	A5256801
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050038
Human IL-2 IS, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human Serum	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ German Red Cross (GRC)	N/A
MACS Cell separation column, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3032
Pancoll human, Density: 1.077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	559763
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Pierce Cell Surface Biotinylation and Isolation Kit	Thermo Fisher	A44390
QuadroMACS Starting Kit (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, Glutamax Supplement, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Serological pipettes 2, 5, 10, 25 and 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Stain (0,4%)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Mercaptoethanol (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Beacon reagents
96-well plate round-bottom	Corning	3799
Beacon Plastic Flush chip		500-00030
BLI Cleaning Solution, Sodium Hypocloite, 0.825%	Bruker	520-08000
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Brilliant Violet 421 anti-human CD137 (4-1BB) Antibody	Biolegend	309820
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Human IFN-γ Capture Beads B3, 13X	Biolegend	740545
LEGENDplex Human IL-2 Capture Bead A5, 13X	Biolegend	740934
LEGENDplex Human Th Panel Detection Antibodies V02	Biolegend	741041
LEGENDplex Human TNF-α Capture Bead B7, 13X	Biolegend	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegend	740452
NucView 530 Caspase-3 Substrate, 1 mM in DMSO	Hölzel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379
Vegan Export Buffer	Bruker	520-00040
VWR Media Bottles, Square, PETG, 125ml	VWR	216-2265
VWR Media Bottles, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Wetting Additive	Bruker	520-08016
Wetting Solution	Bruker	520-00009