Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Therapeutische effecten van Acorus calamus L. Extract op door straling veroorzaakte huidbeschadiging in een rattenmodel

469 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69705

⸱

9 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

In dit artikel

Samenvatting

Door straling veroorzaakte huidbeschadiging is een veelvoorkomende en ernstige complicatie van radiotherapie bij kankerpatiënten. Er is geen effectieve klinische behandeling. Dit protocol evalueert het therapeutische effect van Acorus calamus L.-extract op door straling veroorzaakte huidbeschadiging, met als doel nieuwe geneesmiddelkandidaten en therapeutische strategieën te bieden voor de klinische preventie en behandeling.

Samenvatting

Door straling veroorzaakte huidbeschadiging is een veelvoorkomende en slopende complicatie bij kankertherapie, die vaak leidt tot vertraagde wondgenezing en meer ongemak bij patiënten. Er zijn enkele therapeutische geneesmiddelen beschikbaar voor preventie of behandeling. Traditionele Chinese geneeskunde, met name Acorus calamus L., heeft potentieel getoond bij de behandeling van diverse huidaandoeningen, maar de effectiviteit ervan bij door straling veroorzaakte huidbeschadiging is nog onderbelicht.

Deze studie gebruikte een Sprague-Dawley rattenmodel dat werd blootgesteld aan 45 Gy straling om huidbeschadiging te veroorzaken. Ratten werden 45 dagen behandeld met 10%, 20% en 40% Acorus calamus L.-extract. Wondgenezing, ontsteking, apoptose en angiogenese werden beoordeeld met behulp van wondgenezingssnelheden, histopathologische analyse, cytokinemetingen, TUNEL-kleuring en immunohistochemie. De behandeling met Acorus calamus L. versnelde wondgenezing, waarbij de groep met middele dosering de hoogste genezingsgraad vertoonde (88,97% na 45 dagen). Histopathologische analyse toonde verminderde ontsteking, verbeterde collageenorganisatie en vorming van nieuwe bloedvaten aan. Serumniveaus van inflammatoire cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) waren significant verlaagd en apoptose was afgenomen, met modulatie van belangrijke apoptotische eiwitten (P53, Bax, Bcl-2). De expressie van VEGF en bFGF werd opgereguleerd, wat angiogenese en weefselherstel bevorderde. Acorus calamus L. verbetert de genezing van door straling veroorzaakte huidbeschadigingen door ontstekingen te verminderen, apoptose te remmen en angiogenese te bevorderen. Deze bevindingen suggereren het potentieel als therapeutisch middel voor het beheersen van door straling veroorzaakte huidschade, wat een veelbelovend alternatief biedt voor het behandelen van door straling veroorzaakte huidletsel in de klinische oncologie. Verdere studies zijn nodig om de moleculaire mechanismen ervan te verduidelijken.

Inleiding

Door straling veroorzaakte huidbeschadiging is een veelvoorkomende en moeilijke complicatie van zowel nucleaire ongelukken als tumorbestraling1. Bij radiotherapie ontwikkelt ongeveer 95% van de patiënten enige mate van huidbeschadiging, waaronder erythema, desquamatie, terugkerende necrotische zweren, aanhoudende pijn en een verhoogd risico op maligne progressie2. Deze laesies zijn vaak weerbestendig voor behandeling, wat de kwaliteit van leven van patiënten aanzienlijk vermindert en soms een onderbreking van radiotherapie noodzakelijk maakt, wat een grote klinische uitdaging vormt in de bestralingsoncologie3. De onderliggende mechanismen van door straling veroorzaakte huidschade zijn complex en draaien voornamelijk om de productie van vrije radicalen in het huidweefsel, wat cellulaire processen verstoort en het genezingsproces verergert 4,5. Dit resulteert in langdurige expressie van apoptose-gerelateerde genen, ontregelde ontstekingsreacties en veranderde signaalpaden, die allemaal bijdragen aan het aanhoudende karakter van door straling veroorzaakte wonden6.

Er is momenteel geen universeel geaccepteerde goudstandaardtherapie voor door straling veroorzaakte huidbeschadiging. Het klinische beheer legt de nadruk op ontstekingsremmende of antioxidante benaderingen7, met name topische corticosteroïden, die huidreacties verminderen via ontstekingsremmende, immunosuppressieve en vasoconstrictieve effecten, maar huidverdunning kunnen veroorzaken bij langdurig gebruik8. Amifostine, een door de FDA goedgekeurd radiobeschermend middel, is beperkt in klinisch gebruik vanwege significante bijwerkingen9. Groeifactoren versnellen wondgenezing door celproliferatie, angiogenese en granulatieweefselvorming te bevorderen, maar hun werking is nauw gericht, biedt beperkte controle over diepweefselletsel en ontsteking, en brengt een risico op overmatige hyperplasiemet zich mee. Daarom heeft Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) de aandacht getrokken vanwege haar holistische filosofie, meerdere actieve bestanddelen met diverse therapeutische effecten en een gunstig veiligheidsprofiel. Eerdere studies hebben aangetoond dat natuurlijke producten, zoals zoethoutextract, aloë-polysacchariden en curcumine, door straling veroorzaakte ontstekingen en weefselschade verlichten door vrije radicalen te verwijderen, pro-inflammatoire mediatoren (TNF-α, IL-6) te remmen en de proliferatie van fibroblasten te bevorderen 10,11,12. De meeste van deze onderzoeken onderzoeken echter enkele actieve verbindingen of enkele doelwitten, wat onvoldoende inzicht geeft in de mechanismen van meercomponenten-synergistische werking. Acorus calamus L., een plant die bekend staat om zijn ontstekingsremmende, antioxiderende, antibacteriële en wondgenezende eigenschappen, heeft potentieel getoond bij diverse huidaandoeningen.

Acorus calamus L., een vaste plant uit de familie Araneae, bevat verschillende bioactieve verbindingen, waaronder terpenen, fenylpropanoïden, flavonoïden, steroïden en alkaloïden. De samenstelling van meerdere componenten maakt gelijktijdige werking op meerdere doelwitten mogelijk, wat synergistische farmacologische effecten oplevert13. Studies tonen aan dat het ontstekingssignaleringsroutes zoals NF-κB en MAPK remt en dosisafhankelijk de mRNA-expressie van pro-inflammatoire factoren zoals TNF-α en IL-6 verlaagt, terwijl het de activiteit van antioxidante enzymen zoals SOD en GSH-PX verhoogt, waardoor het ontstekingsremmende, antioxiderende en antibacteriële effecten uitoefent14,15. Ondanks de gedocumenteerde voordelen bij de behandeling van huidaandoeningen veroorzaakt door infecties en allergieën, blijft de rol van Acorus calamus L. bij door straling veroorzaakte huidbeschadigingen onderbelicht. Recente studies hebben aangetoond dat de beschermende effecten tegen door straling veroorzaakte schade worden aangetoond, waarbij wondgenezing wordt bevorderd en ontstekingwordt verminderd. De specifieke therapeutische mechanismen van Acorus calamus L. bij door straling veroorzaakte huidbeschadigingen zijn echter nog niet volledig opgehelderd.

Het algemene doel van deze studie is het evalueren van de therapeutische effecten van Acorus calamus L.-extract in diermodellen van door straling veroorzaakte huidbeschadiging. We beoordelen wondgenezing, ontstekingsreacties en cellulair gedrag om de werkingsmechanismen van het extract vanuit meerdere perspectieven te verduidelijken. De bevindingen zijn bedoeld om een theoretische basis te leggen voor het gebruik van Acorus calamus L. bij het klinisch behandelen van huidlaesies die ontstaan door radiotherapie bij kanker. Daarnaast zal de studie de functionele kenmerken van het extract, geschikte interventiescenario's en kerngegevens over de effectiviteit presenteren om lezers te helpen beoordelen of deze op natuurlijke producten gebaseerde benadering aansluit bij hun onderzoeks- of klinische behoeften. Uiteindelijk zoekt dit werk naar effectieve therapeutische opties om de kwaliteit van leven te verbeteren voor patiënten die tumorbestraling ontvangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierproeven die in deze studie worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Animal Medical Research Ethics Committee van het Northern Theater Command General Hospital (Ethics Approval Number: 2018-03). SPF-kwaliteit mannelijke SD-ratten (6-8 weken, gewicht 190-220 g) werden voor de studie gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het huisvesten van de proefdieren

  1. Selecteer 108 mannelijke SD-ratten met SPF, tussen de 6 en 8 weken oud en met een gewicht tussen de 190 en 220 g.
  2. Houd de kamertemperatuur van het dier op 22 ± 2 °C, de relatieve luchtvochtigheid op 50 ± 5%, en een licht-donker cyclus van 12 uur. Geef de ratten onbeperkte toegang tot voedsel en water. Na een acclimatisatieperiode van een week ga je verder met de vervolgexperimenten.

2. Groepering van dieren

  1. Verdeel de ratten willekeurig in vijf verschillende groepen: Normale groep (Normaal, n = 18), Modelgroep (Model, n = 18), positieve geneesmiddelgroepen (Positief, n = 18, Betamethasoncrème)16), Lage dosis experimentele groep (Experimenteel-L, n = 18), Medium-dosis experimentele groep (Experimenteel-M, n = 18), en Experimentele groep met hoge dosis (Experimenteel-H, n = 18). Behalve de normale groep werden alle groepen blootgesteld aan straling.

3. Een diermodel van radioactieve huidbeschadiging opstellen

  1. Dien de anesthesie toe met precisie en minimale ongemak door intraperitoneale (i.p.) injectie van een 1% natrium pentobarbitaloplossing (40 mg/kg). Bevestig de diepte van de anesthesie door te kijken naar het ontbreken van de corneale reflex en het ontbreken van reactie op het knijpen van de teen. Breng zalf aan op de ogen van de ratten om droogte te voorkomen.
  2. Verwijder het haar van de ratten met een elektrische scheermachine. Desinfecteer daarna het achterste gebied met jodium en 75% alcohol.
  3. Leg elke rat in een buikliggend. Bevestig de 32P-β bestraler (oppervlaktedosis: 0,9 Gy/min) over het bilaterale wervelkolomgebied (2 cm × 2 cm gebied) gecentreerd 1 cm lateraal van de middenlijn, zodat de bron de epidermis raakt zonder opening. Bevestig de applicator met steriele medische tape om verplaatsing tijdens bestraling te voorkomen. Bestral het doelgebied gedurende 50 minuten om een totale geabsorbeerde dosis van 45 Gy17 te bereiken.
  4. Zodra de rat na bestraling weer bij bewustzijn komt, brengt u hem terug in zijn individuele kooi, zorgt hij voor toegang tot water en voedsel ad libitum, houdt de temperatuur 22 ± 2 °C, de relatieve luchtvochtigheid 50 ± 5% en een licht-donker cyclus van 12 uur.
    OPMERKING: Het experimentele proces moet strikt voldoen aan de vastgestelde principes van biologische en radioactieve beroepsbescherming. Daarnaast moeten alle operationele procedures de richtlijnen volgen voor de juiste en conforme verwijdering van medisch en radioactief afval om de veiligheid en gezondheid van al het betrokken personeel te waarborgen.

4. Bereiding van Acorus calamus L.-extract en toediening van geneesmiddelen

  1. Weeg de wortelstokken van Acorus calamus L., zorg voor grondige reiniging, laat aan de lucht drogen en maal tot een grof poeder (40 mesh). Voeg 10-20 volumes 50% ethanol toe en homogeniseer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur
  2. Na het 30 minuten laten zakken, giet je het supernatant over en voer je een voorlopige filtratie uit door 4-8 lagen gaas om grove onzuiverheden te verwijderen. Filter vervolgens met filterpapier en verdamp het filtraat onder verminderde druk in een roterende verdamper bij 50-60 °C om het oplosmiddel terug te winnen, wat resulteert in een oplosmiddelvrij vast residu (AE, vochtgehalte < 5%).
  3. AE-zalf voorbereiding18
    OPMERKING: Formuleer 10% (Experimenteel-L, w/w), 20% (Experimenteel-M, w/w) en 40% (Experimenteel-H, w/w) Acorus calamus L. extractzalf in overeenstemming met de Chinese Farmacopoea 2020 Edition (Algemeen Hoofdstuk 0109)19.
    1. Weeg AE nauwkeurig (bijv. 20 g voor 20% zalf) en de bijbehorende farmaceutische petrolatum (bijv. 80 g voor 20% zalf).
    2. Voeg 10% van het totale petrolatum toe aan AE, tritureer krachtig gedurende 5 minuten om een homogene pasta te vormen (geometrische verdunningsmethode, waarbij AE gelijkmatig wordt verdeeld in de lipofiele basis).
    3. Smelt het resterende petrolatum bij 60 °C, koel af tot 55 °C en voeg langzaam toe aan de AE-petrolatumpasta.
    4. Roer magnetisch op 250 rpm gedurende 30 minuten bij 55 °C, en roer daarna continu terwijl je afkoelt tot kamertemperatuur om een gladde, deeltjesvrije zalf te krijgen.
    5. Blank control voorbereiding: Smelt petrolatum bij 60 °C, roer 30 minuten op 250 rpm en koel af tot kamertemperatuur (identiek aan de AE zalfbasis).
    6. Bewaar alle zalven en blanco petrolatum bij 4 °C in afgesloten steriele containers.
  4. Alle groepen kregen twee keer daags om 09:00 en 17:00 uur topisch toegediende middelen gedurende 45 opeenvolgende dagen na bestraling (de normale groep, niet-bestraald, kreeg hetzelfde toedieningsschema synchroon). De toegediende dosis was 0,2 g/cm², gelijkmatig verdeeld over een rughuid van 2 cm × 2 cm. De normale groep kreeg voertuig (petrolatum) en de modelgroep kreeg voertuig (petrolatum). De positieve controlegroep kreeg betamethasoncrème. De experimentele groepen L, M en H ontvingen crèmes met AE op respectievelijk 10%, 20% en 40% (w/w). Na elke toepassing werd het behandelde gebied voorzichtig 10 seconden gemasseerd om de opname te verbeteren, en ratten werden 5 minuten vastgehouden om likken te voorkomen.

5. Verzameling van rattenhuidweefsel en bloed

  1. Verdoof de ratten met een oplossing van 1% natrium pentobarbital (40 mg/kg, i.p.). Desinfecteer chirurgische instrumenten en verwijder de huid langs de wondplaats.
  2. Bind een deel van het weefsel in 4% paraformaldehyde (10 mL), een ander deel in glutaraldehyde/osmiumtetroxide (5 mL, 2,5%), en bewaar de rest in vloeibare stikstof voor verdere analyse (zie de Materiaaltabel).
  3. Verzamel bloedmonsters van de abdominale aorta van de rat. Centrifugeren op 3.000 × g bij 4 °C gedurende 15 minuten; aspiraat het supernatant in EP-buizen; aliquot en bewaren bij -80 °C.

6. Genezingsevaluatie

  1. Bekijk de wond op de 7e, 15e, 30e en 45e dagen na bestraling en maak beelden van het wondoppervlak met een high-definition camera. Importeer de afbeeldingen in ImageJ en teken het wondgebied langs de rand van de wond. Bereken het gebied in de afbeelding. Zorg ervoor dat elke bewerking consistent is om meetfouten te voorkomen. Bereken de genezingstijd van de wond en de genezingssnelheid.
    OPMERKING: Wondgenezingssnelheid (%) = (Initiële bestraalde zone - Ongeneesd wondgebied) / Initiële bestraalde zone. Criteria voor wondgenezing: Volledige genezing wordt gedefinieerd als ofwel een korstgebied < 5% van het wondgebied of een genezen gebied > 95% van het wondoppervlak. Initiële bestraalde zone: het wondgebied dat werd gemeten op het moment dat bestraalde dieren een stabiele wond (een basislijn) vertoonden.

7. Elektronenmicroscopieonderzoek

  1. Snelle weefselbemonstering en fixatie
    1. Gebruik een scherp mes om een huidweefselblok van 1 mm³ te verwijderen, dat de epidermis-dermislaag omvat.
    2. Dompel het monster onmiddellijk onder in voorgekoelde 2,5% glutaraldehydefosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4) bij 4 °C gedurende 24 uur voor fixatie.
  2. Demperspoeling
    1. Voer drie washes uit met 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4), met 15 minuten per was.
  3. Na fixatie
    1. Schakel het monster over naar een 1% osmiumtetroxideoplossing bij 4 °C voor fixatie van 1,5 uur.
  4. Graëntendehydratie
    1. Geleidelijk doorgaan acetonconcentraties van 50%, 70%, 80%, 90% en 100%, waarbij elke stap 15 minuten wordt toegewezen.
    2. Herhaal de behandeling drie keer met 100% aceton, waarbij elke onderdompeling 10 minuten duurt.
  5. Epoxyhars inbedding
    1. Laat het monster 2 uur weken in een 2:1 mengsel van aceton en epoxyhars, gevolgd door een nachtelijke onderdompeling in pure epoxyhars.
    2. Polymeriseer het monster bij 60 °C gedurende 48 uur om een massief blok te vormen.
  6. Sectie en beitsen
    1. Maak 70 nm ultradunne doorsneden met een ultramicrotoom.
    2. Kleur 15 minuten met uraniumacetaat, daarna 5 minuten met loodcitraat bij 60 °C.

8. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring

  1. Voer paraffine-inbedding uit
    1. Exciseer huidmonsters, droog met een alcoholgradiënt (bijv. 70%, 80% en 95% ethanol, elk gedurende 15 minuten, gevolgd door twee wisselingen van 100% ethanol, elk voor 15 minuten), en vervolgens over te brengen naar xyleen totdat het weefsel een doorschijnende toestand bereikt.
    2. Dompel onder in paraffine om inbedding te garanderen, en laat daarna verharding toe.
  2. Voer ontwaxing en rehydratatie uit
    1. Dompel paraffinesecties in xyleen I/II gedurende elk 10 minuten.
    2. Spoel xyleen af met 100% ethanol, dompel dan 3 minuten onder in 95% ethanol, 3 minuten 80% ethanol, 3 minuten 70% ethanol, en spoel tenslotte af met gedestilleerd water.
  3. Voer hematoxyline nucleaire kleuring uit
    1. Laat het 7 minuten weken in Harris' hematoxyline-oplossing op kamertemperatuur.
    2. Spoel 10 minuten onder stromend water totdat de blauwe kleur zichtbaar is.
  4. Differentiatie en tegenkleuring implementeren
    1. Differentieer het gebruik van 1% zoutzuur in ethanol gedurende 3 seconden (let op nucleaire helderheid onder de microscoop).
    2. Contrastkleur met een 0,5% ammoniakoplossing gedurende 30 seconden.
  5. Voer eosine-tegenkleuring uit
    1. Kleur met een 0,5% eosine-oplossing (met 1% glaciale azijnzuur) gedurende 90 seconden.
    2. Spoel snel af met gedestilleerd water gedurende 5 seconden om overtollige vlekken te verwijderen.
  6. Voer uitdroging en opruiming uit
    1. Sequentieel passeren ze door 70%, 80%, 95%, 100% ethanol I/II (1 minuut elk).
    2. Maak het schoon met xyleen I/II gedurende 2 minuten per stuk.
  7. Pas afdichting en observatie toe
    1. Breng neutraal hars aan met druppels en bedek dan met een dekmantel.
    2. Droog 30 minuten in een oven van 60 °C voordat je microscopisch onderzoek begint.

9. Massons trichrome kleuring

  1. Voer routinematige ontwaxing uit zoals bij het verkleuren van vóór HE.
  2. Nucleaire kleuring
    1. Laat het 10 minuten weken in hematoxyline-oplossing.
    2. Spoel 5 minuten onder stromend water totdat de blauwe tint weer is teruggekomen.
  3. Collageenvezelkleuring
    1. Dompel je onder in een mengsel van Alizarin Red en Acid Fuchsin gedurende 5 minuten.
  4. Differentiatie van fosphomolybdische zuur
    1. Overbrengen naar een waterige oplossing van 1% fosfomolybdicezuur gedurende 1 minuut.
  5. Tegenkleuring van myovezels
    1. Direct overbrengen naar een oplossing van 2,5% anilineblauw gedurende 5 minuten.
    2. Spoel snel af met een waterige oplossing van 0,5% glaciale azijnzuur gedurende 5 seconden.
  6. Uitdroging en ophanging
    1. Voer gradiënt ethanoldehydratie uit: 95% ethanol I, 100% ethanol II (30 s elk).
    2. Maak het schoon met xyleen.
    3. Monteer met neutrale hars, droog bij 60 °C en bekijk vervolgens onder de microscoop.

10. ELISA-detectie van IL-1β-, IL-6- en TNF-α niveaus

OPMERKING: IL-1β, IL-6 en TNF-α zijn belangrijke pro-inflammatoire cytokines die vaak worden gebruikt om zowel de aanwezigheid als de intensiteit van ontsteking te beoordelen. Het monitoren van hun niveaus is cruciaal om inzicht te krijgen in ontstekingsprocessen en om de effectiviteit van ontstekingsremmende behandelingen te bepalen.

  1. Bereid serummonsters voor
    1. Volg het protocol in stap 5.3 om serummonsters te verzamelen.
  2. Verdunde standaarden en monsters
    1. Maak een gradiëntverdunning van standaarden met gebruik van de sample-verdunner; Verdun serummonsters in een verhouding van 1:4.
  3. Voeg monsters toe en incubeer
    1. Breng 100 μL van de standaard/monster in elke put in; bedek de putten met een membraan; incuberen bij 37 °C gedurende 90 minuten; Gooi dan de vloeistof weg en dep de putten droog.
  4. Antilichaam-enzymreactie detecteren
    1. Geef 100 μL enzymgelabeld reagens specifiek voor IL-1β, IL-6 en TNF-α in elke put; incuberen bij 37 °C gedurende 60 minuten; Verwijder de vloeistof en dep droog; Was de plaat vier keer met 200 μL wasbuffer.
    2. Voeg 100 μL streptavidin-HRP werkoplossing (1:100 verdunning) toe aan elke put; 30 minuten in het donker broeden bij 37 °C; Was de plaat vier keer met 200 μL wasbuffer.
  5. Ontwikkel kleur en beëindig
    1. Breng 100 μL TMB-substraatoplossing in elke put; 10 minuten broeden op kamertemperatuur in het donker; voeg vervolgens 50 μL stopoplossing toe aan elke put.
  6. Leesgegevens
    1. Meet de absorptie bij 450 nm (met een kalibratiegolflengte van 630 nm) met een enzymgekoppelde immunosorbent-assaylezer binnen 30 minuten; bereken de concentratie (pg/mL) met behulp van de standaardcurve.

11. TUNEL-assay

  1. Voorbehandeling van de sectie
    1. Ontwaak en droog paraffinesecties totdat ze gedestilleerd water bereiken.
    2. Introduceer een werkende oplossing van proteïnase K bij een concentratie van 20 μg/mL, en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten.
    3. Was de secties drie keer met PBS, waarbij elke was 2 minuten duurt.
  2. Labelingsreactie
    1. Breng het TUNEL-reactiemengsel toe dat het enzym TdT bevat en fluoresceïne-gelabelde dUTP.
    2. Incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C in het donker gedurende 60 minuten.
  3. Signaalconversie
    1. Was drie keer met PBS, zodat je 5 minuten per wasbeurt kunt gebruiken.
    2. Introduceer een HRP-gelabeld antifluoresceïne-antilichaam bij een verdunning van 1:500.
    3. Bred 30 minuten uit bij 37 °C.
  4. DAB-chromogene ontwikkeling
    1. Na het wassen van PBS breng je een DAB-chromogene oplossing aan en monitor je de ontwikkeling onder een microscoop gedurende 1 tot 3 minuten.
    2. Stop de reactie met gedestilleerd water.
  5. Tegenkleuring en montage
    1. Tegenkleurkernen met hematoxyline gedurende 1 minuut.
    2. Dehydrateer met gegradueerd ethanol, clear met xyleen en monteer met neutrale hars.
  6. Interpretatie van het resultaat
    1. Identificeer apoptotische kernen als bruinachtig-geel, terwijl normale kernen blauw lijken.
    2. Selecteer willekeurig vijf krachtige velden (400×) per dia om de apoptosesnelheid te berekenen.

12. Immunohistochemische kleuring

  1. Waxing en antigeenterugwinning
    1. Paraffinesecties weken in Xyleen I gedurende 10 minuten, daarna overbrengen naar Xyleen II voor nog eens 10 minuten. Vervolgens droog je met een gradiënt ethanolreeks, beginnend met 5 minuten in 100% Ethanol I, gevolgd door 5 minuten in 100% Ethanol II, 3 minuten elk in 95%, 80% en 70% ethanol, en spoel je tenslotte 2 minuten met gedestilleerd water.
    2. Voer hoogdrukwarmteherstel uit met 0,01 M natriumcitraatbuffer bij pH 6,0, waarbij een temperatuur van 121 °C gedurende 3 minuten wordt gehandhaafd.
  2. Blokkeer endogene interferentie
    1. Breng een 3% H2O2-oplossing in op kamertemperatuur gedurende 10 minuten om endogene enzymen te inactiveren.
    2. Breng een 5% BSA-blokkerende oplossing aan op het weefsel en incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 45 minuten; Aspiraat eventuele overtollige blokkerende oplossing zonder te spoelen.
  3. Incubatie van antilichamen
    1. Doeer een 5% BSA-blokkerende oplossing en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    2. Voeg de primaire antistofwerkoplossing toe bij de geoptimaliseerde concentratie (bijv. P53, Bax, Bcl-2, VEGF en bFGF) en incubeer een nacht in een bevochtigde kamer bij 4 °C; Was drie keer met PBS-T buffer die 0,1% Tween-20 bevat, elk 5 minuten lang.
    3. Introduceer een HRP-gelabeld secundair antilichaam verdund 1:200; incuberen in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 60 minuten; Was drie keer met PBS-T buffer gedurende 5 minuten elk. Voeg vervolgens de ABC-conjugaatoplossing toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door drie wasbeurten met PBS-buffer van elk 5 minuten.
  4. DAB-kleurontwikkeling
    1. Voeg een DAB-ontwikkeloplossing toe met 0,02% H₂O₂ en monitor de ontwikkeling onder een microscoop bij kamertemperatuur gedurende 1-4 minuten.
    2. Beëindig de reactie onmiddellijk met gedestilleerd water.
  5. Tegenkleuring en montage
    1. Dompel het monster 1 minuut onder in Harris' hematoxyline-oplossing en spoel het 10 minuten af onder stromend water om blauw herstel te bereiken.
    2. Achtereenvolgens onderdompelen in de volgende oplossingen: 70% ethanol voor 30 s, 80% ethanol voor 30 s, 95% ethanol voor 30 s, 100% ethanol I voor 1 minuut, en 100% ethanol II voor 1 minuut.
    3. Voor volledige opruiming en fixatie, dompel je 2 minuten onder in xyleen I en doop je daarna 2 minuten over in xyleen II. Voeg neutrale resin montagemedium toe in de val, dek af met een deklaag en droog 30 minuten in een oven van 60 °C.
  6. Resultaatkwantificatie
    1. Een bruine kleur duidt op een positieve reactie; Positieve signalen (bruinachtig-geel) moeten worden gecontrasteerd met de negatieve achtergrond.
    2. Gebruik Image-Pro Plus software om het percentage positieve cellen in ten minste 5 gezichtsvelden te berekenen.

13. Westelijke deutdetectie

  1. Weefsellysisatievoorbereiding
    1. Breng vloeibaar stikstofbevroren huidweefsel in een voorgekoelde roestvrijstalen mortel bij -80 °C; Voeg geleidelijk vloeibare stikstof toe in drie stappen om verdamping te beperken; maal verticaal totdat alle deeltjes niet meer zichtbaar zijn; het resulterende poeder overbrengen in een EP-buis met een lysisbuffer.
    2. Integreer proteaseremmer (1:100) en fosfatase-remmer (1:50); Vortex op ijs gedurende 30 seconden; ultrasone verstoornis uitvoeren; incubeer bij 4 °C in een schudbare broedmachine gedurende 2 uur; centrifugeren op 4 °C, 14.000 × g gedurende 20 minuten; Aspireer voorzichtig het supernatant.
  2. Eiwitkwantificatie en -verwerking
    1. Doseer 5 μL van het supernatant in een 96-well-plaat; voeg 200 μL BCA-werkoplossing toe; 30 minuten in het donker broeden bij 37 °C; meet de absorptie bij 562 nm met behulp van een microplaatlezer; Bepaal de concentratie volgens de standaardcurve.
    2. Combineer 5× Reduced Protein Loading Buffer met de eiwitoplossing in een verhouding van 4:1; denatureer door het 15 minuten in een kokend water te plaatsen; Bewaar op -20 °C voor toekomstig gebruik.
  3. SDS-PAGE elektroforese
    1. Maak een 12% acrylamide resolutiegel; Giet de gel tot het 1 cm onder de kamtanden ligt; bedek met isopropanol om blootstelling aan lucht te voorkomen; na het stollen, isopropanol verwijderen; giet een concentratiegel van 4%; voeg een kam met 15 putten in; laat stolling toe bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten; voeg 5 μL van de voorgekleurde eiwitmarker toe aan laadput 1; voeg 20 μL blanco lysaat toe aan put 2; Voeg 10 μL monster met 40 μg eiwit toe aan elke put van 3 tot 14.
    2. Elektroforese starten bij 80 V; overschakelen naar 120 V wanneer het bromofenolblauw migreert in de scheidende gel; een temperatuur van 10-15 °C met ijswatercirculatie handhaven; Loop totdat het bromofenolblauw 0,5 cm van de onderkant van de gel bereikt.
  4. Wet blotting-procedure
    1. Bereid een transferbuffer voor met 20% methanol; Voorkoel tot 4 °C. Activeer het PVDF-membraan door het 1 minuut in methanol onder te dompelen; Equilibratie het NC-membraan in buffer. Zet de transferklem in deze volgorde samen: "Kathodeplaat - Sponspad - Filterpapier - Gel - Membraan - Filterpapier - Sponspad - Anodeplaat"; verwijder alle belletjes grondig met een roller; stel parameters in volgens het doeleiwitmolecuulgewicht: voor eiwitten < 50 kDa, gebruik een constante spanningsoverdracht van 100 V gedurende 60 minuten; voor eiwitten van 50-100 kDa, breng een constante stroomoverdracht toe bij 250 mA gedurende 90 minuten; voor eiwitten > 100 kDa, een constante stroomoverdracht van 300 mA gedurende 120 minuten uitvoeren; Aansluit op een 4 °C circulerend waterbad.
  5. Immunodetectieprocedure
    1. Na de overdracht dompel je het PVDF-membraan 1 minuut onder in methanol; Drie keer wassen met TBST voor elk 5 minuten; bedek het membraanoppervlak met 3% H₂O₂/TBST; 15 minuten broeden op kamertemperatuur in het donker; aspiraat de vloeistof; voeg een 5% BSA/TBST-blokkerende oplossing toe; blokken voor 1 uur in een 37 °C schudende broedmachine; Was het membraan drie keer met TBST gedurende 5 minuten.
    2. Voeg de primaire antistofwerkoplossing toe (zoals P53, Bax, Bcl-2, VEGF en bFGF); 's nachts broeden op 4 °C in een schudende broedmachine; was het membraan vier keer met TBST gedurende 10 minuten per stuk; HRP-gelabelde secundaire antistoffen toevoegen; 90 minuten broeden op een schudbare broedmachine bij kamertemperatuur; Was het membraan zes keer met TBST + 0,5% SDS gedurende elk 8 minuten.
  6. Chemiluminescentiebeeldvorming
    1. Meng gelijke volumes van ECL A- en B-oplossingen; het membraanoppervlak uniform bedekken; laat de reactie 60 seconden in het donker plaatsvinden; aspireer overtollige vloeistof; stel een enkele blootstellingstijd in tussen 1-5 seconden voor sterke signaaleiwitten; voer cumulatieve blootstelling uit in vijf segmenten (10/30/60/120/300 s) voor zwakke signaaleiwitten; Maak beelden met een chemiluminescentie-imager.
  7. Workflow voor data-analyse
    1. Kwantificeren eiwitten met behulp van ImageJ-software; een uniforme drempel voor achtergrondaftrekking vaststellen; bereken de grijswaardenverhouding van het doeleiwit tot het referentie-eiwit (β-actine of GAPDH)
    2. Importeer de gegevens in GraphPad Prism voor analyse.

14. Statistische analyse

  1. Presenteer gegevens met gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde. Gebruik onafhankelijke t-tests voor vergelijkingen tussen twee groepen en gebruik eenrichtings-ANOVA voor vergelijkingen over meerdere groepen.
  2. Analyseer gegevens met SPSS 26.0 en GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Beschouw P < 0,05 als indicatief voor statistisch significante verschillen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Therapeutisch effect van Acorus calamus L. op door straling veroorzaakte huidbeschadiging
15 dagen na bestraling vertoonden alle groepen ratten droge afbladdering, lokale roodheid, zwelling, zweren en korstvorming. 30 dagen na bestraling toonde de modelgroep de ernstigste huidschade, met korstvorming en ulceratie op de bestraalde plek die hun hoogtepunt bereikten. Na 45 dagen vertoonde de modelgroep minimale korstafscheiding en vertoonde de wond enige wee. Daarentegen vertoonden de Acorus calamus L.- ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Door straling veroorzaakte huidbeschadiging blijft een van de meest voorkomende en uitdagende complicaties bij klinische kankerbestraling. Als het grootste orgaan en het eerste doelwit van straling is de huid gevoelig voor schade door vrije radicalen en reactieve zuurstofsoorten die door straling worden geproduceerd, wat cellulaire functies kan aantasten, waaronder celdeling, migratie en differentiatie, wat uiteindelijk leidt tot vertraagde wondgenezing en weefselschade...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Joint Plan van het Liaoning Province Science and Technology Plan (Technical Tackling Project) (2024JH2/102600273) en het Independent Research Project van het Northern Theatre General Hospital (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaP0099
Acorus calamus L. extractPrepared in-houseN/A  Het gedetailleerde voorbereidingsprotocol is beschreven in Sectie 4 van Protocol.
Anti-Bax Antibody  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB11690
Anti-Bcl-2 AntibodyWuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB113375
Anti-bFGF AntibodyProteintech Group,Inc.(Wuhan, Hubei, China)11234-1-AP
Anti-P53 Antibody Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111740
Anti-VEGF Antibody Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111971
BCA Protein Assay Kit Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)G2026-200T
Betamethason Crème United Pharmaceutical Co.,Ltd. (China)N/A Concentratie: 0,1% w/w
Nationaal Drugsgoedkeuringsnummer: H19994057
EthanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Gebruikt als extractieoplosmiddel voor de Acorus calamus L. extract.
Gel and Blot Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)ChemiDoc MP
Hematoxyline-Eosine KleuringskitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.,(Beijing, China)  G1120
HRP geconjugeerd Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB23303
Omgekeerd Fluorescerend MicroscoopOlympus Corporation (Tokyo, Japan)IX83  
Masson’s Trichrome KleuringskitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.,(Beijing, China)  G1340
Microplate Reader (voor absorbantie, fluorescentie en luminescentie detectie)Molecular Devices (San Jose, CA, USA)SpectraMax iD3
Vaselinum albumSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.(Shanghai, China)N/A  Farmaceutische kwaliteit witte vaseline ; smeltpunt: 45-60 °C;  Nationaal Drugsgoedkeuringsnummer: H31022350
Rat IL-1β ELISA Kit  Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA Kit  Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI328
Rat TNF-α ELISA Kit  Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPT516
TUNEL Cel Apoptose Detectie Kit (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaC1091

Referenties

  1. Piffkó, A., et al. Radiation-induced amphiregulin drives tumour metastasis. Nature. 643 (8072), 810-819 (2025).
  2. Wang, K., Tepper, J. E. Radiation therapy-associated toxicity: Etiology, management, and prevention. CA Cancer J Clin. 71 (5), 437-454 (2021).
  3. Grosu-Bularda, A., et al. Navigating the complexities of radiation injuries: therapeutic principles and reconstructive strategies. J Pers Med. 14 (11), 1100(2024).
  4. Kemin, L., Rutie, Y. A critical review of the progress in prevention and treatment of radiation-induced skin damage. Front Oncol. 14, 1395778(2024).
  5. Borrelli, M. R., et al. Radiation-induced skin fibrosis: Pathogenesis, current treatment options, and emerging therapeutics. Ann Plast Surg. 83 (4S Suppl 1), S59-S64 (2019).
  6. Xu, Y., Liu, Q., Li, W., Hu, Z., Shi, C. Recent advances in the mechanisms, current treatment status, and application of multifunctional biomaterials for radiation-induced skin injury. Theranostics. 15 (7), 2700-2719 (2025).
  7. Deng, G. M., He, W. S., Liu, W. Y., Wu, F. S., Chen, J. B. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2024).
  8. Bian, X. W., et al. Epigenetic memory of radiotherapy in dermal fibroblasts impairs wound repair capacity in cancer survivors. Nat Commun. 15 (1), 9286(2024).
  9. Singh, V. K., Seed, T. M. The efficacy and safety of amifostine for the acute radiation syndrome. Expert Opin Drug Saf. 18 (11), 1077-1090 (2019).
  10. Wang, Z., Chen, R., Chen, J., Su, L. 18β-glycyrrhetinic acid alleviates radiation-induced skin injury by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Biol Chem. 405 (6), 407-415 (2024).
  11. Wang, Z. W., et al. Aloe polysaccharides mediated radioprotective effect through the inhibition of apoptosis. J Radiat Res. 45 (3), 447-454 (2004).
  12. Kongkham, B., Duraivadivel, P., Hariprasad, P. Acorus calamus L. rhizome extract and its bioactive fraction exhibits antibacterial effect by modulating membrane permeability and fatty acid composition. J Ethnopharmacol. 331, 118323(2024).
  13. Abdeahad, H., et al. Therapeutic potency of curcumin on radiodermatitis: A systematic review. Avicenna J Phytomed. 14 (3), 297-304 (2024).
  14. Kim, H., Han, T. H., Lee, S. G. Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells. J Ethnopharmacol. 122 (1), 149-156 (2009).
  15. Zhao, Y., et al. botanic, phytochemistry and pharmacology of the Acorus L. genus: A review. Molecules. 28 (20), 7117(2023).
  16. Kuan, C., et al. Rice bran extract alleviates inflammation and promotes wound healing in radiation dermatitis. Exp Dermatol. 34 (9), e70162(2025).
  17. Salgueiro, M. J., et al. Biological effects of brachytherapy using a (32)P-patch on the skin of Sencar mice. Appl Radiat Isot. 67 (32), 1769-1774 (2009).
  18. Jain, N., Jain, R., Jain, A., Jain, D. K., Chandel, H. S. Evaluation of wound-healing activity of Acorus calamus Linn. Nat Prod Res. 24 (6), 534-541 (2010).
  19. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2020 Edition. , China Medical Science Press. Beijing. (2020).
  20. Chen, Y., et al. Senescent fibroblast facilitates re-epithelization and collagen deposition in radiation-induced skin injury through IL-33-mediated macrophage polarization. J Transl Med. 22 (1), 176(2024).
  21. Milam, E. C., Rangel, L. K., Pomeranz, M. K. Dermatologic sequelae of breast cancer: From disease, surgery, and radiation. Int J Dermatol. 60 (4), 394-406 (2021).
  22. Haran, P., Shanmugam, R., Deenadayalan, P. Free radical scavenging, anti-inflammatory and antibacterial activity of Acorus calamus leaves extract against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Cureus. 16 (3), e55987(2024).
  23. Sytykiewicz, H., Łukasik, I., Goławska, S. Chemical composition, anti-tyrosinase and antioxidant potential of essential oils from Acorus calamus (L.) and Juniperus communis (L.). Molecules. 30 (11), 2417(2025).
  24. Liu, Y., et al. Proteomics and transcriptomics explore the effect of mixture of herbal extract on diabetic wound healing process. Phytomedicine. 116, 154892(2023).
  25. Zhou, L., Zhu, J., Liu, Y., Zhou, P. K., Gu, Y. Mechanisms of radiation-induced tissue damage and response. MedComm. 5 (10), e725(2020).
  26. Elgellaie, A., Thomas, S. J., Kaelle, J., Bartschi, J., Larkin, T. Pro-inflammatory cytokines IL-1α, IL-6 and TNF-α in major depressive disorder: Sex-specific associations with psychological symptoms. Eur J Neurosci. 57 (11), 1913-1928 (2023).
  27. García-García, M. L., et al. Fluoxetine modulates the pro-inflammatory process of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in individuals with depression: A systematic review and meta-analysis. Psychiatry Res. 307, 114317(2022).
  28. Yan, T., et al. Single-cell RNA-seq analysis of molecular changes during radiation-induced skin injury: The involvement of Nur77. Theranostics. 14 (15), 5809-5825 (2024).
  29. Tu, W., et al. Integrative multi-omic analysis of radiation-induced skin injury reveals the alteration of fatty acid metabolism in early response of ionizing radiation. J Dermatol Sci. 108 (3), 178-186 (2022).
  30. Mukherjee, S., Dutta, A., Chakraborty, A. The cross-talk between Bax, Bcl2, caspases, and DNA damage in bystander HepG2 cells is regulated by γ-radiation dose and time of conditioned media transfer. Apoptosis. 27 (3-4), 184-205 (2022).
  31. Avadanei-Luca, S., et al. Tissue regeneration of radiation-induced skin damages using protein/polysaccharide-based bioengineered scaffolds and adipose-derived stem cells: A review. Int J Mol Sci. 26 (13), 6469(2025).
  32. Hartono, S. P., et al. Vascular endothelial growth factor as an immediate-early activator of ultraviolet-induced skin injury. Mayo Clin Proc. 97 (1), 154-164 (2022).
  33. Guangmei, D., Weishan, H., Wenya, L., Fasheng, W., Jibing, C. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2022).
  34. Gupta, S., et al. Exploring anticancer properties of medicinal plants against breast cancer by downregulating human epidermal growth factor receptor 2. J Agric Food Chem. 72 (17), 9717-9734 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Acorus Calamus-extractwondgenezingTraditionele Chinese Geneeskundeinflammatoire cytokinenapoptose-inhibitiebevordering van angiogenesehistopathologische analyseimmunohistochemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.