Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

Summary

Betrouwbare en nauwkeurige vormen van veldinzetbare DNA-analyse zijn cruciaal voor veel industrieën. Dit artikel biedt twee methoden voor milieumicrobiële analyse in het veld: 1) de isolatie van microbieel DNA uit omgevingsmonsters met behulp van een biologische extractie-veldkit, en 2) de analyse van DNA via de field qPCR-eenheid.

Abstract

Nu kwantitatieve PCR (qPCR) steeds breder wordt toegepast in de industrieën, wordt de capaciteit om DNA in afgelegen omgevingen zonder logistieke obstakels te extraheren en te analyseren steeds belangrijker. Een duidelijk voorbeeld is de noodzaak van eenvoudige hulpmiddelen om verontreinigingsafbrekende bacteriën te kwantificeren op afgelegen locaties die getroffen zijn door treinontsporingen of olielozingen, zodat een tijdige beoordeling van risico's en milieueffecten mogelijk is. Om dit betrouwbaar te bereiken, moeten de processen draagbaar en licht zijn, gebruiksvriendelijk voor niet-wetenschappers, resistent tegen besmetting en in staat om snelle resultaten te leveren terwijl er toch strenge kwaliteitscontrole wordt gehandhaafd. Hoewel er al jaren opties bestaan voor zowel nucleïnezuurextractie als qPCR-analyse buiten het laboratorium, zijn technologische ontwikkelingen pas recentelijk de ontwikkeling van veldinzetbare systemen mogelijk gemaakt die betrouwbaar en nauwkeurig kunnen presteren. In deze studie demonstreren we het gebruik van een veld-DNA-extractiekit in combinatie met draagbare qPCR-instrumenten onder realistische omgevingsomstandigheden. Veldproeven uitgevoerd bij buitentemperaturen van ongeveer 30 °C toonden DNA-opbrengsten en amplificatie-efficiënties die vergelijkbaar zijn met die in gecontroleerde laboratoriumomgevingen. Belangrijk is dat de resultaten die in het veld zijn verkregen, gelijkwaardige gevoeligheid en reproduceerbaarheid aantoonden, wat bevestigt dat draagbare workflows hoogwaardige data kunnen leveren zonder conventionele laboratoriuminfrastructuur. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van gedecentraliseerde moleculaire analyses die het bereik van qPCR uitbreiden naar afgelegen en beperkte omgevingen, terwijl de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid behouden blijven die nodig zijn voor besluitvorming.

Introduction

Bij het overwegen van moleculairbiologische analyses, zoals qPCR, zijn er verschillende beperkingen voor het monsterbeheer. Een duidelijk voorbeeld is de vraag naar eenvoudige, betrouwbare tools om verontreinigingsafbrekende bacteriën te kwantificeren op afgelegen locaties die getroffen zijn door treinontsporingen of olielozingen, wat een tijdige evaluatie van milieurisico en impact 1,2,3,4,5 ondersteunt. De belangrijkste beperking is dat, hoe koud je het monster ook houdt, microbiële gemeenschappen in de loop van de tijd kunnen (en zullen) verschuiven ^6,7. Om te garanderen dat de gegevens de oorspronkelijke omgeving waaruit de monsters zijn verzameld nauwkeurig weergeven, wordt aanbevolen het DNA binnen 24 uur^{en 8} uur uit die monsters te halen. Voor een ingenieur die microbiële monsters verzamelt op een offshore olieplatform, of een wetenschapper diep in het binnenland van een regenwoud, is deze tijdlijn niet haalbaar. Een water- of bodemmonster van een van deze afgelegen locaties binnen dezelfde dag naar een scheepvaartbedrijf brengen en vervolgens overnachtend naar een laboratorium brengen (terwijl je koeling onderhoudt), waar het DNA vervolgens kan worden geëxtraheerd vóór analyse, is simpelweg onmogelijk.

Zodra het DNA is geëxtraheerd, stopt de klok en wordt de volledige genetische informatie van het monster onbeperkt bewaard met de juiste opslagtechnieken⁹. Dit maakt het geëxtraheerde DNA ongelooflijk uniek in vergelijking met de overgrote meerderheid van chemische, metallurgische en biologische monsters – waarvan de meeste een beperkte houdbaarheid hebben. Gearchiveerd DNA kan jaren of decennia later worden teruggevonden en geanalyseerd op nieuwe doelen op nieuwe platforms. Om deze reden is het cruciaal dat het geëxtraheerde DNA echt de oorspronkelijke microbiële gemeenschap vertegenwoordigt, en niet de veranderde door vertraagde transport.

Bovendien beperkt de eis van een laboratorium om de monsters te extraheren en te analyseren zowel de flexibiliteit als de consistentie in bemonsteringsprogramma's sterk. De logistieke kosten alleen al kunnen voor^{bepaalde projecten} prohibitief zijn. Het vermogen om monsters te analyseren en genetische doelen van belang nauwkeurig te kwantificeren binnen enkele uren of zelfs minuten na het bemonsteren, opent vele deuren voor milieuprojecten wereldwijd.

Protocol

OPMERKING: Het volgende protocol werd uitgevoerd met behulp van een Bio-Extract Kit (biologische extractie-veldkit) en de FieldQuant qPCR (veldgebaseerde qPCR).

1. Biomassabemonstering uit grondwater en een DNA-isolatieprotocol met behulp van een ingekapseld filter en een biologische extractie-veldkit

1. Draag handschoenen en een veiligheidsbril voor alle stappen in stap 1.
2. Bereid de peristaltische pomp en slang voor en spoel de put met standaard volumezuivering, volgens de richtlijnen van de Environmental Protection Agency (EPA) Grondwaterbemonstering¹¹.
3. Verwijder het ingekapselde filter, de adapter, de klem en de doppen van de meegeleverde centrifugebuis (Figuur 1).
4. Haal de buis (1/4-5/16 in binnendiameter [I.D.]) door de meegeleverde klem en draai de klem strak om de slang aan de vergrendelingslueradapter te bevestigen (Figuur 2).
5. Sluit de filterinlaat aan op de Luer-Lock adapter die in de vorige stap is geïnstalleerd.
6. Plaats het filter in een ontvangstcontainer zodat de hoeveelheid gefilterd water nauwkeurig kan worden gemeten.
7. Filter tot 1 L water met lage debiet (<0,5 L/min). De hoeveelheid gefilterd water varieert afhankelijk van de troebelheid van het water.
   1. Als het filter verstopt voordat 1 L is gefilterd, stop dan en ga door naar de volgende stap.
      OPMERKING: DNA-analyse is gevoelig en kan worden uitgevoerd met slechts 10 mL, afhankelijk van de biomassa van het systeem.
8. Noteer handmatig het volume dat door het filter is gegaan in milliliter (mL). Gooi het gefilterde water weg.
9. Sluit het filter aan beide uiteinden. Zorg ervoor dat het dunnere uiteinde wordt gesloten met de rode dop en het dikkere uiteinde met de witte Luer-Lock plug.
10. Plaats het filter terug in de plastic buis die erbij staat.
11. Bevestig het etiket op de centrifugebuis en noteer de hoeveelheid water die door het filter is gegaan, de locatie, bemonsteringsdatum en de gevraagde analyses. Bewaar op 1-4 °C tot het geëxtraheerd is.
    OPMERKING: Filters moeten binnen 24 uur na het bemonsteren worden geëxtraheerd.
12. Met de meegeleverde alcoholdoekjes maak je een vlak oppervlak schoon waarmee je de extractie kunt uitvoeren (bijvoorbeeld een houten plank, een laadklep van de vrachtwagen, enz.).
13. Om het DNA te extraheren, leg je alle componenten van de biologische extractieveldkit op het vlakke, schone oppervlak (Figuur 3).
    1. Maak beide uiteinden van het filter los en leg de doppen apart voor later gebruik. Zoek en open een van de 3 mL spuiten die bij de kit zitten. Trek lucht in de 3 mL spuit en verbind deze met het filter via de vergrendelingsluerverbinding.
    2. Duw de lucht uit de spuit om eventueel overgebleven water uit het filter te krijgen. Koppel de spuit los en haal meer lucht in voordat je het herhaalt.
    3. Herhaal dit meerdere keren, zodat er zoveel mogelijk water uit het filter wordt geperst. Zet de rode stopcontactdop weer af.
14. Draai de gesloten Solution A-spuit meerdere keren om om te zorgen dat deze goed gemengd is. Verwijder de luer-locking spuitdop.
15. Verbind de spuit van Oplossing A met de ingekapselde 0,2 μm filterinlaat via de smeervergrendelingstip en voeg langzaam de volledige inlaat van Oplossing A toe door de zuiger in te drukken. Te hard duwen kan tegendruk veroorzaken, dus zorg ervoor dat je de zuiger langzaam laat zakken. Als verstopte filters het toevoegen van Oplossing A verhindert, verwijder dan de rode uitlaatdop van het filter en probeer het opnieuw. Zet de condens van het filter opnieuw.
16. Schud het gesloten filter 5 minuten krachtig met de hand.
    OPMERKING: Om vermoeidheid te voorkomen kunnen meerdere monsters worden voorbereid tot deze stap, en allemaal kunnen ze tegelijk met de hand worden geschud. Indien beschikbaar, kan een oplaadbare vortexmixer worden gebruikt om deze stap uit te voeren in plaats van handschudden.
17. Draai de gesloten Solution B-spuit meerdere keren om om te zorgen dat deze goed gemengd is. Verwijder de luer-lockingkap van de spuit.
18. Verwijder de inlaatkap van het ingekapselde filter. Verbind de spuit van Solution B met de ingesloten filterinlaat via de luer-locking tip en voeg langzaam alle Solution B toe door de zuiger in te drukken. Te hard duwen kan tegendruk veroorzaken, dus zorg ervoor dat je de zuiger langzaam laat zakken. Vervang de filterinlaatkap.
19. Schud het gesloten filter 5 minuten krachtig met de hand.
    OPMERKING: Om vermoeidheid te voorkomen kunnen meerdere monsters worden voorbereid tot deze stap en allemaal tegelijk met de hand worden geschud. Indien beschikbaar, kan een oplaadbare vortexmixer worden gebruikt om deze stap uit te voeren in plaats van handschudden.
20. Verwijder de inlaatkap.
21. Met het filter omgekeerd, duw 1 ml lucht in het filter met een 3 mL spuit die aan de ingekapselde filterunit is bevestigd en trek dan aan de zuiger om zoveel mogelijk van het lysaat (vloeistof) te verwijderen.
    OPMERKING: Als het lysaat bijzonder viskeus is, kan het nodig zijn om de zuiger meerdere keren te duwen en te trekken om de oplossing uit het filter te verwijderen.
22. Voeg het lysaat toe aan een 5 mL kraalbuis. Doe de tube af en sluit hem bovenop met parafilm.
23. Schud de tube krachtig met de hand gedurende 5 minuten. Zet de buis rechtop terwijl je doorgaat met de trappen.
    OPMERKING: Om vermoeidheid te voorkomen kunnen meerdere monsters worden voorbereid tot deze stap, en allemaal kunnen ze tegelijk met de hand worden geschud. Indien beschikbaar, kan een oplaadbare vortexmixer worden gebruikt om deze stap uit te voeren in plaats van handschudden.
24. Om besmetting van de foliebovenkant te voorkomen, plaats je de monstervoorbereidingscartridge op een vlak oppervlak.
25. Haal de 1 mL spuit uit de verpakking en schroef de luer-vergrendelbare kolom aan het uiteinde van de spuit. Gebruik de puntige punt van de kolom om twee gaten in het eerste gedeelte van de monstervoorbereidingscartridge te prikken.
    VOORZICHTIG: Sommige delen van de cartridge bevatten chaotrope zouten en/of ethanol. Draag handschoenen en een veiligheidsbril.
26. Met een plastic volumetrische pipet, breng je 1 ml lysaat (alleen vloeibaar, vermijd het overbrengen van kralen zoveel mogelijk) van de kraalbuis over in het nieuw geponste gat van het eerste monsterprep-patroongedeelte. Voor het beste resultaat voeg je het lysaat langzaam toe onder een lichte hoek wanneer je het in het gat in de folie pipetteert.
27. Steek de spuitkolom terug in het rode gedeelte van de cartridge. Trek de vloeistof helemaal in de spuit en duw hem dan uit. Voer deze pompactie 10 keer uit.
28. Duw al het vocht uit de spuit en terug in het rode gedeelte van de cartridge voordat je naar de volgende stap gaat. Er mag geen vloeistof van het ene gedeelte naar het andere worden overgebracht - dit geldt voor elke resterende stap van het DNA-isolatieprotocol voor het monster.
29. Plaats de puntige punt van de spuitkolom boven het rood-oranje gedeelte en prik twee gaten door de foliebarrière. Gebruik de zuiger om het volledige spuitvolume te trekken, de vloeistof helemaal omhoog te trekken en pomp weer helemaal terug. Herhaal deze stap één keer voor in totaal 2 pompen, waarbij alle vloeistof eruit wordt geduwd. Zet geen vloeistof over naar de volgende stap.
30. Plaats de puntige punt van de spuitkolom boven het oranje gedeelte en prik twee gaten door de foliebarrière. Gebruik de zuiger om het volledige vloeistofvolume van de spuit in te trekken en pomp helemaal weer uit. Zet geen vloeistof over naar de volgende stap.
31. Plaats de puntige punt van de spuitkolom over het gele gedeelte en prik twee keer door de foliebarrière. Gebruik de zuiger om het volledige vloeistofvolume van de spuit in te trekken en pomp helemaal weer uit. Zet geen vloeistof over naar de volgende stap.
32. Plaats de puntige punt van de spuitkolom boven het blauwe luchtdrooggedeelte en prik slechts één keer door de foliebarrière. Gebruik de zuiger om het volledige volume lucht in de spuit te trekken en pomp snel weer uit. Herhaal deze pompactie snel minimaal 20 keer totdat de kolom droog lijkt.
33. Plaats de puntige punt van de spuitkolom boven het laatste groene gedeelte en prik twee keer door de folie-barrière. Gebruik de zuiger om het volledige vloeistofvolume van de spuit in te trekken en pomp helemaal weer uit. Herhaal deze stap voor in totaal 5 pompen.
34. Met behulp van de 1 mL spuit en de monstervoorbereidingskolom brengt u alle oplossing uit het groene gedeelte over in een goed gelabelde 1 mL microbuis - dit is het veldgeëxtraheerde DNA-monster. Bewaar het tot een week op 1-10 °C (bijvoorbeeld in een koelbox met ijs/ijspakjes, of in een koelkast, enz.) of tot het gebruik.
    OPMERKING: Voor langdurige opslag kunnen DNA-monsters onbeperkt worden opgeslagen bij -20 °C.

2. Veldgebaseerd qPCR-analyseprotocol met een field qPCR-eenheid

OPMERKING: Het veldgebaseerde qPCR-instrument en de telefoon die het instrument bedient, zijn afhankelijk van oplaadbare batterijen. Zorg ervoor dat beide volledig zijn opgeladen voordat je naar het veld gaat.

1. Plaats tot drie uit het veld geëxtraheerde DNA-monsters in de zuivere monstervakken van de tray. Zorg ervoor dat er per sectie één sample is: één sample in slots 1, 2 of 3, één sample in slots 4, 5 of 6, en één sample in slots 7, 8 of 9.
2. Plaats de assaystrips voor elk monster in de bijbehorende A-, B- of C-stripsleuven op de tray. Lijn de eerste put op de strip uit met de eerste gleuf op de tray.
3. Ontgrendel de telefoon en open de applicatie die is vernoemd naar het handelsmerk qPCR-instrument. De telefoon en de field qPCR-eenheid zijn verbonden via geïntegreerde korteafstandsdraadloosheid. Wanneer de app opent, tik je op de Start Run-knop .
   OPMERKING: De applicatie is vooraf geladen op de meegeleverde telefoon en kan nergens anders worden gedownload.
4. Op het volgende scherm tik je op de knop 'ID's genereren .
5. Dit volgende scherm is waar de steekproefinformatie voor elk monster wordt ingevoerd; tik onder Sample ID en typ de naam van het voorbeeld in.
   1. Tap monstereenheden en selecteer de juiste volume-eenheid voor het monstertype dat bij de extractie is gebruikt (gram [g], milliliter [mL] of swab).
   2. Vervolgens tik je de hoeveelheid monster af en typ het volume in dat hierboven is gebruikt bij de veldextractie (bijvoorbeeld milliliter gefilterd water). Herhaal dit proces voor de resterende twee monsters.
   3. Wanneer de sample-informatie voor alle samples compleet is, tik je op de continue-knop .
      OPMERKING: Als je minder dan 3 monsters gebruikt, laat dan de sample ID als standaard, kies een eenheid en typ een 1 in de sample amount-regel zodat ongebruikte samples doorgaan.
6. Op het volgende scherm tik je op de map. Ga naar het volgende scherm en tik op opslaan naar de huidige map.
7. Typ op het volgende scherm een runnaam in en tik op bevestigen.
8. Zet het instrument aan door de aan/uit-knop linksboven in te drukken en ingedrukt te houden totdat alle lampjes aan de voorkant van het instrument branden (~5 s). Tik vervolgens op bevestigen in de app om verder te gaan.
9. Op het volgende scherm tik je op verbinden via geïntegreerde kortafstandsdraadloze verbinding. Druk op de geïntegreerde korteafstandsknop voor draadloze verbinding (een bekend als handelsmerk) bovenop het instrument totdat het blauwe lampje begint te knipperen. Tik op bevestigen en wacht tot de app en het instrument samen synchrooneren. Zodra ze gesynchroniseerd zijn, tik je in de app op de instrumentnaam om het te selecteren en tik je vervolgens op de verbindingsknop om de assaystrips te laden.
   OPMERKING: Als het instrument en de app de eerste keer niet synchroniseren, zorg dan dat het geïntegreerde draadloze korteafstandslampje op het instrument nog knippert en tap opnieuw de scan.
10. Controleer voordat je de doppen van de assaystrips verwijdert of de gelyofilieerde pellets niet bovenop een van de assaystripputten zitten. Als dat zo is, tik dan voorzichtig de bodem van de put zodat de pellet lager in de put valt.
11. Verwijder de doppen van de go-stripbuizen voor het eerste monster. Voeg 18 μL steriel water toe aan de eerste put van de assaystrip en pipetteer voorzichtig op en neer om de pellet op te lossen. Herhaal dit voor de resterende 2 putten.
12. Voeg 2 μL van het monster toe aan elke put en sluit de buizen af door een set rubberen assaystripkappen in de buizen te plaatsen, met de inkepingen tussen de doppen naar de achterkant van de tray. Herhaal indien nodig stappen 2.10-2.12 voor de resterende samples. Zodra alle assaystrips zijn gevuld en verzegeld met stripdoppen, tik je bevestigen in de app.
13. Verwijder elke assaystrip één voor één en controleer op bellen op de bodem van de putten. Als er belletjes op de bodem van een van de putten zijn, wieg de strook dan voorzichtig heen en weer totdat de belletjes omhoog bewegen naar de bovenkant van de put. Zodra alle putten zijn gecontroleerd, tik je bevestigen in de app en laad je de stroken in het instrument.
14. Open het deksel van het instrument en plaats de assaystrips in dezelfde volgorde en oriëntatie in het field qPCR-instrument als op de tray, zodat de scharnieren van de put en de inkepingen tussen de doppen naar de achterkant van het instrument wijzen. Nadat alle strips zijn toegevoegd, duw je het deksel voorzichtig naar beneden totdat het vastzit en tik je bevestigen.
15. Tik op de start-run-knop in de app.
    OPMERKING: De run begint en duurt ~45 minuten onder vooraf ingestelde runvoorwaarden. Deze voorwaarden zijn niet bewerkbaar.
16. Als de run is afgerond, tik je op e-mailresultaten. Zodra de telefoon op wifi is, worden de resultaten verzonden voor analyse en rapportage; tot die tijd worden de resultaten op het instrument opgeslagen.
    1. Zodra hij met de wifi is verbonden, moet de gebruiker opnieuw op de verzendknop drukken om de resultaten te verzenden.
17. Maak de tray schoon tussen de runs om besmetting tussen de monsters te voorkomen.
    OPMERKING: De output is een Excel-bestand met cyclusdrempelwaarden (Ct) voor elke put. Deze resultaten worden naar het laboratorium gestuurd, dat de amplificatiekwaliteit controleert en de Ct-waarden omzet naar abundanties met behulp van gevalideerde standaardcurves die specifiek zijn voor elk qPCR-doel en gebaseerd op het volume en de matrix van het oorspronkelijke monster. Deze resultaten worden aan de gebruiker verzonden als een elektronische deliverable en als PDF.

Results

DNA-extractie uit representatieve omgevingsmonsters werd uitgevoerd met zowel de biologische extractie-veldkit als een hoogst gevalideerde laboratoriumgebaseerde methode zoals eerder beschreven⁴. Zoals getoond in Figuur 4, werd succesvolle voltooiing van DNA-isolatie met de veldkit bevestigd bij vergelijking van qPCR-resultaten met een sterk gevalideerde laboratoriumgebaseerde extractiemethode. Deze consistentie bevestigt dat de methode de DNA-integriteit van omgevingsmonsters in het veld heeft behouden.

De componenten van de field qPCR-kit zijn weergegeven in Figuur 5. Analyse van een standaard kweekverdunning van Dehalococcoides (DHC) met behulp van de veld-qPCR-eenheid werd uitgevoerd bij zowel binnen- (21 °C) als buitentemperatuur (30 °C) om de robuustheid van het instrument onder echte veldomstandigheden te illustreren. De resultaten, te zien in Figuur 6, benadrukken de lage afwijking voor 10 verschillende herhalingen van elk. Voor volledige context: DHC is een organisme dat in staat is gechloreerde oplosmiddelen af te breken en wordt het vaak gekwantificeerd via qPCR binnen de milieusaneringsindustrie^.

Om de precisie van de instrumenten te valideren, werd DHC geanalyseerd bij drie verschillende concentraties met tien field qPCR-instrumenten die in duplicaten werden uitgevoerd (Figuur 7). Zelfs bij lage hoeveelheden bleef de relatieve standaarddeviatie laag (onder de 5%) over alle runs. Let op dat, vergeleken met standaarddeviatie, relatieve standaarddeviatie belangrijk is voor logaritmische gegevens, omdat deze de resultaten normaliseert via de volgende vergelijking:

Waar RSD Relatieve Standaarddeviatie is, σ de standaarddeviatie van de dataset is, en μ het gemiddelde van de dataset.

Samen leveren beide methoden in dit artikel reproduceerbare resultaten op basis van replicate veldextracties en qPCR-assays. De overeenstemming tussen veld- en laboratoriumextracties en qPCR-analyse toont aan dat betrouwbare, hoogwaardige data kan worden verkregen zonder afhankelijk te zijn van laboratoriuminfrastructuur, waardoor microbiële analyses kunnen worden uitgevoerd in afgelegen of beperkte omgevingen.

Figuur 1: Componenten van de ingekapselde filterkit. Het ingekapselde filter wordt gebruikt om biomassa uit het watermonster te filteren. Door via een slang aan te sluiten op een peristaltische pomp, wordt water door het filter geblazen. Na het noteren van het totale watervolume wordt het water weggegooid en is de biomassa die op het filter is verzameld klaar voor DNA-extractie. Componenten: a. steriele buis die het filter en componenten voor en na gebruik vasthoudt, b. inlaatdop, c. slangklem, d. smeervergrendelingsadapter voor de buisverbinding, e. ingekapseld filter, f. rubberen uitlaatkap. Afbeelding gebruikt met toestemming van Microbial Insights, ^Inc.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Filter- en buisverbinding. De buis wordt over de smeervergrendelingsslangaansluiting geduwd en op zijn plaats gehouden met de slangklem. Het andere uiteinde van de buis is aangesloten op een peristaltische pomp (deze aansluiting en de bediening van de pomp vallen buiten het bestek van dit protocol). Afbeelding gebruikt met toestemming van Microbial Insights, ^Inc.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: DNA-isolatie veldkit componenten. Alle onderdelen zijn steriel voor gebruik. De componenten omvatten: (1) ingekapselde filterkit (zie Figuur 1 voor meer details), (2) 3 mL spuit, (3) 1 mL spuit voorgeladen met Oplossing A, afgekapt, (4) 1 mL spuit voorgeladen met Oplossing B, voorzien van een dop, (5) 3 mL spuit, (6) siliconen kraalbuis, (7) 1 mL spuit voorzien van isolatiekolom, (8) 1 mL wegwerp transferpipet, (9) DNA-isolatiemonster voorbereidingscartridge, (10) 1,5 mL microcentrifugebuis. Niet afgebeeld: parafilm-vierkanten voor het afdichten tijdens het schudden, en alcoholdoekjes die worden gebruikt om het oppervlak voor extractie schoon te maken. Afbeelding gebruikt met toestemming van Microbial Insights, ^Inc.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van veldextractie met behulp van echte monsters. Vergelijkende qPCR-resultaten van DNA geïsoleerd uit twee representatieve monsters met behulp van een laboratoriummethode (rode balken) versus de biologische extractie-veldkit (blauwe strepen). Deze werden niet in replicatie geanalyseerd, zoals verwacht zou worden bij een standaard qPCR-analyse. Gendoelen (x-as) tonen abundantie (y-as) binnen een orde van grootte voor beide methoden. Informatie over elk specifiek gendoel is niet opgenomen omdat het buiten de reikwijdte van dit artikel valt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Veldgebaseerd qPCR-instrument en componenten. De componenten omvatten: A. Het veldgebaseerde qPCR-instrument, B. monstervoorbereidingsbak, C. assaystrip met gelyofilieerde reagentia, D. telefoon vooraf geladen met applicatie die het instrument uitvoert. Afbeelding gebruikt met toestemming van Microbial Insights, ^Inc.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Demonstratie van veld-qPCR-robuustheid. De Dehalococcoides (DHC)-standaard geanalyseerd in tien replicaten onder buitentemperatuur (30 °C, rode balken) en binnen (21 °C, blauwe balken) temperatuurcondities, wat de betrouwbaarheid van het instrument voor het veld benadrukt. Het replicateer-runnummer wordt vermeld langs de x-as en de berekende DHC-abundantie wordt vermeld langs de y-as. Het Inside (20 °C) gemiddelde werd berekend op 4,92 × 10² cel/mL, SD = 1,14 × 10² cellen/mL (n = 10), en het Outside (30 °C) gemiddelde werd berekend op 5,89 × 10² cellen/mL, SD = 1,80 × 10² cel/mL (n = 10). Metingen bij 20 °C en 30 °C verschilden niet significant (Welch's t-test, p = 0,17). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Demonstratie van veld-qPCR-precisie. Precisieprestaties tussen 10 verschillende instrumenten, uitgevoerd in duplicaat bij drie verschillende standaardconcentraties. De werkelijke waarde en het replicatatiegetal (n = 2 voor 10 instrumenten bij elke standaardconcentratie) worden langs de x-as weergegeven, met gekleurde balken die specifiek zijn voor de veldeenheid. De y-as toont de berekende abundantie voor elke run. Het percentage relatieve standaarddeviatie voor elke standaardconcentratie wordt weergegeven in de stippellijnen boven de balken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Een cruciaal kenmerk van dit protocol is dat het microbieel DNA-extractie en qPCR-analyse onder veldomstandigheden mogelijk maakt, zonder de noodzaak van laboratoriuminfrastructuur^{of elektriciteit.} De methode is geoptimaliseerd om draagbaarheid en betrouwbaarheid in balans te brengen, waardoor reproduceerbare resultaten worden geleverd die consistent zijn met laboratoriumwerkstromen, zelfs wanneer deze buiten worden uitgevoerd onder een bereik van^{omgevingstemperaturen van 12}. Het voorgestelde gebruiksbereik is 4 °C tot 95 °C, en een vergelijking naast elkaar bij standaard buitentemperaturen (30 °C, 86 °F) voor een veldploeg toont betrouwbare consistentie (Figuur 6). Deze consistentie is essentieel om ervoor te zorgen dat veldresultaten interpreteerbaar zijn naast laboratoriumdatasets.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van het protocol. Tijdens het extractieproces is volledige verwijdering van vloeistof uit filters en grondig mengen van reagentia belangrijk om efficiënte lysis en DNA-herstel te waarborgen. Evenzo is het zorgvuldig overbrengen van lysaat in de monstervoorbereidingscartridge, terwijl de overdracht van de kraal wordt geminimaliseerd, essentieel om verstopping of kolomfalen te voorkomen. Probleemoplossingsstrategieën omvatten het vertragen van de indruk van de zuiger om de tegendruk te verminderen en het herhaald pompen van de spuit als viskeuze lysaten de vloeistofbeweging belemmeren. Voor qPCR zijn het vermijden van bellen in assayputten en het waarborgen van volledige pellet-resuspension cruciaal voor een nauwkeurige amplificatie.

Ondanks de voordelen kent de methode beperkingen. DNA-opbrengsten kunnen lager zijn dan die bereikt met bench-centrifugatiekits, en sterk troebele of organisch rijke monsters kunnen de kolomprestaties uitdagen. Hoewel de isolatiekits eenvoudig en gemakkelijk te gebruiken zijn voor iedereen – inclusief gebruikers zonder eerdere laboratoriumervaring – is er een extra risico op fouten bij het vergelijken van een onervaren persoon in het veld. Bovendien levert de field qPCR-eenheid snelle resultaten, maar is beperkt tot een beperkt aantal gelijktijdige reacties (momenteel beperkt tot 9 gendoelen per run) in vergelijking met standaard thermocyclers. Deze beperkingen worden echter gecompenseerd door de snelheid van analyse en het vermogen om microbiële gemeenschapsprofielen in het veld vast te leggen. Er is geen inherente beperking aan welke qPCR-doelen geanalyseerd mogen worden, behalve de catalogus van het laboratorium dat de eenheid aanbiedt.

Het belang van deze methode ligt in het vermogen om moleculaire analyses te mobiliseren, waardoor realtime monitoring van microbiële populaties in omgevingen zoals olievelden, landbouwlocaties of afgelegen ecosystemen mogelijk is. Door DNA-integriteit te behouden op het moment van bemonstering en resultaten ter plaatse te genereren, vermindert deze aanpak logistieke barrières, verbetert de datakwaliteit en maakt snelle besluitvorming mogelijk. Toekomstige toepassingen kunnen pathogene surveillance in de volksgezondheid omvatten, monitoring van de voortgang van bioremediatie of microbiële risicobeoordeling in watersystemen. Met kleine aanpassingen kan het platform continu worden aangepast voor extra moleculaire doelen en opkomende qPCR-assays.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5/16" silicon buiswerk	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Coolers	Staples (www.staples.com)	24299978	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
DNA-isolatieveldset	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Merkgebonden
Veld-qPCR-eenheid met accessoires	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Merkgebonden
Handschoenen	Amazon (www.amazon.com)	Afhankelijk van maat	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Grondwaterfilters	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
IJs	Lokaal gemakswinkel	NA
Kamoer DIP1500 peristaltiekpomp 24 V 1500 mL/min hoog	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Naaldbeugeltang	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Papierhanddoeken	Staples (www.staples.com)	2126874	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Veiligheidsbril	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn
Sharpie fijne puntenmarker	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Alternatieve modellen kunnen acceptabel zijn