Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en zuivering van extracellulaire plantblaasjes uit Arabidopsis-bladeren met behulp van een geoptimaliseerde apoplastische wasverzamelmethode

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24 maart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om extracellulaire vesikels (EV's) uit Arabidopsis thaliana-bladeren te isoleren ter ondersteuning van downstream moleculaire en functionele analyses.

Samenvatting

Extracellulaire vesikels (EV's) zijn membraangebonden nanodeeltjes die door diverse organismen en celtypen worden afgescheiden en worden steeds meer erkend als belangrijke mediatoren van intercellulaire en interrijkscommunicatie. Hoewel EV-biologie goed is gevestigd in zoogdiersystemen, is het onderzoek naar plant-EV's relatief recent en groeit snel, mede gedreven door bewijs dat plant-EV's kleine RNA's, mRNA's, eiwitten en andere ladingen kunnen leveren die betrokken zijn bij immuniteit en plant-microbe interacties. Het isoleren van hoogzuivere plant-EV's blijft echter technisch uitdagend vanwege stijve celwanden, overvloedige secundaire metabolieten en het risico op cytosolische besmetting tijdens apoplastische vloeistofverzameling. Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde workflow voor de isolatie en zuivering van plant-EV's uit Arabidopsis thaliana-bladweefsel . Een zachte infiltratiestap op basis van een spuit wordt gebruikt om celschade en cytosolische lekkage te minimaliseren, terwijl het gebruik van individuele bladbladen (zonder bladstelen/vaatweefsel) helpt om besmetting door vasculaire en intracellulaire inhoud te verminderen. EV's worden aanvankelijk verrijkt door differentiële centrifugatie en kunnen verder worden gezuiverd met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntfractie of grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Dit protocol levert EV's op met behouden structurele integriteit en verminderde cellulaire besmetting door celschade en cytoplasmatische lekkage tijdens apoplastische vloeistofverzameling te minimaliseren, zoals beoordeeld met nanodeeltjesvolganalyse en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze EV-monsters zijn geschikt voor downstream toepassingen, waaronder RNA-profilering, proteomica en functionele assays voor plant-microbe interactiestudies. Al met al biedt deze methode een reproduceerbare en aanpasbare aanpak om hoogwaardige EV's van de plant te verkrijgen.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraandeeltjes die door lipiden gebonden zijn en door een breed scala aan organismen worden afgescheiden, van bacteriën tot mensen 1,2. In dierlijke systemen worden EV's vaak ingedeeld in exosomen, microvesikels en apoptotische lichamen op basis van hun biogeneseroutes en grootte3. Exosomen (~30-150 nm in diameter) ontstaan door de fusie van multivesiculaire lichamen (MVB's) met het plasmamembraan, wat leidt tot de afgifte van intraluminale blaasjes4, terwijl microvesikels (~100-1000 nm in diameter) direct uit het plasmamembraanknoppen. Naast exosomen en microvesikels produceren zoogdiercellen ook apoptotische lichamen, die vrijkomen tijdens geprogrammeerde celdood6. Deze blaasjes zijn betrokken bij immuunmodulatie, tumorprogressie en therapeutische toediening, waardoor ze onderwerp zijn van intensief biomedisch onderzoek 7,8. Bij planten is EV-classificatie minder goed gedefinieerd dan bij dieren. Studies in Arabidopsis thaliana hebben meerdere plant-EV-subtypes geïdentificeerd op basis van verschillen in eiwitmarkers, grootte en veronderstelde biogenese-routes. Deze omvatten tetraspanine (TET)-positieve EV's, die worden beschouwd als exosoomachtige blaasjes afkomstig van meervoudige lichamen 9,10, syntaxine-eiwit Penetratie 1(PEN1)-positieve EV's11, exocyst-positieve organelen (EXPO)-afgeleide EV's12,13, evenals andere EV-populaties zoals autofagie-gerelateerde EV's14 en pollensomen15.

Steeds meer bewijs suggereert dat planten EV's afscheiden als onderdeel van hun verdedigingsstrategie tegen ziekteverwekkers. Plant EV's leveren diverse moleculaire ladingen, waaronder kleine RNA's, mRNA's en andere regulerende moleculen, die de virulentie van schimmel- en oomycetenpathogenen onderdrukken 10,16,17,18,19. Deze bevindingen benadrukken EV's als voertuigen van "RNA-oorlogvoering", waardoor planten direct de genexpressie van ziekteverwekkers kunnen onderdrukken, een mechanisme met diepgaande gevolgen voor gewasbescherming20. Naast immuniteit kunnen plant-EV's ook bijdragen aan celwandremodel, stressreacties en ontwikkelingssignalering21. In tegenstelling tot dier-EV-onderzoek, waar gestandaardiseerde isolatie- en karakteriseringsprotocollenbreed zijn vastgesteld, bevindt het EV-veld in de plant zich nog in de beginfase. Dit beperkt reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies, waardoor er dringend behoefte is aan robuuste, gestandaardiseerde methodologieën om deze blaasjes te isoleren en te bestuderen.

Het isoleren van elektrische voertuigen van de installatie brengt unieke technische uitdagingen met zich mee die niet voorkomen in dierlijke systemen. Beschadigde plantweefsels bevatten overvloedige secundaire metabolieten, celwandresten en organellaire fragmenten die samen met EV's kunnen zuiveren, wat de karakterisering van de latere lijnbemoeilijkt. Bovendien levert het apoplastische wasmiddel (AWF), dat vaak wordt gebruikt als uitgangsmateriaal voor isolatie en zuivering van elektrische planten in de aanleg, vaak een heterogeen mengsel van blaasjes en verontreinigingen24. Hoewel differentiële centrifugatie een veelgebruikte fundamentele benadering blijft, kan het geen volledig onderscheidende EV-subpopulaties onderscheiden of EV's onderscheiden van geïsoleerde macromoleculaire complexen25,26. Recente reviews en methodologische studies hebben belangrijke richtlijnen en best practice-overwegingen gegeven voor de isolatie en karakterisering van EV's van planten 27,28,29,30,31. Desalniettemin blijft de praktische implementatie en integratie van deze benaderingen uitdagend, en zijn aanvullende zuiveringsstappen zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie vaak vereist om de zuiverheid en reproduceerbaarheid van EV's in alle studies te verbeteren.

Hier presenteren we een gestroomlijnd protocol voor het isoleren van EV's van Arabidopsis apoplastische wasvloeistof met behulp van een meerstaps zuiveringsstrategie. In tegenstelling tot veelgebruikte EV-isolatiemethoden voor fabrieken die vertrouwen op volledige installatie-infiltratie met vacuümpompen, voorkomt dit protocol de opname van bladstelen en vaatweefsels, wat de besmetting van vaatstructuren kan vergroten. In plaats daarvan worden geïsoleerde bladbladen en een zachte, spuitgebaseerde infiltratiemethode gebruikt om de apoplastverzameling te verbeteren en weefselverstoring te minimaliseren. Zorgvuldige omgang met bladeren, oriëntatie en centrifugatiecondities verminderen de besmetting door intracellulaire componenten verder en bieden een schoner uitgangsmateriaal voor EV-isolatie. Na differentiële centrifugatie kunnen EV's verder worden gezuiverd met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntfractie of grootte-uitsluitingschromatografie om een hogere blaaszuiverheid en resolutie te bereiken. De resulterende EV-preparaten zijn zeer geschikt voor downstream toepassingen, waaronder RNA-sequencing, proteomische profilering en functionele assays zoals pathogeneninteractie en EV-opnamestudies, waardoor reproduceerbaarheid en interpreteerbaarheid in plant-EV-onderzoek worden verbeterd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Voer centrifugatiestappen uit in een gekoelde centrifuge bij 4 °C om de EV-integriteit te behouden. Steriele buizen moeten worden gebruikt. Alle monsterbehandelingsstappen moeten snel en efficiënt worden uitgevoerd, idealiter door meerdere mensen die parallel werken, om weefselschade te minimaliseren en besmetting te voorkomen die de EV-kwaliteit kan schaden.

1. Bladvoorbereiding en infiltratie

  1. Bereid 1 L vesikelisolatiebuffer (VIB) voor bestaande uit 20 mM MES-hydraat, 2 mM CaCl2, 0,1 M NaCl, pH 6.
  2. Oogst de distale bladzones van bladeren door aan de basis van het blad te snijden om de bladsteel te verwijderen.
    OPMERKING: Er worden minstens 100 vier weken oude planten per behandeling of genotype aanbevolen om voldoende EV-opbrengst te garanderen. Arabidopsis-planten werden gekweekt onder 8 uur licht/16 uur donkere cycli. Gebruik geen bladeren die zichtbare tekenen van stress vertonen, zoals bladbleking en verschrompeling.
  3. Was bladeren drie keer met omgekeerde osmose (RO) water. Leg ze op keukenpapier en dep ze voorzichtig droog.
  4. Vul ongeveer 50 ml bladeren in een spuit van 120 mL. Tik zachtjes op de spuit om de bladeren te laten zakken.
  5. Voeg ongeveer 60 mL VIB toe aan de spuit totdat de bladeren volledig zijn ondergedompeld. Stoot de gevangen lucht uit door voorzichtig op de zuiger te drukken. Druk een stuk parafilm dat vier keer is gevouwen op de punt van de spuit om lekkage te voorkomen.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van spuitgebaseerde vacuüminfiltratie moet je ervoor zorgen dat de spuit en de zuiger stevig zijn gemonteerd voordat vacuüm wordt toegepast. Oefen geleidelijk kracht uit en houd een stevige greep op de spuit om plotselinge beweging van de zuiger of verlies van controle te voorkomen.
  6. Infiltreer bladeren door de zuiger langzaam naar buiten te trekken om een vacuüm te creëren. Houd de zuiger 5 seconden in de uitgestrekte positie en laat dan langzaam los. Herhaal deze infiltratiecyclus 2-3 keer totdat de bladeren donkerder en doorschijnend lijken, wat wijst op geslaagde infiltratie.
  7. OPMERKING: Het trekken van de zuiger vereist matige kracht vanwege vacuümweerstand. De spuit moet stevig worden vastgehouden terwijl de zuiger langzaam wordt teruggetrokken om gecontroleerde infiltratie te waarborgen.
  8. Zodra de bladeren zijn geïnfiltreerd, haal je de ontstopper eruit. Giet de overtollige buffer in de gootsteen.
  9. Herhaal stappen 1.4-1.7 totdat alle geoogste bladeren zijn geïnfiltreerd (Figuur 1A).

2. Verzameling van apoplastisch wasmiddel (AWF)

  1. Knip een ~12-inch strip Scotch tape af en plak die met de plakkant naar boven. Bevestig één uiteinde van de tape door het om een lege, onnodige 1 mL spuit net onder het bredere uiteinde te wikkelen. Rangschik zorgvuldig ongeveer 50-70 geïnfiltreerde bladeren in overlappende lagen langs het plakkerige oppervlak, waarbij je ze zo positioneert dat de basis van elk blad naar de onderste spuit wijst en de punten omhoog wijzen voor verzameling (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het aanbrengen van meerdere bladeren op één strip tape helpt schade te voorkomen. Lijn alle bladeren uit met het blad dat naar één uiteinde wijst en naar de onderkant van de verzamelbuis gericht om efficiënt apoplastische vloeistofterugwinning tijdens centrifugatie mogelijk te maken.
  2. Wikkel de met tape gebonden bladeren stevig om de spuit en maak de bovenkant van de bundel vast met twee stroken plakband. Steek de ingepakte spuit in een 50 mL buis met het afgesneden uiteinde van de bladeren en de spuitbasis naar de onderkant van de buis gericht. Zorg ervoor dat de bladeren stevig zijn vastgeplakt, want losse verpakking kan bladschade veroorzaken en gebroken cellen vrijlaten die de apoplast wasvloeistof besmetten (Figuur 1B).
  3. Centrifugeer de ingepakte spuit met geïnfiltreerde bladeren op 900 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C met behulp van een gekoelde centrifuge uitgerust met een rotor met vaste hoek. Verzamel het apoplastische wasmiddel in een nieuwe 15 mL conische buis en bewaar het monster op ijs. Herhaal stappen 2.1-2.3 totdat alle bladeren zijn gebruikt om AWF te verzamelen.
    OPMERKING: De AWF moet helder zijn, niet groen of zelfs lichtgroen. Een groene AWF geeft de aanwezigheid van chloroplasten/chlorofyl aan en kan ook wijzen op celbesmetting. Om bladschade te minimaliseren, gebruik je een rotor met vaste hoek.

3. Arabidopsis EV-isolatie van AWF via differentiële centrifugatie

  1. Centrifugeer het verzamelde apoplastische wasmiddel op 2.000 g gedurende 20 minuten bij 4 °C met een gekoelde centrifuge uitgerust met een schandlerrotor, met standaard versnellings- en vertragingsinstellingen. Na centrifugatie gebruik je een 0,45 μm nyloncelfilter om grote cellulaire resten van het supernatant te verwijderen. Gooi het pelletje weg. Breng het gefilterde supernatant over in nieuwe centrifugebuizen (Figuur 2).
  2. Centrifugeer het gefilterde supernatant op 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C met een gekoelde centrifuge uitgerust met een rotor met vaste hoek, met standaard versnellings- en vertragingsinstellingen. Gooi de pellet weg en bewaar het supernatant voor ultracentrifugatie. Deze stap verwijdert verder grote cellulaire resten en grote blaasjes (Figuur 2).
  3. Breng het supernatant over in 17 mL ultracentrifugebuizen en ultracentrifuge op 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge uitgerust met een schandbakrotor, met standaard instellingen voor acceleratie en vertraging. Na centrifugatie wordt het supernatant afgevoerd en het pellet opnieuw opgehangen in ongeveer 16 mL VIB-buffer voor was. Herhaal de ultracentrifugatieronde om EV's te verzamelen (Figuur 2).
    OPMERKING: Centrifugatie bij 100.000 x g wordt uitgevoerd voor de sedimentatie van kleine blaasjes zoals exosomen. Vervolgde wasstappen helpen niet-EV-eiwitten te elimineren door de pellet opnieuw in de buffer te laten ophangen. Ultracentrifugebuizen moeten zorgvuldig in balans zijn volgens de specificaties van de fabrikant vóór centrifugatie. Controleer buizen en rotors op defecten voordat je ze gebruikt en zorg ervoor dat de rotor correct vastzit voordat je met de run begint.
  4. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pelletje opnieuw in VIB. Gebruik een pipettip om voorzichtig de onderkant van de buis te schrapen om de volledige terugwinning van de EV-pellet te vergemakkelijken (Figuur 2).
    OPMERKING: De EV-pellet is vaak doorschijnend en is mogelijk visueel niet meer detecteerbaar zodra het opnieuw is opgehangen. Voorzichtig schrapen aan de onderkant van de buis vergemakkelijkt het proces van het ophangen van de EV. Pas het ophangingsvolume aan om de gewenste EV-concentratie te bereiken, aangezien kleinere ophangingsvolumes doorgaans leiden tot meer geconcentreerde EV-voorbereidingen. Typisch levert het hersuspenderen van EV's in 50 μL eiwitconcentraties op van ongeveer 1-1,5 μg/μL en deeltjesconcentraties die dicht bij 109-10 deeltjes per mL liggen.
  5. Bewaar de opnieuw opgehangen EV's bij 4 °C voor direct gebruik of bij -80 °C voor langdurige opslag zonder plotselinge bevriezing in vloeibare stikstof.
    OPMERKING: Langdurige opslag kan de integriteit van EV's verminderen. Gebruik waar mogelijk vers voorbereide EV's.

4. Gebruik van sucrosedichtheidsgradiëntfractie voor EV-zuivering

OPMERKING: Ultracentrifugatie alleen co-sedimenteert meerdere typen blaasjes. Om een fijnere resolutie te bereiken, kan dichtheidsgradiëntfractie worden toegepast, waarbij vesikels worden gescheiden op basis van hun drijfdichtheid en flotatie-eigenschappen. In deze benadering worden sucrosegradiënten gebruikt om gedefinieerde EV-subpopulaties te verrijken. Alternatief kunnen jodixanolgradiënten worden gebruikt.

  1. Top-loading sucrosegradiënt-scheiding van EV's
    1. Bereid 10-90% sucrosegradiëntvoorraden voor bestaande uit de volgende concentraties: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% en 90% met VIB. Gebruik een waterbad van 60 °C om de 70% en 90% voorraden op te lossen.
    2. Bereid een discontinu gradiënt voor door 1 mL van elke sucroseoplossing in een 17 mL ultracentrifugebuis te leggen, beginnend met de meest geconcentreerde oplossing onderaan en sequentieel doorlopend tot de minst geconcentreerde. Sluit de 10% sucroselaag uit bij het samenstellen van de gradiënt.
      OPMERKING: Verdeel elke dichtheidslaag zorgvuldig langs de binnenwand van de buis om menging tussen aangrenzende lagen te minimaliseren. Een automatische pipet die op een lage doseersnelheid is ingesteld, wordt aanbevolen om een continue, gecontroleerde stroming te bieden en de stabiliteit van het geloop te verbeteren. Als een gewone handmatige pipet wordt gebruikt, moet het doseren langzaam en gestaag worden uitgevoerd, waarbij de pipettip net boven het oppervlak van de vorige laag wordt geplaatst, en zorgvuldig wordt geacht om luchtbellen te voorkomen.
    3. Meng de opnieuw gesuspendeerde EV-pellet (~100 μg EV-eiwit) met de 1 mL 10% sucroseoplossing. Vervolgens leg je dit mengsel als de laatste laag van de discontinue laag. Het totale volume zal ~12,1 mL bedragen.
    4. Centrifugeer op 100.000 g gedurende 16 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Voor langdurige ultracentrifugatieruns moet gecontroleerd worden dat buizen, doppen en rotoren geschikt zijn voor langdurige werking met hoge snelheid en dat de door de fabrikant aanbevolen balanceringsprocedures worden gevolgd.
    5. Verzamel zes fracties van 2 mL per monster door van bovenaf te pipetteren. Breng elke fractie over in een nieuwe 17 mL ultracentrifugebuis.
    6. Sussen de verzamelde fracties opnieuw in een ~16 mL VIB-buffer en centrifugeer op 100.000 g gedurende 1 uur bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatant weg en suspendeer elke pellet opnieuw in 50 μL VIB.
      OPMERKING: De EV-pellet is niet zichtbaar. Schraap voorzichtig de onderkant van de buis met de pipettip om opnieuw te suspenderen. Pas het buffervolume aan indien nodig (bijvoorbeeld 10 μL voor een hogere concentratie).
  2. Bodembelastende sucrosegradiëntscheiding van EV's
    1. Bereid 10-90% sucrosegradiëntvoorraden voor bestaande uit de volgende concentraties: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% en 90% met behulp van de VIB-buffer. Gebruik een waterbad van 60 °C om de 70% en 90% voorraden op te lossen.
    2. Meng de opnieuw gesuspendeerde EV-pellet (~100 μg EV-eiwit) met de 1 mL 90% sucroseoplossing. Vervolgens legt je dit mengsel als de eerste laag van een discontinue laag.
    3. Bereid de resterende discontinue sucrosegradiënt voor door achtereenvolgens 1 mL van elke sucroseoplossing bovenop het EV-90% sucrosemengsel te leggen, beginnend bij 70% sucrose en stapsgewijs door tot lagere concentraties (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% en 10%). Doseer elke laag voorzichtig langs de wand van de buis met een pipet om menging tussen aangrenzende lagen te minimaliseren. Het totale volume zal ~12,1 mL bedragen.
    4. Centrifugeer op 100.000 g gedurende 72 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Voor langdurige ultracentrifugatieruns moet gecontroleerd worden dat buizen, doppen en rotoren geschikt zijn voor langdurige werking met hoge snelheid en dat de door de fabrikant aanbevolen balanceringsprocedures worden gevolgd.
    5. Verzamel zes fracties van 2 mL per monster door van bovenaf te pipetteren. Breng elke fractie over in een nieuwe 17 mL ultracentrifugebuis.
    6. Suspendeer de verzamelde fracties opnieuw in een ~16 mL VIB-buffer en centrifugeer bij 100.000 g gedurende 1 uur bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatant weg en suspendeer elke pellet vervolgens opnieuw in 50 μL VIB-buffer.
      OPMERKING: De EV-pellet is niet zichtbaar. Schraap voorzichtig de onderkant van de buis met de pipettip om opnieuw te suspenderen. Pas het buffervolume aan indien nodig (bijvoorbeeld 10 μL voor een hogere concentratie).

5. Gebruik van grootte-uitsluitingschromatografie (35 nm kolom) om EV's te zuiveren

  1. Buffervoorbereiding en kolomevenwicht
    1. Bereid VIB en alle extra buffers vers voor. Filter alle buffers door een membraan van 0,22 μm en ontgas onder vacuüm voordat je ze gebruikt om luchtbellen en poriënblokkades te voorkomen.
      OPMERKING: Onvolledige ontgassing of het gebruik van ongefilterde buffers kan luchtbellen of deeltjes in het harsbed brengen, wat leidt tot verstoorde stroming en verminderde EV-scheidingsefficiëntie. Als er belletjes in de kolom worden waargenomen, moet de run worden gestopt en de kolom opnieuw in evenwicht worden gebracht.
    2. Laat de kolom en buffers in evenwicht komen tot kamertemperatuur (18-24 °C) voordat je de kolomkappen verwijdert.
      OPMERKING: De kolom en buffers moeten volledig in evenwicht zijn tot kamertemperatuur voordat de dop wordt verwijderd. Het aanbrengen van een buffer op kamertemperatuur op een koude kolom kan bellen veroorzaken in de hars, wat resulteert in vervormde elusieprofielen en verminderde reproduceerbaarheid.
    3. Zet de kolom rechtop en verwijder voorzichtig de bovenste kap van de kolom.
    4. Verwijder de onderste kap en laat de buffer volledig uit de kolom lopen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de opslagbuffer volledig uit de kolom is leeggehaald vóór de evenwicht.
    5. Evenwichtig de kolom door te spoelen met drie kolomvolumes (25,5 mL) ontgassde 0,22 μm VIB-buffer.
  2. EV-laden en monsterafname
    1. Gebruik 100 μg totaal EV-eiwit voor elke SEC-zuivering. Voordat je op de SEC-kolom laadt, stel je EV-monsters aan op een eindvolume van 500 μL met behulp van VIB.
    2. Breng de 500 μL EV-ophanging direct aan op de laadfrit bovenaan de kolom.
    3. Laat het monster volledig het resinbed binnengaan voordat je een VIB-buffer toevoegt. Houd een continue kolomstroom gedurende de scheiding om nauwkeurige grootte-gebaseerde elutatie te garanderen.
      OPMERKING: De kolomstroom moet gedurende de hele scheiding continu blijven bestaan. Het laten opdrogen van de kolom of het langdurig pauzeren van de stroom verstoort de op grootte gebaseerde scheiding en kan leiden tot fractieoverlap en verminderde EV-verrijking.
    4. Nadat het EV-monster (500 μL) volledig in het resinbed is binnengedrongen, voeg je 2 mL VIB toe en laat het volledig elueren. Dit eluaat komt overeen met het kolomdode volume en moet worden weggegooid. EV-fracties werden vervolgens verzameld door sequentieel 400 μL VIB toe te voegen en het eluaat te verzamelen, waarbij dit proces werd herhaald om fracties 1-6 in 1,5 mL microcentrifugebuizen te verkrijgen.
      OPMERKING: Het dode volume mag geen EV's bevatten. Op basis van validatie met de 35 nm-kolom worden EV's doorgaans teruggevonden in fracties 1-3. Indien nodig kan het dode volume worden beoordeeld met nanoparticle tracking analysis (NTA) of immunoblotting voor EV-markers om de afwezigheid van EV's te bevestigen.
  3. Kolkolomreiniging en opslag
    1. Direct na de fractieverzameling spoel je de kolom met één kolomvolume (8,5 mL) van 0,5 M NaOH om de hars te desinfecteren. Spoel vervolgens de kolom door met 17 mL VIB om de neutrale pH te herstellen. De kolom is dan klaar voor het laden van het volgende monster.
      OPMERKING: Het spoelen van de kolom alleen met buffer is onvoldoende om resterende eiwitten of blaasjes te verwijderen. De NaOH-reinigingsstap is essentieel om overdracht tussen monsters te voorkomen, vooral bij downstream nucleïnezuur- of RNA-analyses.
    2. Voor langdurige opslag spoel je de kolom na reiniging met twee kolomvolumes gedeïoniseerd water, gevolgd door twee kolomvolumes van 20% ethanol voor opslag. Zet de kolom weer in en bewaar hem rechtop.
      OPMERKING: Het spoelen van de kolom met gedeïoniseerd water vóór ethanolopslag voorkomt zoutkristallisatie in het harsbed, wat de prestaties van de kolom behoudt.

6. EV-validatie, kwantificering en beoordeling van grootte/morfologie

  1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
    1. Meet de EV-grootteverdeling en deeltjesconcentratie met NTA.
    2. Verdun de EV-monsters op 1:100 in steriel, 0,2 μm-gefilterde VIB om een deeltjesconcentratie binnen het optimale detectiebereik te bereiken (ongeveer 10⁷-10⁹ deeltjes/mL).
    3. Meng de verdunde monsters voorzichtig om bubbelvorming te voorkomen en laad ze in het instrument dat is uitgerust met een 532 nm laser en een hooggevoelige sCMOS-camera.
    4. Voer gegevensverzameling en analyse uit met behulp van NS Xplorer-software met een detectiedrempel van 10 nm (tot 1.000 nm), waarbij een dynamisch concentratie-algoritme op basis van observatievolume wordt toegepast.
  2. Western blot-analyse van EV-markers
    1. Voor Western blot-analyse spoelt en susseert u de EV-fracties die na sucrosegradiëntscheiding zijn verkregen in 50 μL VIB. Meng een aliquot van 10 μL uit elke fractie met SDS-laadbuffer, denatureer en los op een 12% Tris-glycine gel vóór immunoblotting met EV-marker TET8-antilichamen.
    2. Voor SEC-afgeleide EV-fracties wordt eerst 400 μL van elke fractie geconcentreerd tot 50 μL met behulp van een 100 kDa molecuulgewicht cutoff centrifugaalfilter. Gebruik vervolgens 10 μL van het geconcentreerde monster voor Western blot-analyse zoals hierboven beschreven.
  3. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Stort 5 μL EV's die in VIB hangen af op gloei-ontladen koolstofformvar 300-mesh roosters. Vervolgens word het overtollige monster afgewerkt met filterpapier.
    2. Daarna negatief kleuren met 3 μL elektronenmicroscopiekleuring, wicken af met filterpapier en laten het aan de lucht drogen voordat je met een 300 kV TEM beelden neemt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te evalueren of het geoptimaliseerde AWF-verzamelprotocol weefselschade en cytoplasmatische besmetting vermindert, werd de met onze methode verkregen AWF (Methode 1) direct vergeleken met een alternatieve methode (Methode 2) gebaseerd op infiltratie van een vacuümpomp voor de hele fabriek11. Celschade na infiltratie werd beoordeeld met Trypan Blue-kleuring, die een duidelijk verminderde kleuring in bladeren die met Methode 1 werden verwerkt aan het licht bracht...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Plant-EV's zijn uitgegroeid tot cruciale spelers in plantimmuniteit, met name bij het bemiddelen van communicatie tussen de koninkrijken met schimmelpathogenen32. Steeds meer bewijs toont aan dat planten EV's afscheiden in de apoplast, waar ze kleine RNA's (sRNA's), mRNA's en eiwitten afleveren die virulentie kunnen onderdrukken bij binnendringende pathogenen, zoals Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani en oomycete-pathogeen Phytophthora capsi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflict bekend.

Dankbetuigingen

De B.D. wordt ondersteund door de Pathways to the Doctorate Fellowship van Texas A&M University. B.H. wordt ondersteund door startkapitaal van Texas A&M University en het United States Department of Agriculture HATCH 7009138 projectnummer: TEX08074.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 µm nylon filtersVWR76479-032
1 ml needless syringeBD Biosciences309659
100 kDa ultra centrifugal filterAmiconUFC 910008
100 ml needless syringeBD Biosciences551721050
15 ml conical tubesVWR89039-664
50 ml conical tubesVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)laboratory-maintained linesNiet van toepassing
Carbon-formvar 300-mesh gridsTED PELLA01753-F
Clear tapeScotch Magic TapeS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
PBS bufferMade in houseNiet van toepassing
qEV original column Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Refrigerated centrifugeEppendorf5810R
Refrigerated centrifuge fixed-angle rotorEppendorfF-34-6-38
Refrigerated centrifuge swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
SucroseVWR470302-810
UltracentrifugeBeckman CoulterXPN-100
Ultracentrifuge tubesBeckman Coulter337986
UranyLess stainElectron Microscopy Sciences250218-01

Referenties

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van vesiclesdifferentiële centrifugatiesucrosegradiëntgrootte-uitsluitingschromatografienanoparticle trackingtransmissie-elektronenmicroscopieplant-microbe-interactie
Isolatie en zuivering van extracellulaire plantblaasjes uit Arabidopsis-bladeren met behulp van een geoptimaliseerde apoplastische wasverzamelmethode
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.