Dit protocol beschrijft de fabricage van oplosbare micronaaldpatches met α-lactalbumine nanomicellen geladen met capsaïcine. De methode biedt een reproduceerbare, minimaal invasieve benadering voor gerichte transdermale toediening van hydrofobe bioactieve stoffen aan vetweefsel, wat efficiënte lokale vetreductie faciliteert en mogelijk de toepassingen in obesitasbeheer uitbreidt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabricage van oplosbare micronaaldpatches geladen met α-lactalbumine nanomicellen voor transdermale capsaïcineafgifte en vetweefselreductie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft de fabricage en toepassing van oplosbare micronaald (MN) patches met α-lactalbumine nanomicellen voor de gerichte transdermale afgifte van capsaïcine aan vetweefsel. Het proces begint met de gedeeltelijke enzymatische hydrolyse van α-lactalbumine, wat resulteert in amfifiele peptiden die zichzelf assembleren tot nanomicellen die de hydrofobe verbinding capsaïcine omsluiten. De met capsaïcine geladen nanomicellen worden gemengd met een hyaluronzuur (HA) en polyvinylalcohol (PVA) matrix, gegoten in polydimethylsiloxaan (PDMS) mallen en gecentrifugeerd om 10 × 10 MN arrays te produceren. Na vacuümdrogen vertonen de MN's voldoende mechanische sterkte voor huidpenetratie en lossen ze binnen ongeveer 30 minuten na aanbrengen op. Representatieve resultaten zijn onder andere scanning-elektronenmicroscopie, die de uniforme morfologie van MN's bevestigt, confocale microscopie, die huidpenetratie en geneesmiddelafgifte verifieert, en in vivo-experimenten bij muizen met een hoog vetdieet (HFD) die verminderde vetmassa, verhoogde metabole activiteit en inductie van vetbruining vertonen. Dit protocol biedt een reproduceerbare en minimaal invasieve methode voor de transdermale toediening van hydrofobe bioactieve stoffen, en biedt een veelbelovende therapeutische aanpak voor het beheer van obesitas. Dit protocol is geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en is geschikt voor aanpassing aan andere hydrofobe bioactieve stoffen.
Inleiding
Obesitas is een van de meest urgente wereldwijde gezondheidsuitdagingen geworden, waarbij de prevalentie gestaag toeneemt in zowel ontwikkelde als ontwikkelingslanden. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie werden in 2016 meer dan 650 miljoen volwassenen als obesitas geclassificeerd, en in 2022 was ongeveer 43% van de volwassenen van ≥18 jaar overgewicht, en 16% leefde met obesitas1. Obesitas wordt nauw geassocieerd met het metabool syndroom, hart- en vaatziekten, type 2 diabetes en verschillende vormen van kanker, wat aanzienlijke sociaaleconomische en zorglasten met zich meebrengt 2,3. Huidige therapeutische strategieën, waaronder dieetbeperking, beweging, farmacotherapie en bariatrische chirurgie, bieden slechts gedeeltelijke en vaak tijdelijke voordeel. Deze benaderingen hebben vaak last van slechte patiënttherapie, beperkte langetermijneffectiviteit, hoge invasieve effectiviteit en ongewenste bijwerkingen 4,5. Daarom is er een dringende behoefte aan veilige, effectieve en patiëntconforme lokale therapieën voor obesitasbeheer.
Natuurlijke bioactieve verbindingen hebben steeds meer belangstelling getrokken als anti-obesitasmiddelen vanwege hun multigerichte werking en over het algemeen gunstige veiligheidsprofielen. Zo vertoont rutin, een flavonoïde glycoside, antilipogene en metabole regulerende effecten door adipogene transcriptiefactoren te onderdrukken en mitochondriale biogenese6 te bevorderen. Capsaïcine, het doordringende bestanddeel van chilipepers, is gerapporteerd als verhoogd in het energieverbruik, het veroorzaken van bruining van wit vetweefsel en het remmen van lipidenophoping via activatie van transient receptorpotentiaal vanilloid 1 (TRPV1) signaal 7,8. De klinische vertaling van deze verbindingen wordt echter belemmerd door slechte oplosbaarheid van het water, lage orale biobeschikbaarheid, snelle stofwisseling en, in het geval van capsaïcine, gastro-intestinale irritatie bij inname9.
Op nanotechnologie gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen bieden veelbelovende oplossingen voor deze beperkingen. Liposomen, polymeernanodeeltjes en eiwitgebaseerde nanodragers kunnen de oplosbaarheid, stabiliteit en cellulaireopname van geneesmiddelen aanzienlijk verbeteren. In het bijzonder kan α-lactalbumine, een voedingsafgeleid melkeiwit, gedeeltelijk worden gehydrolyseerd tot amfifiele peptiden die zichzelf assembleren tot nanomicellen die in staat zijn hydrofobe moleculen zoals capsaïcine11 te omsluiten. Deze α-lactalbumine nanostructuren zijn aangetoond de oplosbaarheid, stabiliteit en biobeschikbaarheid van diverse hydrofobe bioactieve stoffen in voedsel- en farmaceutische matrices te verbeteren12,13. Desalniettemin kan systemische toediening van nanodragers nog steeds leiden tot off-target weefseldistributie en mogelijke systemische toxiciteit14.
Microneedle (MN)-technologie is uitgegroeid tot een minimaal invasief, patiëntvriendelijk platform voor transdermale geneesmiddelafgifte. Oplosbare MN's die zijn gemaakt van biocompatibele polymeren zoals hyaluronzuur (HA) en polyvinylalcohol (PVA) kunnen pijnloos het stratum corneum binnendringen, na inbreng oplossen en een nauwkeurige lokale geneesmiddeldepositie in doelgerichteweefsels mogelijk maken. Het combineren van nanodragers met MN's verhoogt verder de ophoping van medicijnen in subcutaan vetweefsel, terwijl systemische blootstelling en bijwerkingen worden verminderd17. Belangrijk is dat oplossende HA- en PVA-gebaseerde MN-pleisters worden bevorderd naar klinisch gebruik voor transdermale afgifte van vaccins en biofarmaceutica, wat gunstige veiligheid, patiëntacceptatie en vervaardigbaarheid op schaal18 aantonen.
Voortbouwend op deze vooruitgang beschrijft de huidige studie de fabricage van oplosbare MN-patches geladen met α-lactalbumine-nanomicellen die capsaïcine inkapselen. In dit protocol wordt α-lactalbumine opgelost bij 6 mg/mL en enzymatisch gehydrolyseerd om amfifiele peptiden te genereren die zichzelf assembleren tot capsaïcine-geladen nanomicellen. De nanomicellen worden verwerkt in een HA/PVA-matrix (elk 5% w/v) en gegoten in polydimethylsiloxaan (PDMS)-mallen om 10 × 10 MN-arrays te vormen met een naaldhoogte van 600 μm, een configuratie die compatibel is met standaard micro-moldingprocessen en gemakkelijk schaalbaar is naar grotere, mensgrote patches. Dit geïntegreerde ontwerp zal naar verwachting de capsaïcine-oplosbaarheid en stabiliteit verbeteren, pH-responsieve afgifte in vetweefsel bieden en de lokale anti-obesitaseffectiviteit in vivo vergroten door het bevorderen van het bruinen van vetweefsel, het onderdrukken van lipogenese en het verbeteren van systemische metabole parameters. Door gebruik te maken van voedselveilige α-lactalbumine en klinisch geavanceerde oplossende MN-materialen, biedt dit platform een translationeel relevante, minimaal invasieve strategie die kan worden aangepast aan menselijke pleisters voor zelftoediende, lokale obesitastherapie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Proefdieren en werden goedgekeurd door de Commissie Ethiek voor Experimentele Dieren in Peking. Het toegewezen goedkeuringsnummer van het laboratorium/onderzoeker is AW03019102-3. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Bereiding van α-Lactalbumine nanomicellen die capsaïcine 12 inkapselen
- Los α-lactalbumine op in gedeïoniseerd water tot een concentratie van 6 mg/mL en stel de pH aan naar 7,4. Roer de oplossing met een magnetische roeraar op 8-28 × g totdat α-lactalbumine volledig is opgelost (meestal 20-30 minuten).
- Voeg Bacillus licheniformis protease (BLP) toe bij een enzym-substraatverhouding van 1:100 (w/w).
- Incubeer het mengsel bij 50 °C gedurende 30 minuten om amfifiele peptiden te genereren.
- Beëindig de reactie door de oplossing 5 minuten te verhitten tot 95 °C, daarna af te koelen tot kamertemperatuur en filter door een membraan van 0,22 μm.
- Los capsaïcine op in ethanol tot een concentratie van 1 mg/mL. Voeg de capsaïcineoplossing druppelgewijs toe aan de peptideoplossing onder voorzichtig roeren.
- Blijf 2 uur roeren om zelfassemblage van nanomicellen mogelijk te maken.
- Verwijder vrije capsaïcine door het mengsel (MWCO 3,5 kDa) 12 uur te dialyseren tegen gedeïoniseerd water, waarbij het water elke 4 uur wordt vervangen.
- Vriesdroog (lyofiliseren) de voorbereide α-lactalbumine nanomicellen.
- Karakteriseer de nanomicellen met behulp van TEM-, DLS- en zetapotentiaalanalyse.
2. Fabricage van oplosbare micronaaldpatches 11
- Bereid de polymeeroplossing voor door HA (5% w/v) en PVA (5% w/v) op te lossen in gedeïoniseerd water bij 60 °C en te roeren tot de oplossing helder wordt.
- Koel de polymeeroplossing tot kamertemperatuur en meng het met de capsaïcine-belaste nanomicellen (M(Cap)) in een verhouding van 4:1.
- Ontgass het mengsel onder vacuüm in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp (ongeveer −80 kPa) gedurende 10 minuten om luchtbellen te verwijderen voordat het in PDMS-mallen wordt gegoten.
- Laad 200 μL van het mengsel in PDMS-mallen (10 × 10 naaldarray, 600 μm hoogte).
- Centrifugeer de mallen op 1800 × g bij RT gedurende 10 minuten om volledige vulling van de micronaaldholtes te garanderen.
- Herhaal de vulling één keer, gevolgd door een tweede centrifugatie onder dezelfde omstandigheden als in stap 2.5, en droog vervolgens de mallen onder vacuüm (ongeveer −80 kPa) bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
- Haal voorzichtig de micronaaldpatches van de mallen.
- Onderzoek de morfologie van micronaalden via SEM.
3. Mechanische tests van micronaalden 19
- Plaats de micronaaldpatch op het niveau van een textuuranalyzer met de naalden naar boven gericht.
- Comprimeer de patch met een sonde met een snelheid van 20 μm/s totdat een verplaatsing van 0,7 mm is bereikt.
- Noteer de breukkracht en bevestig dat deze ≥0,15 N per naald is om de doordringbaarheid van de huid te waarborgen.
4. In vitro inbrengen en oplossingstest 11
- Schaf de buikhuid van muizen en verwijder de huid voor ex vivo testen.
- Plaats de verwijderde huid op een agarosegel-ondersteuning.
- Druk de micronaaldpatch stevig op de huid gedurende 30 seconden.
- Houd contact tussen de pleister en de huid gedurende 30 minuten.
- Observeer het oplossen van de naald.
- Kleur de huid met H&E-kleuring en visualiseer de aanhechtingsplaatsen onder CLSM.
5. In vitro-release studie 11
- Dompel micronaaldpleisters onder in een PBS-buffer (pH 6,5 of 7,4) bij 37 °C.
- Op bepaalde intervallen neem je buffermonsters terug en vul je direct aan met een gelijke hoeveelheid verse buffer.
- Bepaal de capsaïcineconcentratie in de verzamelde monsters met behulp van HPLC.
- Vergelijk de releaseprofielen bij verschillende pH-omstandigheden met behulp van HPLC.
6. In vivo toepassing bij door HFD geïnduceerde obese muizen 11
- Induceer obesitas bij C57BL/6N-muizen door 8 weken lang een vetrijk dieet (HFD, 60% kcal uit vet) te voeren.
- Verdeel de muizen willekeurig in vijf groepen: normale controle, HFD-controle, blanke micelle micronaaldpatch (MP-M), capsaïcine-geladen nanomicelle-injectie (InJ-M(Cap)), en capsaïcine-geladen nanomicelle micronaaldpatch (MP-M(Cap)).
- Ontharen het liesgebied van elke muis.
- Breng elke 2 dagen gedurende 28 dagen één micronaaldpleister aan op het onthaarde gebied en houd de pleister 30 minuten op zijn plaats.
- Noteer elke 2 dagen het lichaamsgewicht en de voedselinname tijdens de behandelingsperiode.
- Analyseer aan het einde van de behandeling vet- en magerweefselsamenstelling met een MRI.
- Beoordeel de lichamelijke activiteit, zuurstofverbruik, CO₂-productie en respiratoire quotiënt (RQ) in metabole kooien volgens de instructies van de fabrikant.
- Verzamel iWAT, sBAT en belangrijke organen, fixeer de weefsels met H&E vast, inbouw, snijd en kleur de weefsels met H&E, en evalueer histologische veranderingen met lichtmicroscopie.
- Voer Western blotting uit voor TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 en Cyt C volgens standaardprocedures.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Morfologie en karakterisering van nanomicellen
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) toonde aan dat α-lactalbumine-nanomicellen uniform verspreide, bolvormige deeltjes waren met een smalle grootteverdeling (Figuur 1). Na capsaïcine-inkapseling nam de gemiddelde deeltjesdiameter toe van ~22 nm naar ~30 nm, wat wijst op succesvolle geneesmiddelbelasting in de micellaire kern. Consistent verschoof het zetapotentiaal licht van −16,8 mV naar...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie toont aan dat oplosbare micronaald (MN) pleisters geladen met α-lactalbumine nanomicellen die capsaïcine (M(Cap)) inkapselen, lokale, minimaal invasieve anti-obesitaseffecten kunnen bereiken. α-Lactalbumine-nanomicellen capsuleerden efficiënt hydrofobe capsaïcine, verbeterden de waterdispersibiliteit en vergrootten de cellulaire opname, wat leidde tot sterkere remming van adipogenese en een prominentere mitochondriale biogenese in 3T3-L1 adipocyten dan vrije capsaïcine. Deze ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Dit project werd ondersteund door het Young Scientists Fund van de National Natural Science Foundation of China (nr. 32202024), het Young Scientists Fund van de Shandong Provincial Natural Science Foundation (nr. ZR2024QC103), het Belangrijk Onderzoeks- en Ontwikkelingsplan van de provincie Shandong (2025CXGC010803, 2022CXPT022), het Shandong Province Poultry Industry Technology System (SDAIT-11-10), en het Universiteiten-Industrie Samenwerkingsprogramma gefinancierd door het Bureau of Education van Yantai City, China (Development of Next-Generation Vaccines Platform for Pet Animals).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3T3-L1 preadipocytes | ATCC | CL-173 | Cellijn voor adipogenese-onderzoek |
| Bacillus licheniformis protease (BLP) | Sigma-Aldrich | P5380 | Enzymatische hydrolyse van α-lactalbumine |
| Capsaïcine (≥98%) | Sigma-Aldrich | M2028 | Actief bestanddeel om te worden ingekapseld |
| Centrifuge (≥4000 rpm) | Eppendorf | 5810R | Voor het vullen van mallen |
| Confocale laserscanningmicroscoop (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Voor het visualiseren van micellendistributie en penetratie |
| Cy3-fluorescente kleurstof | GE Healthcare | PA23001 | Voor het labelen van nanomicellen |
| Cy5- of Cy7-fluorescente kleurstoffen | Fanbo Biochemical, Beijing, China | N/A | Voor biodistributiebeeldvorming |
| Dulbecco’s Aangepast Eaglemidium (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Voor celcultuur |
| Ethanol (≥99,7%) | Sinopharm Chemical Reagent | 100092683 | Oplosmiddel voor capsaïcine |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Voor celcultuur |
| Hoogvetdieet (60% kcal vet, D12492) | Research Diets, USA | D12492 | Om obesitas bij muizen te induceren |
| Hyaluronzuur (HA, Mw 100–300 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | H108124 | Polymeer voor micronaaldfabricage |
| Isofluraan | RWD, China | R510-22-10 | Verdoving |
| Metabolische kooi-installatie | Panlab, USA | N/A | Voor het beoordelen van activiteit, zuurstofverbruik en RQ |
| Milli-Q Gedeïoniseerd water | Millipore | N/A | Oplosmiddel |
| MRI-systeem | NiuMag, China | MesoQMR23-060H-I | Voor het meten van vet/magere lichaamssamenstelling |
| PDMS-micronaaldmalen (10 × 10, 600 μm hoogte) | Blueacre Technology of op maat | N/A | Micronaaldfabricage |
| Penicilline-streptomycine | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Voor celcultuur |
| Fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS, pH 7,4) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Buffer voor in vitro en in vivo-onderzoek |
| Polyvinylalcohol (PVA, Mw 30–70 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | P109389 | Polymeer voor micronaaldfabricage |
| Scanning elektronenmicroscoop (SEM) | FEI Tecnai | G2 F30 | Voor het karakteriseren van micronaaldmofologie |
| Textuuranalyser | BosinTech, Shanghai, China | TA.XTC-20 | Om micronaaldsterkte te testen |
| Trypanblauwoplossing (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Om micronaaldinbrengplaatsen te visualiseren |
| UV–Vis-spectrofotometer | PerkinElmer | Lambda 35 | Voor geneesmiddelafgiftetests |
| Vacuumoven/exsiccator | Thermo Fisher Scientific | N/A | Voor het drogen van micronaalden |
| Western blotting-apparatuur | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra | Eiwitanalyse |
| α-Lactalbumine (≥95%) | Sigma-Aldrich | L6010 | Eiwitbron voor nanomicelvorming |
Referenties
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 18 (7), 715-723 (2017).
- Hruby, A., Hu, F. B. The epidemiology of obesity: A big picture. Pharmacoeconomics. 33 (7), 673-689 (2015).
- Dietrich, M. O., Horvath, T. L. Limitations in anti-obesity drug development: The critical role of hunger-promoting neurons. Nat Rev Drug Discov. 11 (9), 675-691 (2012).
- Garvey, W. T., et al. American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology comprehensive clinical practice guidelines for medical care of patients with obesity. Endocr Pract. 22, 1-203 (2016).
- Li, Z., Liang, S., Sun, H., Bao, C., Li, Y. Antilipogenesis effect of rutin-loaded liposomes using a microneedle delivery system. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (47), 54294-54303 (2023).
- Hsu, C. L., Yen, G. C. Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. J Agric Food Chem. 55 (21), 8404-8410 (2007).
- Zhang, L. L., et al. Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity. Circ Res. 100 (7), 1063-1070 (2007).
- Zheng, J., Zheng, S., Feng, Q., Zhang, Q., Xiao, X. Dietary capsaicin and its anti-obesity potency: from mechanism to clinical implications. Biosci Rep. 37 (3), BSR20170286(2017).
- Negahdari, R., et al. Therapeutic benefits of rutin and its nanoformulations. Phytother Res. 35 (4), 1719-1738 (2021).
- Bao, C., et al. Microneedle patch delivery of capsaicin-containing α-lactalbumin nanomicelles to adipocytes achieves potent anti-obesity effects. Adv Funct Mater. 31 (20), 2011130(2021).
- Hu, Y., et al. The construction of enzymolyzed α-lactalbumin-based micellar nanoassemblies for encapsulating various kinds of hydrophobic bioactive compounds. Food Funct. 10 (12), 8263-8272 (2019).
- Wang, Q., et al. The stability and bioavailability of curcumin-loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink. Food Hydrocoll. 131, 107807(2022).
- Luo, T., et al. Adipose tissue-targeted drug delivery for treating obesity: Current opportunities and challenges. Drug Deliv. 32 (1), 2547751(2025).
- Patel, D., Patel, N., Parmar, M., Kaur, N. Transdermal drug delivery system: An overview. Int J Toxicol Pharmacol Res. 1, 61-80 (2011).
- Singh, P., et al. Single-administration self-boosting microneedle patch for the treatment of obesity. Adv Ther. 7 (9), 2400028(2024).
- Than, A., et al. Transdermal delivery of anti-obesity compounds to subcutaneous adipose tissue with polymeric microneedle patches. Small Methods. 1 (11), 1700269(2017).
- Nguyen, H. X., Nguyen, C. N. Microneedle-mediated transdermal delivery of biopharmaceuticals. Pharmaceutics. 15 (1), 277(2023).
- Chu, L. Y., Choi, S. O., Prausnitz, M. R. Fabrication of dissolving polymer microneedles for controlled drug encapsulation and delivery: Bubble and pedestal microneedle designs. J Pharm Sci. 99 (10), 4228-4238 (2010).
- Richmond, W., Wogan, M., Isbell, J., Gordon, W. P. Interstrain differences of in vitro metabolic stability and impact on early drug discovery. J Pharm Sci. 99 (11), 4463-4468 (2010).
- Amini-Nik, S., Yousuf, Y., Jeschke, M. G. Scar management in burn injuries using drug delivery and molecular signaling: Current treatments and future directions. Adv Drug Deliv Rev. 123, 135-154 (2018).
- Prausnitz, M. R., Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 26 (11), 1261-1268 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
