Methodenartikel

Antiproliferatieve plaque-assay voor screening in vitro bioactieve moleculen tegen Toxoplasma gondii Tachyzoïten

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk heeft als doel een eenvoudige methode van plaque-assay te beschrijven om te helpen bij het screenen van nieuwe bioactieve moleculen tegen het tachyzoietstadium van de protozoa Toxoplasma gondii.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toxoplasmose is een parasitaire infectie die vaak verband houdt met oogletsels en neonatale misvormingen. Sinds het begin van de jaren vijftig is de eerstelijnsbehandeling van deze ziekte gebaseerd op de combinatie van sulfadiazine, pyrimethamine en folinezuur. In die jaren zijn er slechts enkele alternatieve regimes geïntroduceerd. Dit benadrukt de noodzaak om nieuwe bioactieve moleculen tegen Toxoplasma gondii te ontdekken. Aangezien deze pathogeen een obligate intracellulaire parasiet is, vereist traditionele geneesmiddelenscreening in het laboratorium doorgaans dure materialen en apparatuur, zoals assays met fluorescerende eiwitten of parasieten die β-galactosidase expressieën. Daarnaast kunnen methoden zoals kwantificatie van optische microscopie tijdrovend zijn. De plaque-assay is een methode die de intensiteit van intracellulaire proliferatie van ziekteverwekkers evalueert door het aantal gebieden en het vernietigingsgebied in een celmonolaag te meten die beschadigd is door de lytische cyclus van de parasiet. Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd plaque-assayprotocol dat is ontworpen om actieve moleculen te screenen op intracellulaire tachyzoïeten van T. gondii in vitro. Dit protocol maakt gebruik van goedkope materialen en een eenvoudige laboratoriumopstelling, wat snelle en reproduceerbare resultaten oplevert die de identificatie van nieuwe actieve moleculen tegen deze parasiet door verschillende onderzoeksgroepen vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toxoplasmose is een zoönotische ziekte met een heterogene verspreiding wereldwijd, die ongeveer een derde van de wereldbevolking treft 1,2. De symptomen van deze ziekte zijn geassocieerd met de mate van gastheerimmuniteit en de replicatie van de parasiet 3,4. De acute fase van de ziekte, gekenmerkt door de replicatie van het tachyzoietstadium, is over het algemeen asymptomatisch bij immuuncompetente personen 5,6. Daarentegen presenteren immuungecompromitteerde personen vaker symptomen, waaronder niet-specifieke symptomen zoals algemene malaise, koorts, evenals encefalitis en retinochoroiditis 6,7,8. Ondanks het klinische belang is de huidige behandeling niet effectief tegen het Toxoplasma gondii bradyzoietstadium (in de chronische fase) en leidt het niet tot een parasitologische genezing. Bijwerkingen van huidige medicijnen verminderen ook de therapietrouw 9,10,11. Het is daarom noodzakelijk nieuwe, veiligere en effectievere behandelingen voor toxoplasmose te vinden.

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen vereist een lange periode, miljarden dollars aan investeringen en meerdere onderzoeksfasen. Omdat de kosten van geneesmiddelontwikkeling hoog zijn, moet de farmaceutische industrie vooraf de beste geneesmiddelkandidaat selecteren 12,13,14,15. Voor drugsscreening kunnen verschillende benaderingen worden toegepast, waaronder silico-methoden, het gebruik van kunstmatige intelligentie, en de meest gangbare benadering, biologische methoden 16,17,18,19. In vitro biologische screening omvat het gebruik van bibliotheken van moleculen (chemobibliotheken) om moleculen beschikbaar te maken voor de identificatie van biologische activiteit 20,21,22. Omdat deze chemobibliotheken een diversiteit aan moleculen bevatten, is het noodzakelijk om middelen en tijd te optimaliseren. Daarom kan de plaque-assay een methode zijn om nieuwe bioactieve moleculen snel te screenen tegen verschillende ziekteverwekkers, zoals T. gondii.

De plaque-assay is een in vitro-methode die gebruikmaakt van de lytische cyclus van intracellulaire pathogenen om de concentratie pathogenen in een celmonolaag te kwantificeren, wat resulteert in de vorming van necrotische plaques in de loop van de tijd23. De eerste studie met de plaque-assaytechniek dateert uit het begin van de tweede helft van de 20e eeuw, toen het team van Renato Dulbecco monolagen van kipfibroblasten gebruikte die geïnfecteerd waren met het Western Equine Encephalomyelitis virus om de verhouding aan te tonen tussen het aantal gevormde necrotische plaques en de concentratie van virus16. Het gebruik van deze techniek bij T. gondii is ook goed beschreven, zoals eerder toelichtend door Ufermann en medewerkers23.

Een van de eerste studies waarbij de plaque-assay werd gebruikt om een reactie te observeren bij de remming van T. gondii tegen verschillende concentraties moleculen, werd uitgevoerd door Roberts et al. in 1976. Hoewel de plaque-assay veel wordt gebruikt voor virustitratie 16,24, is deze methode slechts door enkele onderzoeksgroepen gebruikt om de anti-T. gondii-activiteit van moleculen 21,22,25,26,27 te evalueren. Op zoek naar een assay die het mogelijk maakte verbindingsbibliotheken met hoge doorvoer, met goedkope materialen en een eenvoudige laboratoriumopstelling, werd de plaque-assay onderzocht als alternatief voor routinematige laboratorium drugsscreening. Dat leidde tot de oprichting van een geoptimaliseerd protocol dat gelijktijdige evaluatie van de activiteit van verschillende moleculen mogelijk maakt met eenvoudige materialen en een beeldverwerkingssysteem, wat snelle en reproduceerbare resultaten oplevert. Zo beschrijven we hier het gedetailleerde protocol, gevalideerd in ons laboratorium, om andere groepen te helpen bij het screenen van nieuwe bioactieve moleculen op tachyzoïeten van T. gondii.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De manipulatie van parasieten- en celkweken, evenals de verwijdering en bestemming van afval, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Braziliaanse wetgeving, zoals vereist door het Nationaal Agentschap voor Sanitaire Waakzaamheid (ANVISA) RDC nr. 222/2018. Alle procedures werden gecontroleerd door het Internal Biosafety Committee (CIBio) van ICB-UFMG. Deze studie betreft geen gebruik van dieren, mensen of genetisch gemodificeerde organismen. Subsidies van CNPq, CAPES en FAPEMIG ondersteunden dit werk. ESMD (CNPq 308082/2023-0) en RWAV (CNPq 305574/2021-3) zijn CNPq productiviteitsfellows. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van een aangevuld RPMI-1640 medium

OPMERKING: RPMI-1640 medium werd oorspronkelijk ontwikkeld voor het cultiveren van menselijke leukemiecellen in zowel suspensie als monolaag. Latere studies hebben echter aangetoond dat het geschikt is voor verschillende zoogdiercelkweek.

  1. Voeg aan de fles met 250 mL RPMI-1640 2,5 mL 200 mM L-glutamine (100x) toe.
  2. Voeg 2,5 ml van het anti-mycoticum (100x) toe aan het medium.
  3. Voeg vervolgens 5,0 mL of 25 mL fotaal rundserum (FBS) toe aan de fles met RPMI-1640 (2% of 10% FBS).
  4. Bewaar in een koelkast (2-8 °C).

2. Voorbereiding van PBS (1x)

OPMERKING: Om 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te bereiden bij pH 7,2 en 25 °C, volgt u de onderstaande stappen.

  1. Meet de volgende hoeveelheden zouten afzonderlijk af: 1,4 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 en 8,5 g NaCl.
  2. Voeg de gewogen zouten apart toe aan een 1 L beker met 800 ml gedeïoniseerd water. Roer de oplossing totdat alle zouten volledig zijn opgelost.
  3. Meet de pH van de oplossing met een pH-meter. Het zou 7,2 moeten zijn. Gebruik indien nodig 6 M zoutzuur of 3 M natriumhydroxide om de pH naar 7,2 te brengen.
  4. Met een glazen staaf breng je de bovenstaande oplossing kwantitatief over in een 1 L volumetrische kolf.
  5. Voeg gedeïoniseerd water toe aan de volumetrische kolf totdat het totale volume 1 L bereikt, zodat de meniscus op het juiste punt zit.
  6. Meng de oplossing in de volumetrische kolf en draai hem voorzichtig om.
  7. Verdeel de uiteindelijke PBS-oplossing in kleinere glazen flessen (100-250 mL).
  8. Autoclaveer de flessen bij 121 °C, 1,1 kg/cm2 gedurende 15 minuten.
  9. Bewaar PBS-oplossing in de koelkast (2-8 °C).
    OPMERKING 1: Gebruik PBS op 37 °C voor alle experimenten.

3. Bereiding van 4% formaldehydeoplossing

  1. Meng 35,68 mL 1x PBS en 4,32 mL 37% P.A. formaldehyde.
  2. Bewaar de oplossing in een plastic kolf op kamertemperatuur (25 °C).

4. Bereiding van de voorraadoplossing van de actieve moleculen

OPMERKING: Controleer de oplosbaarheid van de moleculen in DMSO, DMF, ethanol of water en kies het meest geschikte oplosmiddel. Om mogelijke toxiciteitseffecten van verdunningsmiddelen op parasieten te minimaliseren, moet de voorraadoplossing minstens 1000 keer geconcentreerder zijn dan de hoogste concentratie van de te testen verbinding. Als bijvoorbeeld de hoogste te testen concentratie 1 μM is, moet de standaardoplossing minstens 1 mM zijn. Om een 10 mM voorraadoplossing voor te bereiden, volg je de onderstaande stappen:

  1. Weeg de te testen verbinding met een analytische weegschaal met een precisie van 0,0001 g.
  2. Bepaal het volume van het verdunningsmiddel dat nodig is om een oplossing van 10 mM te verkrijgen met behulp van de volgende formule:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Waar:
    Y: massa van de verbinding in milligram (mg)
    MM: molaire massa van de verbinding
    V (mL): volume van het oplosmiddel
  3. Voeg het verdunningsmiddel toe aan de houder met de gewogen stof.
  4. Homogeniseer met een vortexmixer.
  5. Verdeel de oplossing in kleine aliquots en bewaar deze in een vriezer bij -20 °C.
  6. Laat de aliquot-oplossing voor gebruik volledig ontdooien en homogeniseer opnieuw met een vortexmixer.
    OPMERKING: Om substockoplossingen met andere concentraties te bereiden, gebruik de volgende formule
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ volume van de voorraadoplossing die nodig is om de nieuwe oplossing te bereiden
    x mM: gewenste concentratie van de nieuwe oplossing.
    y (μL): gewenst volume van de nieuwe oplossing.

5. Celcultuur

  1. Gebruik NHDF-cellen door het flesje voorzichtig te draaien in het 37 °C waterbad.
    OPMERKING: NHDF-cellen kunnen worden vervangen door Human Foreskin Fibroblasts (HFF) of andere cellijnen die een stabiele monolaag vormen. Plaque-assay werkt alleen met cellijnen die een stabiele monolaag vormen, dat wil zeggen cellen waarvan de groei stopt door contact. Cellijnen die geen proliferatieinhibitie vertonen, zoals tumorlijnen, kunnen niet worden gebruikt, omdat de cellen met de parasieten concurreren om voedingsstoffen in het kweekmedium en het plaquegebied aanvullen dat door de parasieten is gevormd.
  2. Onmiddellijk overbrengen van ontdooide cellen naar een 15 mL conische buis met 10 mL aangevuld RPMI-1640 medium (zie stap 1).
  3. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Wanneer de spincyclus voltooid is, moet er een celpellet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
  4. Gooi het supernatant voorzichtig weg om de celpellet te behouden.
  5. Suspensie de celpellet opnieuw met 12 ml aangevuld RPMI-1640 medium met 10% FBS en zaad, drie 25 cm2 kweekflesjes of één 75 cm2 kolf. Na 2-3 dagen wordt de kweekfles(s) onderzocht met een inverted phase contrastmicroscoop om het herstel van de celproliferatie te bepalen (cellen moeten minstens 40%-50% confluentie vertonen).
  6. Wanneer cellen een volledige monolaag bereiken (100% samenvloeiing), verwijder je het medium uit de kolf met een Pasteur-pipet. Gooi het medium en de pipet weg.
  7. Voeg 1-2 ml PBS 1x toe aan het colf, wacht 1 minuut en verwijder de PBS.
  8. Voeg 1 mL 0,05% trypsin-versene oplossing toe aan de kolf en plaats deze in de broedmachine met 5% CO2, luchtvochtigheid en een temperatuur van 37 °C gedurende 2 minuten.
  9. Na 2 minuten observeer je de cellen met de omgekeerde microscoop om te bevestigen dat de cellen losgeraakt zijn.
  10. Stil de losgekoppelde cellen opnieuw op met 24 mL aangevuld RPMI-1640 medium met 10% FBS met een 10 mL serologische pipet en een automatische pipetdispenser.
    OPMERKING: Elke kweekkolf van 25 of 75 cm² met een confluente monolaag kan zich repliceren in respectievelijk 5 of 15 andere kweekflessen van 25 cm².
  11. Na toevoeging van het benodigde volume medium (24 mL), homogeniseer je de celsuspensie met de serologische pipet.
  12. Plaats 4 ml celsuspensie in medium op elke 25cm 2 fles of 12 ml op 75 cm2 kolven. Vergeet niet 4 ml celsuspensatie in de eerste kolf te laten.
  13. Plaats de flessen in een broedmachine met 5%CO-2, luchtvochtigheid en een temperatuur van 37 °C.
  14. Wacht tot een volledige monolaag van cellen is verkregen (100% van de confluentie).
    OPMERKING: Identificeer elke thermosfles met de datum en het doorgangsnummer.

6. Voorbereiding van kweekborden

  1. Controleer de integriteit van de celmonolaag (100% confluentie) in de kweekkolf met behulp van een omgekeerde microscoop.
  2. Volg de trypsinisatieprocedure zoals hierboven beschreven (stappen 5.7-5.9).
  3. Met een 5 mL serologische pipet, suspendeer je de losgekoppelde cellen opnieuw met 4 mL RPMI-medium en breng ze over in een 15 mL conische buis.
  4. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  5. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
  6. Sussie de celpellet opnieuw met 1 mL vers RPMI-1640 medium.
  7. Homogeniseer met een vortexmixer.
  8. Breng 10 μL over in een 1,5 mL buis met 490 μL van een 4% formaldehydeoplossing (1:50 verdunning) met een micropipet met een steriele tip.
    OPMERKING: Verdunningsfactor = (Totaal volume (μL)) / (Monstervolume (μL))
  9. Zet een Neubauer-kamer op.
  10. Homogeniseer de fixatieve oplossing met de parasieten (voorbereid in item 6.8) met behulp van een vortexmixer.
  11. Voeg 10 μL van de oplossing met de vaste parasieten toe aan de Neubauer-kamer.
  12. Tel de vier kwadranten van de Neubauer-kamer, elk bestaande uit 16 vierkanten.
  13. Bepaal het aantal cellen per mL:
    Aantal cellen (per mL) = [(n° cellen per vierkant)/4] x Fd x 104
    Waar:
    Fd (Verdunningsfactor) = 50
  14. Zaad elke put van een kweekplaat met 12 of 6 putten, respectievelijk 5 × 104 of 10 x 105 cellen, die worden opgehangen in 1 of 2 ml RPMI-1640 aangevuld medium met 10% FBS.
  15. Plaats de platen in een broedmachine met 5%CO2, een vochtige atmosfeer en een temperatuur van 37 °C.
  16. Wacht tot de celmonolaag 100% confluentie bereikt.

7. Tachyzoïet in vitro teelt

OPMERKING: Voor de plaque-assay bevelen wij de RH-stam van T. gondii aan.

  1. Verwijder het oude medium uit een 25 cm2-kolf met een volledige monolaag (100% samenvloeiing) van NHDF-cellen met behulp van een Pasteur-pipet. Voeg vervolgens 4 mL vers RPMI-1640 complete medium toe aan de kolf.
  2. Breng 5 μL van een supernatant over met verse ontsnapte tachyzoieten uit een eerdere kolf met een gelyseerde geïnfecteerde kweek. Het volume van 5 μL maakt een lytische cyclus van 6-7 dagen per 25 cm² kolf mogelijk.
  3. Plaats de nieuwe besmette kolf in een broedmachine met 5%CO2, een vochtige atmosfeer en een temperatuur van 37 °C.

8. Kwantificatie van tachyzoïten

  1. Verwijder het medium uit de kweekfles met de nieuw ontsnapte parasieten met een Pasteur-pipet en plaats het in een 15 mL conische buis.
  2. Centrifugeer de buis op 760 x g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Wanneer de centrifugecyclus is voltooid, wordt een zichtbare pellet op de bodem van de buis gezien.
  3. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
  4. Suss de parasietpellet opnieuw met 1 ml vers RPMI-1640 medium met 2% FBS.
  5. Homogeniseer de parasietsuspensie met behulp van een vortexmixer.
  6. Breng 10 μL van de parasietsuspensie over naar een 1,5 mL buis met 490 μL 4% formaldehydeoplossing (1:50 verdunning) met een pipet met een steriele tip.
  7. Volg de stappen beschreven in 6.10 tot 6.12.
  8. Bepaal het aantal tachyzoïeten per 1 mL.
    OPMERKING: Aantal tachyzoïeten (per mL) = [(n° tachyzoïeten van het kwadraat)/4] x Fd x 104
    Waar:
    Fd (Verdunningsfactor) = 50

9. Plaque-assayvoorbereiding voor actieve moleculen uit een chemobibliotheek

OPMERKING: Deze test heeft als doel moleculen te identificeren die de proliferatie van T. gondii met meer dan 50% verminderen bij een concentratie van 1 μM. Voordat deze assay wordt gestart, moet een cytotoxiciteitstest (bijvoorbeeld MTS-methode of MTT-methode) worden uitgevoerd om te waarborgen dat de verbindingconcentraties die in de plaque-assay worden gebruikt niet toxisch zijn voor de gastheercellen.

  1. Bevestig dat celculturen 100% samenvloeiing hebben bereikt in de 12- of 6-wellplaten.
  2. Verwijder het oude medium en voeg 1 of 2 ml vers aangevuld RPMI-1640 medium met 2% FBS toe aan elke put in respectievelijk de 12- en 6-well platen.
  3. Voeg de te testen verbindingen toe aan elke put met de gewenste concentratie. Voor de initiële screening wordt een concentratie van 1 μM aanbevolen.
    OPMERKING: Gebruik de volgende formule om het volume te berekenen dat aan elke put moet worden toegevoegd.
    V (μL) = (Eindconcentratie in de put (μM) x volume binnen put (μL))/(Voorraadoplossing (μM))
  4. Voeg 600 tachyzoïeten (voor de 12-put plaat) of 1.000 tachyzoïeten (voor de 6-put plaat) van de RH-stam toe aan elke plaatput.
    OPMERKING: Variaties in parasietenproliferatie kunnen optreden door verschillen in de leveranciers van kweekmedium of FBS, of door de gebruikte cellijnen. Daarom wordt aanbevolen een pilotexperiment uit te voeren om het optimale aantal parasieten voor elke labtoestand te bepalen. Pas indien nodig de hoeveelheid parasiet aan die voor dit experiment wordt gebruikt.
  5. Plaats de platen in de broedmachine bij 37 °C met 5%CO2 en een vochtige atmosfeer gedurende 7 dagen zonder enige verstoring.
    VOORZICHTIG: De platen mogen tijdens de 7-daagse incubatieperiode niet worden verplaatst of aangeraakt. Als dit gebeurt, zal het experiment mislukt zijn.

10. Plaatkleuring met kristalviolet en beeldverwerving

  1. Na 7 dagen verwijder je het medium uit elke put.
  2. Was elke goed zorgvuldig met 1x PBS op kamertemperatuur.
  3. Gooi de PBS weg en voeg voorzichtig 1 mL 70% alcohol toe aan elke put. Laat het 15 minuten op kamertemperatuur staan en gooi het daarna weg.
  4. Voeg de 0,5% kristallijnse violette wateroplossing toe en laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.
  5. Verwijder de kristalviolette oplossing.
  6. Was elke put zorgvuldig één keer met gedeïoniseerd water.
    VOORZICHTIG: Wanneer je het medium of PBS verwijdert tijdens de wasstappen, raak de bodem van de put niet aan met de punt van de pipet, omdat dit de integriteit van de monolaag kan beschadigen. Tijdens de wasstappen mag je geen straal PBS of alcohol direct op de cellen gooien. Voeg ze grondig toe langs de rand van de put.
  7. Leg de plaat met de afbeelding naar beneden op absorberend papier om het overtollige water af te voeren en laat het 24 uur op kamertemperatuur drogen.
  8. Neem foto's van de platen met een high-definition flatbed scanner28,29 of een beeldvormingsdocumentatiesysteem dat is ingesteld voor de Coomassie blue gel optie 21,22,30.

11. Omkeerbaarheidstest

OPMERKING: Het primaire doel van de reversibiliteitstest met T. gondii tachyzoïeten is te bepalen of het proliferatievermogen van behandelde parasieten volledig wordt afgeschaft of verminderd na verwijdering van de verbindingen uit kweekmedium31.

  1. Zaad een 6-wellplate met NHDFcells zoals beschreven in stap 6. Voeg voor elke put 1 x 105 cellen toe die worden geresuspendeerd in 2 mL aangevuld RPMI-1640 met 10% FBS.
    OPMERKING: Zodra de celmonolaag 100% samenvloeiing in elke put bereikt, is de plaat klaar voor de plaque-assay.
  2. Gooi het medium weg en voeg 1 x 10 x4 tachyzoïeten toe die opnieuw gesuspendeerd zijn in 2 mL vers medium met 2% FBS in elk putje.
  3. Nadat de tachyzoieten 1 uur met de NHDF-cellen hebben geïnacteerd, voeg je de geselecteerde verbindingen toe bij een uiteindelijke concentratie dicht bij de 90% remmende concentratie (IC90). Een put die alleen het medicijnverdunner bevat, wordt als positieve controle gebruikt.
  4. Behandel de tachyzoieten 4 dagen in een broedmachine bij 37 °C met 5%CO2 en een vochtige omgeving.
  5. Na de 4-daagse behandelingsperiode was je het bord drie keer met 1x PBS op 37 °C om de verbindingen volledig te verwijderen.
  6. Voeg aan elke put 2 ml vers medium zonder verbindingen toe en houd de plaat nog eens 7 dagen in de broedmachine.
  7. Beits de plaat met kristalviolette kleurstof en fotografeer deze zoals beschreven in stap 10.

12. Beeldanalyse met behulp van ImageJ-software

  1. Open de afbeeldingen met de ImageJ-software32.
  2. Selecteer het gebied dat overeenkomt met één put met behulp van het ovale selectiegereedschap (Figuur 1A,B).
    OPMERKING: Negeer bij het maken van de selectie gebieden aan de grenzen van de put die defecten vertonen. Deze zijn vaak aanwezig aan de randen van de put.
  3. Kopieer en maak een nieuw beeld: kopieer het geselecteerde gebied door op Ctrl + C te drukken; maak een nieuw afbeeldingsbestand aan door op Ctrl + N te drukken; plak de gekopieerde afbeelding in het nieuwe zwarte venster met Ctrl + V.
    OPMERKING: Gebruik bij het maken van de nieuwe afbeelding de standaardinstellingen: 8-bit, invullen met zwart, 512 x 512 pixels en één snee (Figuur 1C).
  4. Navigeer naar: Afbeelding > Pas > drempel aan, of druk op Ctrl + Shift + T (Figuur 1D).
  5. Selecteer in het Drempelvenster de Huang - en Rode opties en klik vervolgens op Auto (Figuur 1E).
  6. Klik op Analyseren en selecteer vervolgens Deeltjes Analyseren (Figuur 1F). Houd de standaardopties in het venster dat verschijnt en klik op OK (Figuur 1G).
  7. Er zal een nieuw raam opengaan. Kopieer de waarde die in %Oppervlakte wordt weergegeven (gemarkeerd door een rode rechthoek in Figuur 1H) om het percentage parasietenproliferatie of -remming te berekenen.
  8. Herhaal deze stappen voor elke put op de plaat.
  9. Om het proliferatiepercentage te berekenen, gebruik de volgende formule:
    % proliferatie = (%Gebied goed behandeld/%Gebied goed gecontroleerd) × 100
  10. Om het remmingspercentage te berekenen, gebruik je de volgende formule:
    % inhibitie = [1- (%Gebied goed behandeld/%Gebied beheerst goed)] × 100

Figuur 1
Figuur 1: Stapsgewijze analyse van de resultaten in de ImageJ-software. (A) "Oval" toolselectie. (B) Selectie van het interessegebied in de afbeelding. (C) Nieuw afbeeldingsvenster (Ctrl + N) met aanbevolen instellingen. (D) Stappen voor "Drempelanalyse na het plakken van het interessegebied in het nieuwe afbeeldingsvenster. (E) Huang en rode opties selecteren in het Drempelvenster, waardoor alle witte gebieden met rood worden ingevuld met rood. (F) Volgorde van de stappen die worden gebruikt voor de "Deeltjes analyseren". (G) De setting die wordt gebruikt voor het analyseren van de deeltjes. (H) Het resultaat van het percentage van het totale vernietigde gebied wordt weergegeven in het overzichtsvenster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

13. Statistische analytische sis

  1. Organiseer de gegevens in een Excel-spreadsheet binnen de Office-software nadat het percentage proliferatie-inhibitie is berekend.
  2. Open de GraphPad Prism 5.0-software en klik op XY (Onder Nieuwe Tabel & Grafiek).
  3. In de Y-sectie (onder de "X:foutbalk") voer je het aantal dataherhalingen in (meestal drie biologische replicaties). Dit aantal kan variëren afhankelijk van het aantal herhaaldingen.
  4. Selecteer alleen Gemiddelde naast de grafiek en KIES NIET "Voer foutwaarden in en plot foutwaarden die elders al zijn berekend", klik dan op Aanmaken.
  5. Plaats de concentratiegegevens op de X-as en de proliferatie-inhibitiepercentagegegevens in kolommen A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Klik op = Analyseren en vervolgens op Transformeren, en dan OK. Er zal een nieuw raam opengaan. Klik in dit nieuwe venster op Transformeer X-waarden met X = Log(X), klik vervolgens op Maak een nieuwe grafiek van de resultaten, en vervolgens OK.
  7. Klik op = Analyseren en vervolgens op Normaliseren. Er zal een nieuw raam opengaan. Klik in de sectie Hoe wordt 0% gedefinieerd?, klik en stel Y = 0,0 in. In de sectie Hoe wordt 100% gedefinieerd?, klik en stel Y = 100 in; selecteer Percentages en klik op Maak een nieuwe grafiek van de resultaten aan.
  8. Klik op het symbool: Fit een kromme met niet-lineaire regressie hierboven = Analyse. Klik op Dosis-respons - Remming, vervolgens op log (remmer) versus genormaliseerde respons - Variabele helling, en klik dan op OK.
    OPMERKING: Er opent een venster met de volgende resultaten: de IC50 (Remmende Concentratie van 50%), het 95% betrouwbaarheidsinterval en de R2-waarde. Deze waarden zijn cruciaal en moeten worden opgenomen in een resultaattabel binnen het artikel.
  9. Om andere remmende concentraties te schatten, zoals IC25, IC90 of IC95, gebruik je de link (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: effectieve concentratie. Rapporteer de IC50 en de HillSlope die door de Prism-software zijn verkregen voor elk getest medicijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het evalueren van de plaque-assay na behandeling zijn zowel de positieve (cellen geïnfecteerd met tachyzoïeten en onbehandeld) als de negatieve (niet-geïnfecteerde cellen met 0,1% DMSO) controles cruciaal. Aan het einde van het experiment zou de positieve controleput goed gedefinieerde lege ruimtes moeten vertonen met resten van vastgehechte cellen (Figuur 2). Daarentegen zou de negatieve controleput een intacte monolaag moeten tonen zonder lege ruimtes. De negatieve controle is cruciaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De standaardisatie van nieuwe protocollen voor antiproliferatieve tests is een fundamentele stap om wetenschappelijk onderzoek naar de identificatie van toekomstige geneesmiddelen te bevorderen. Het hier gepresenteerde protocol biedt een alternatieve benadering voor het in vitro beoordelen van de activiteit van bioactieve moleculen tegen tachyzoïeten van T. gondii. Aangezien T. gondii een obligaat intracellulair parasiet is dat zich voortbeweegt door glijdende ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs danken ook de financiering van de Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) en CAPES/PROEX. De auteurs willen Pró-Reitoria de Pesquisa van de Universidade Federal de Minas Gerais bedanken voor hun ondersteuning van dit onderzoek. ESMD (CNPq 308082/2023-0) en RWAV (CNPq 305574/2021-3) zijn CNPq productiviteitsfellows.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05 % Trypsin-EDTALife Technologies25300-062
10 mL serologische pipetOlenK17-110
15mL falcon tube centrifugeFanemModel: 206
5 mL serologische pipetOlenK17-115
6-well kweekplaatSarstedt833920
Analytische weegschaalMettler Toledo Model: AB204 Serienummer: 1116473813
Antibioticum-Antimyoticum (100X)Life Technologies15240-062
Automatische pipetKasviK1-AID
CentrifugeEppendorfModel 5415 R Serienummer: 0023591
CO2 IncubatorPHC CorporationModel No: MCO-230AICUVL-PA Serienummer: 210360090
Kweekfles 25 cm2Sarstedt833910
Dimethylsulfoxide (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Fetaal bovien serum (FBS)Life Technologies12657-029
Formaldehyde 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad Software-Versie 8.0.1
ImageJ  software --Versie 1.52e
BeelddocumentatiesystemenBio-RadModel:  ChemiDoc MP Imaging System Serienummer: 734BR2249
Laminaire stromingshaakVeco do BrasilModel: VLFS-09
L-glutamine 200 mM (100X)Life Technologies25030-081
Microbuisje 0.5 mLSarstedt72.699
Neonatal Normal Human Dermal Fibroblast (NHDF)LonzaCC-3132Vriendelijk verstrekt door Dr. Sheila Nardelli, van Fiocruz Paraná, Brazilië
Neubauer kamer 0.100 mm 0.0025 mm2New Optics7301-1
pH-meterMicronalModel: B374 Serienummer: 30/37
Pipet 20-200 µLKasvi basic22032893
Pipet 2-20 µLLabmate Pro656630226
Pipet  0.2-2 µLLabmate Pro556610114
Pipet  1000-5.000 µLUniscienceYM4A021482
Pipet  100-1000 µLEppendorf Research plusQ34354C
Kaliumfosfaatmonobasis  (KH2PO4) P.A Synth01F2002.01.AF
RPMI-1640 mediumSigma-Aldrich R0883
Natriumchloride (NaCl) P.A. Cromoline Química Fina -
Natriumfosfaatdibasis (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
Tip 1.000 µLSarstedt7.01.186
Tip 10 µLSarstedt7.03.010
Tip 5.000 µLSarstedt70.11.83.001
Tip  200 µLSarstedt7.03.030
Transferpipet  (3.5 mL) Sarstedt86.11.71.001
Buis 15 mLSarstedt6.25.54.502
Violet CrystalMerck101408
VortexmixerPhoenixModel: AP56 Serienummer: 6633
WaterbadHemoquimica do BrasilModel: HM1003 Serienummer: 700001556

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antiproliferatieve screeningintracellulaire parasiettachyzo et assaydrug screeningcellaagparasietproliferatiein vitro protocol

Gerelateerde artikelen