Methodenartikel

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

DOI:

10.3791/69732

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De morfologie van het mitochondriale netwerk wordt veel gebruikt als indicator voor de gezondheid van cellulaire vormen; Het kwantificeren van mitochondriale architectuur binnen intact weefsel blijft echter technisch uitdagend. Terminale Schwann-cellen (tSC's), die essentieel zijn voor het onderhoud en de regeneratie van neuromusculaire junctions, zijn bijzonder moeilijk in situ te analyseren vanwege hun anatomische locatie en gevoeligheid voor weefselverstoring. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare benadering voor het labelen en kwantificeren van de morfologie van het driedimensionale mitochondriale netwerk in hele skeletspieren en in tSC's bij muizen met behulp van standaard confocale microscopie. De methode maakt gebruik van in vivo toediening van een membraanpotentieel-gevoelige mitochondriale kleurstof, gevolgd door snelle weefselverwerking en hoogresolutie confocale beeldvorming. Beeldstacks worden geanalyseerd om mitochondriale netwerkconnectiviteit, oppervlakte en fragmentatie te kwantificeren. Het protocol wordt eerst gevalideerd in dystrofe en gezonde skeletspieren om verwachte verschillen in mitochondriale morfologie te bevestigen en wordt vervolgens aangepast om mitochondriale netwerken te visualiseren en te kwantificeren in tSC's die zijn geïdentificeerd met S100β-rapportagemuizen. Deze aanpak maakt de analyse van mitochondriale morfologie in intact neuromusculair weefsel mogelijk zonder dat transgene mitochondriale reporters of gespecialiseerde beeldvormingsplatforms nodig zijn. Het protocol vereist alleen apparatuur die algemeen beschikbaar is in de kernfaciliteiten van de universiteit en kan worden aangepast aan andere dunne of oppervlakkig toegankelijke weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn opmerkelijk plastische organellen die fungeren als de longen van de cel, en zuurstof opnemen tijdens cellulaire ademhaling om de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) te ondersteunen als reactie op de metabole vraag1. Hoewel men vroeger werd gezien als afzonderlijke organellen, is het nu bekend dat mitochondriën sterk geïntegreerdzijn 2,3,4, die een energiesubstraat delen binnen hun netwerk in overeenstemming met lokale behoeften. Integratie biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van isolatie: verbonden mitochondriën ondersteunen energietekorten, waardoor elektrochemische gradiënten behouden blijven voor oxidatieve fosforylering tijdens verhoogde metabole vraag. Inderdaad, de verdeling, het volume en de morfologie van mitochondriën passen bij de energiebehoefte in hun omgeving5. In de gezondheidszorg wordt de regelmatige omzet van mitochondriale netwerken gehandhaafd via mitochondriale biogenese, fusie- en splijtingsgebeurtenissen, en mitofagie 2,3. Mitochondriale biogenese is nodig om gezonde mitochondriën te behouden en uit te breiden. De metabole vraag, zoals lichamelijke inspanning, verhoogt de expressie van de door peroxisoomproliferatoren geactiveerde receptor γ co-activator 1α (PGC-1α)5. Dit proces vindt plaats via primaire uithoudingssignalen, specifiek de door inspanning veroorzaakte verhoging van AMP-geactiveerde protenekinase (AMPK), calcium en reactieve zuurstofsoorten 6,7. Fusie breidt netwerken uit, bevordert overlevingskansen en vult tekorten aan, terwijl splijting verdere mitochondriale schade beperkt door het uitsluiten van disfunctionele regio 2,3,8. Na verwijdering moeten uitgesloten gebieden mitofage ondergaan, waardoor de ophoping van disfunctionele organellen en eiwittenwordt voorkomen 6,9.

Skeletspieren vormen ongeveer 40% van de lichaamsmassa en zijn afhankelijk van mitochondriën voor aerobe stofwisseling en cellulaire signalering om homeostasete behouden. Gezamenlijk zijn bij aandoeningen van skeletspierdysfunctie de mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen aangetast10. Onderzoeken naar spierdysfunctie meten doorgaans mitochondriale ademhaling, volume, morfologie en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) om mitochondriale kwaliteitte beoordelen 3,10. In dat opzicht is tijdens langdurige spierdisfunctie de mitochondriale ademhaling verminderd, terwijl de ROS verhoogd is en netwerken 3,10 gefragmenteerd zijn. Verstoringen in mitochondriale morfologie ontstaan grotendeels door activatie van mitochondriale splijtingseiwitten, dynamin-related protein 1 (DRP1) en mitochondriale splijting 1 (FIS1)2,8,11. Als reactie op spieratrofie rekruteert FIS1, dat zich bevindt op het oppervlak van het buitenste mitochondriale membraan, DRP1 om te oligomeriseren met meerdere DRP1-dimeren om een filament rond de mitochondriën te creëren, waarbij het in grootte afneemt totdat een bepaald deel van de mitochondriën wordt "afgeknepen", wat fragmentatiebevordert 3,11. Samen zijn overactiviteit van mitochondriale splijting, vermindering van fusie van nieuw gevormde mitochondriën en disfunctionele mitofagie verantwoordelijk voor het gefragmenteerde uiterlijk van disfunctionele mitochondriale netwerken, zoals beschreven in inactieve of zieke spieren 2,12.

De neuromusculaire overgang (NMJ) is de plaats van spierexcitatie. Actiepotentialen die in de soma worden geïnitieerd planten zich voort langs axonen, omhuld door myeliniserende Schwann-cellen (SC's), en eindigen bij NMJ's, die zijn ingekapseld door terminale Schwann-cellen (tSC). NMJ's kunnen herstellen na een blessure. De kans en snelheid van regeneratie nemen echter af naarmate de afstand tussen de plaats van de verwonding en de NMJ met13,14 toeneemt. Na zenuwbeschadiging door doorsnijding, verplettering of rek dedifferentiëren SC's naar een gedemyeliniseerde voorloperachtige toestand 15,16. Demyeliniseerde SC's vermenigvuldigen zich en werken samen met macrofagen om het lokale milieu te herstructureren voor regeneratie door puin tussen de plaats van de beschadiging en de proximale axonstronk te verwijderen via Wallerian-degeneratie17,18. Migrerende SC's signaleren een ontstekingsreactie die de omgeving hervormt voor succesvolle zenuwregeneratie18. Zenuwregeneratie vindt plaats in de neurale laag gevormd door de voorloperachtige SC's, die banden van Bunger vormen, waardoor de axonen19 hergroeien. De axonstronk strekt vervolgens de filopodien uit om renervatie14 te initiëren. Na renervatie kan de presynaps volledig regenereren, mits tSC's opnieuw investeren bij de NMJ20.

De mitochondriale morfologie varieert sterk tussen celtypen en past bij de weefselfunctie21. Rapporten van leverweefsels suggereren dat mitochondriën compacter en bolvormiger zijn, terwijl die in de witte stof in de hersenen langwerpiger en buisvormig22 zijn. Bij uitdaging, zoals bij veroudering en oxidatieve stress, vertonen mitochondriën in deze weefsels een donutachtig fenotype. Bij osteoblasten werden mitochondriale donutvorming en fragmentatie echter in verband gebracht met verhoogde secretie van mitochondriën en mitochondriale afgeleide vesikels, en met osteoblastrijping23. Hoewel skeletspiermitochondriale netwerken uitgebreid zijn onderzocht bij meerdere soorten, blijven er beperkingen bestaan in het beeldvormgeven van mitochondriale netwerken van tSC's van het perifere zenuwstelsel. Deze zijn moeilijk vast te leggen in hun natuurlijke omgeving, omdat de celstructuur na isolatie aanzienlijk verandert en deze weefsels moeilijk met kleurstof in vivo te targeten zijn zonder ook de bijbehorende skeletspieren te belasten.

Beeldvormingstechnieken die worden gebruikt om mitochondriale morfologie vast te leggen in levende systemen kunnen worden gecategoriseerd als licht- of elektronenmicroscopie5. Met traditionele lichtvangstmicroscopie kunnen kleurstoffen levende cellen labelen, gefixeerde cellen immunolabelen en kunnen mitochondriën genetisch worden gelabeld 5,24. Levendcelbeeldvorming vereist doorgaans het incuberen van cellen gedurende 20–60 minuten voorafgaand aan fluorescentieanalyse. Kleurstoffen worden via membraanpotentiaal naar mitochondriën geleid en kunnen daarom worden veranderd onder omstandigheden van veranderd membraanpotentiaal5. Het vastleggen van mitochondriale morfologie van tSC's binnen skeletspieren via kleurstoflading is theoretisch mogelijk; het zou echter beeldvorming van hele weefsels en gedetailleerde labeltechnieken vereisen. In het bijzonder vangt het mitochondriën binnen intacte structuren, zonder interferentie door skeletspierlabeling. Om deze beperkingen te overwinnen, werd de mitochondriale fluorescerende kleuring gebruikt om levende skeletspieren bij gezonde en dystrofe muizen te labelen, gevolgd door het labelen van tSC-mitochondriën voor in vivo en in situ beeldvorming. De tibialis anterior (TA) spier werd geselecteerd om de skeletspierbeeldvorming te optimaliseren vanwege de oppervlakkige anatomische locatie, het goed gekarakteriseerde injectievolume en myofasciale dispersie 25,26,27, en de geschiktheid voor gelijktijdige functionele metingen. De gluteus maximus (GM) spier werd geselecteerd voor tSC-beeldvorming op basis van de gevestigde injectieprocedure28,29, de dunne architectuur die achtergrondfluorescentie minimaliseert, en de oppervlakkige ventrale positionering van neuromusculaire verbindingen tussen de GM en gluteus medius, waardoor voorkeursetikettering van tSC's vóór skeletspiervezels mogelijk is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zes maanden oude (n=3) volwassen mannelijke DBA/2J [Wild-type (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) en D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), terwijl drie tot vijf maanden oud (n=8) volwassen mannetje en vrouwtje B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [ook gecombineerd met WT omdat er geen verschillen zijn met DBA] werden gebruikt uit een voortdurende kolonie van door onderzoekers onderhouden muizen. De algehele experimentele workflow voor TA- en GM-injecties, weefselverwerking en beeldvorming wordt samengevat in Figuur 1. Een extra D2. mdx mouse werd door onderzoekers gedoneerd voor tSC-beeldvorming in MDX (n=1). Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Texas A&M University (AUP 2022-0215) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e editie)30. Eutanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie onder een anesthesie-overdosis isoflurane.

1. Bereiding van een fluorescerende mitochondriale kleuringswerkoplossing van 2 μM

  1. Suspendeer de mitochondriale kleuring (50 μg) in 322 μL dimethylsulfoxide (DMSO) volgens de instructies van de fabrikant om een 200 μM voorraadoplossing te bereiden.
  2. Om 30 mL werkoplossing van 2 μM te bereiden, breng je 300 μL 200 μM voorraadoplossing over in 29,7 mL steriele zoutoplossing. Meng grondig.
  3. Aliquot 250 μL van de 2 μM werkoplossing in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Er werd geen detecteerbare signaaldegradatie waargenomen na 3 jaar opslag bij -80 °C.

2. Kleurstof en dierlijke voorbereiding

  1. Ontdooi één bevroren aliquot 15 minuten voor de experimenten. Trek de oplossing in een 30 G, 1 cc insulinespuit.
  2. Doof het dier met isoflurane. Breng oogzalf aan, scheer de injectieplaats en houd de lichaamstemperatuur vast met een verwarmingslamp met een temperatuursonde tussen het dier en de warmtebron.
  3. Maak de afgeschaafde injectieplaats schoon met 70% isopropylalcohol.

3. Toediening en functie van mitochondriale kleurstof in de spier Tibialis anterior (TA)

  1. TA-kleurstoftoediening
    1. Injecteer 50 μL 2 μM mitochondriale kleuring in de rechter TA-spier van verdoofde WT- en D2.mdx-muizen.
    2. Steek de naald in de distale pees richting de knie en druk de zuiger in terwijl je de naald langs het injectiepad terugtrekt.
    3. Incubeer de kleurstof in vivo gedurende 1 uur vóór de dissectie.
  2. TA-spierfunctiemetingen
    1. Na 45 minuten kleurstofincubatie verdoof je de muis met isoflurane (2%–3% inductie, 1,5%–2% onderhoud van zuurstof).
    2. Stel de linker TA-spier chirurgisch bloot terwijl je het omliggende weefsel behoudt. Bind de distale pees aan de belastingsbalk van het spiertestsysteem.
    3. Wikkel de blootgestelde spier in met een laboratoriumdoekje en spoel het bij 3 mL min⁻1 met 0,9% steriel zoutoplossing verwarmd tot 40 °C. Houd de spiertemperatuur op 32 °C met behulp van een warmtelamp.
    4. Plaats platina/iridiumdraadelektroden over de spierbuik voor directe stimulatie.
    5. Bevestig de belastingstraal aan een micrometer en stel de optimale lengte (L0) aan met twitch contracties (Tw) op 1 Hz. Neem L0 op met een digitale remklauw.
    6. Induceer maximale tetanische contracties (P0) drie keer bij 140 Hz met 60 s rust tussen de contracties. Noteer de hoogste krachtwaarde (g). Verzamel gegevens met behulp van het spiersysteem met analysesoftware.
  3. TA-weefselverwerking
    1. Na de incubatie isoleer en dissectie de TA-spier vóór de euthanasie.
    2. Plaats geïsoleerde spiervezelbundels in 4% paraformaldehyde op kamertemperatuur gedurende 15 minuten terwijl je de vezels voorzichtig onder een stereomicroscoop plaagt.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en moet worden gebruikt met een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, handschoenen en oogbescherming).
    3. Voeg celpermete nucleïnezuurkleuring toe aan een uiteindelijke concentratie van 5–10 μg/mL om de kernen te labelen.
    4. Was monsters drie keer in fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) gedurende elk 5 minuten om overtollige kleurstof te verwijderen.
    5. Dehydrateer monsters achtereenvolgens in 50%, 75% en 100% ethanol gedurende 5 minuten elk.
    6. Incubeer monsters sequentieel in weefselreinigingsoplossingen I en II gedurende elk 30 minuten bij kamertemperatuur, met voldoende volume om het weefsel volledig onder te dompelen.
    7. Plaats de vrijgemaakte TA-bundels op een deklaag en plat voorzichtig met een glazen blok (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g)26.

4. Beeldvorming van TA-spiermonsters

  1. Beeldspiermonsters met een confocale microscoop om hoogresolutie driedimensionale (3D) optische doorsneden te verkrijgen.
  2. Neem Z-stackbeelden op een diepte van ongeveer 100 μm voor spieren met een 63x vergrotingsobjectief (N.A. 1.40).
  3. Gebruik de confocale software van het beeldvormingssysteem met een excitatiegolflengte van 646 nm om de grootste helderheid met zo min mogelijk achtergrond te bieden.
  4. Verslaat afbeeldingen met deconvolutiemodus, waarbij "System Optimized" parameters met stapgroottes van 1 μm worden gebruikt.
    OPMERKING: Om uitdroging en fotobleaching tegen te gaan, plaats je de weefsels in weefselreinigingsoplossing II en plaats je ze op een dekmantel. Breng twee druppels zuiveringsoplossing 2 direct op het weefsel voordat je beeldvorming neemt.

5. GM spier tSC kleurstof laden en beeldvorming

  1. Gebruik S100β-muizen voor specifieke fluorescerende identificatie van tSC's.
  2. Maak een kleine incisie boven de GM-spier. Injecteer 75 μL van een 2 μM verrood fluorescerende mitochondriale kleuring onder de GM, vóór wondsluiting25.
  3. Sluit de wond en laat de kleurstof 45 minuten incuberen om selectief tSC's te labelen zonder significante etikettering van de onderliggende spiervezels.
  4. Dissectieer de GM-spieren en plaats ze direct in gekoelde 0,9% steriele zoutoplossing. Snijd snel overtollig vet en bindweefsel weg.
  5. Zet de ontleedde GMs over op een coverslip voor beeldvorming.
  6. Alleen bij gebruik van D2.mdx-muizen voeg fluorescerende acetylcholinereceptor (AChR) kleurstof met een verdunning van 1:500 toe aan het microdissectiebad. Incubeer het weefsel gedurende 30 minuten om de postsynaptische componenten van de neuromusculaire verbinding (NMJ) te visualiseren.
  7. Gebruik deze dual-labeling benadering om postsynaptische mitochondriën te onderscheiden van tSC-specifieke mitochondriën.
    VOORZICHTIG: Beperk de dissectie en reiniging van de GM tot maximaal 10 minuten voordat je het op een dekmantel plaatst voor beeldvorming, om morfologische veranderingen na de dissectie te minimaliseren. Deze tijdslimiet is cruciaal om morfologische veranderingen na dissectie en mitochondriale degradatie te minimaliseren.
  8. Voer confocale microscopie uit om hoogresolutie driedimensionale (3D) optische doorsneden te verkrijgen.
  9. Haal Z-stackbeelden op een diepte van ongeveer 16 μm voor tSC's met een 20x vergrotingsobjectief (N.A. 0,75). Maak representatieve beelden met hoge resolutie van individuele tSC's met een 63x vergroting objectieflens.
  10. Voer montageprocedures uit om weefseluitdroging en fotobleaching tijdens de beeldvorming te minimaliseren.
    VOORZICHTIG: Breng weefsels in zoutoplossing over op een dekmantel, waarbij de buikzijde naar beneden gericht is voor omgekeerde microscopie.
  11. Breng 2 μL algemeen montagemedium aan op het dorsale oppervlak van de GM.
  12. Plat het weefsel voorzichtig met een gekalibreerd glasblok (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g) om een uniform beeldvlak te garanderen.

6. Gefocuste ionenbundelmicroscopie

  1. Voer gerichte ionenbundel-scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) uit volgens eerder vastgestelde protocollen26.
    1. Pas FIB-SEM specifiek toe om nieuwe morfologische kenmerken te bevestigen en te visualiseren die tijdens confocale beeldvorming zijn geïdentificeerd.

7. Beeldanalyse

  1. TA-spiermonsters
    1. Voer kwantitatieve analyses uit van confocale optische secties (1 μm) van TA-scans (ongeveer 75–112 μm dik) met behulp van AI-gestuurde beeldanalysesoftware.
      OPMERKING: Voer meerdere begeleide trainingssessies uit voorafgaand aan geautomatiseerde segmentatie om de aanpassing van het algoritme te verbeteren.
    2. Importeer enkele optische secties (Z-slices) om de software te leren gepixelde informatie te behouden die witte mitochondriale kleurstof vertegenwoordigt, terwijl de zwarte achtergrond wordt weggelaten.
    3. Ontwikkel beeldmaskers voor onderzoekers om hoogwaardige analyse en nauwkeurigheid te waarborgen.
    4. Splits 3D-beeldstapels in enkele optische secties volgens algoritmeoptimalisatie.
    5. Selecteer elke vijfde Z-snee uit elke 3D-afbeelding voor analyse, waarbij elk datapunt het gemiddelde van deze afzonderlijke secties per monster weergeeft.
    6. Kwantificeer mitochondriale morfologie om ruimtelijke verdeling en netwerkconnectiviteitsmetrieken af te leiden.
    7. Standaardiseer intensiteitsdrempels, randdetectie-instellingen en kalibratie van voxelgrootte over alle monsters om experimentele variabiliteit te minimaliseren.
  2. tSC's op GM-samples
    1. Assembleer 1 μm optische secties in Z-stacks (ongeveer 6–25 μm dik) en scheid beelden in individuele kleurkanalen met behulp van 2D-beeldanalysesoftware.
    2. Kalibreer software met schaalbalken en pas drempel toe om de visualisatie van tSC-mitochondriën te optimaliseren met minimale achtergrondinterferentie.
    3. Voer binarisatie uit en verwijder achtergrondruis om tSC-mitochondriën of tSC's te isoleren voor het meten van oppervlakte- en deeltjestellingen.
    4. Bewaar binaire beelden om consistente verwerking te garanderen en voer alle beeldvormingsexperimenten uit onder identieke omstandigheden om reproduceerbaarheid te garanderen over biologische replicata.

8. Immunohistochemie

  1. Ingebedde linker TA-spiermonsters in de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding om de dwarsdoorsnede (CSA) te evalueren.
    1. Snijd monsters van 10 μm dikte met een cryostaat ingesteld op -17°C en verzamel op microscoopglaas.
    2. Kleurt spierdoorsneden voor laminine om myovezelgrenzen te identificeren met behulp van konijn antilaminine primaire antilichamen (1:400) en geitenantikonijn Rhodamine secundaire antilichaam (1:400).
    3. Monter slides met een geschikt montagemedium vóór het beeldvormen.
  2. Beeldslides met een confocale microscoop door willekeurig 2–3 interessegebieden (580 x 580 μm) per monster te selecteren met een 20x (N.A. 0,75) objectief.
  3. Gemiddelde waarden over regio's per spier en analyse van ongeveer 400 myovezels per TA-spiergedeelte.
  4. Gebruik semi-automatische spiersegmentatiesoftware om CSA (μm2) te bepalen door de myovezels te maskeren.

9. Statistische analyse

  1. Rapporteer samenvattende gegevens als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.).
  2. Voer statistische analyses uit met een speciale statistische software, waarbij parametrische, niet-gepaarde Student's t-tests worden gebruikt om significantie tussen groepsgemiddelde verschillen te bepalen.
  3. Voer eenvoudige lineaire regressies uit op CSA en spierkracht van TA-spieren, waarbij deze worden gebruikt als markers van DMD-pathologie om mitochondriale morfologie te vergelijken met TA-spier en GM tSC's.
  4. Beoordeel Pearson r correlatiecoëfficiënten om de correlatie tussen DMD-pathologie en mitochondriale pathologie te bepalen. Definieer statistische significantie als P ≤ 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale netwerken vertoonden verwachte verminderingen in connectiviteit
Vertegenwoordigende 3D-fluorescerende beelden van TA-spierconfocale scans in twee groepen, WT en MDX, worden gepresenteerd (Figuur 2). In vergelijking met de WT-groep lijkt de mitochondriale connectiviteit bij MDX-muizen verminderd te zijn vergeleken met de WT (Figuur 2A–D). Grotere aantallen kleine mitochondriale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De locatie van mitochondriën binnen cellulaire structuren, evenals hun morfologie, correleert met mitochondriale gezondheid en metabole vraag21. Gezien de klinische relevantie van mitochondriale gezondheid, in combinatie met uiteenlopende ademhalingskinetiek en morfologieën van verschillende celtypen, werd een gemakkelijk toepasbare, confocale microscopiemethode ontwikkeld voor de evaluatie van mitochondriale morfologieën in tSC's na de eerste evaluatie van de met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Drs. Mariappan Muthuchamy, Mendell Rimer en Peter Nghiem voor het gul leveren van de D2.mdx-muizen die worden gebruikt om tSC-mitochondriën te evalueren. Dit werk werd ondersteund door de Sydney and J.L. Huffines Institute for Sports Medicine and Human Performance Student Research Grant en door fondsen van het College of Education and Human Development van Texas A&M University. A.B.M. werd ook ondersteund door de NIH LRP (NIAMS, 2L40AR077899-02A3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-in-1 Whole Animal SystemAurora Scientific, Ontario, Canada1300ASpierfunctiesysteem met analysesoftware
AIVIA Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA15AI-gestuurde beeldanalysesoftware
anti-laminin MilliporeSigmaL9393-.2mLMyofiber boarder label
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J MuisstamJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:005621S100β
Cryostar NX50 CryostatEpredia, Kalamazoo, MI, USAhttps://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J MuisstamJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:13141D2.mdx
DBA/2J MuisstamJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:00671WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USABP231-100Mitochondrial stain reconstitution reagent
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Cell-permeant nucleic acid stain
ImageJ/Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD, USASCR_0022852D analysesoftware
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent met DAPI Fisher Scientific, Hampton, NJ, USAP36941Mounting medium
KimWipeKimberly-Clark, Irving, TX, USA06-666ALaboratoriumdoekjes
Leica LAS_X software Leica Biosystems, Wetzlar, GermanySCR_013673Confocal software
MitoView Fix 640Biotium70075-50ugVerrerode fluorescerende mitochondriale vlek
NIS-Elements Advanced Research software Nikon, Melville, NY, USASCR_014329Dwarsdoorsnedeanalysesoftware
Permount Mounting Medium Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA#SP15-100Algemeen montagemedium
Prism 9 software GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798Statistische analysesoftware
Rhodamine (TRITC)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USAAP132RMISecundaire antilichaam
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope en bijbehorende deconvolutiesoftwareLeica Microsystems, Wetzlar, Germany158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		Confocal microscope
SZ61Olympus, Breinigsville, PA, USAsz61Stereomicroscoop
Tissue-Plus O.C.T. Compound Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA23-730-571Compound voor optimale snijtemperatuur
Visikol ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1-30Weefselhelderende oplossing 1
Visikol IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH2-30Weefselhelderende oplossing 2
α-bungarotoxine 552Biotrend, Koln, Germany00014Acetylcholine receptor kleurstof
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction. Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).
  3. Hyatt, H. W., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity. Antioxidants. 10 (4), 588(2021).
  4. Katti, P., et al. Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles. Nat Commun. 13, 6058(2022).
  5. Glancy, B. Visualizing mitochondrial form and function within the cell. Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).
  6. Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).
  7. Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences. Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).
  8. Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects. Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).
  9. Drake, J. C., Yan, Z. Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing. J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).
  10. Chen, X., et al. Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy. J Transl Med. 21 (1), 503(2023).
  11. Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle. Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).
  12. Silva, K. A. S., et al. Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).
  13. Cattin, A. L., et al. Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  14. Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization. Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).
  15. Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. The molecular interplay between axon degeneration and regeneration. Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).
  16. Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration. Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).
  17. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).
  18. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  19. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  20. Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice. Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).
  21. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Front Physiol. 11, 541040(2020).
  22. Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter. J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).
  23. Suh, J., et al. Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis. Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).
  24. Laker, R. C., et al. A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo. J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).
  25. Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).
  26. Hammers, D. W., et al. The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy. Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).
  27. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).
  28. Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle. PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).
  29. Rosen, H. G., et al. Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy. bioRxiv. , (2024).
  30. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  31. Ino, D., Iino, M. Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons. Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).
  32. Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders. Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).
  33. Schröder, J. M., Sommer, C. Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature. Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).
  34. Schröder, J. M. Neuropathy associated with mitochondrial disorders. Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).
  35. Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction. J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).
  36. Morton, A. B., et al. Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice. J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).
  37. Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels. Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).
  38. Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).
  39. Ferramosca, A., Zara, V. Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

Gerelateerde artikelen