Methodenartikel

Een preklinisch model van synovitis met ex vivo menselijk synoviaal weefsel met behouden functie en architectuur

333 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69734

⸱

20 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

We ontwikkelden een menselijk ex vivo transwell-systeem dat in staat is acute ontstekings-, infectieuze en structurele veranderingen in het synovium te evalueren.

Samenvatting

Artritis is een ontstekingstoestand in gewrichten die leidt tot kraakbeenschade, pijn en verlies van mobiliteit. Recente vooruitgang in artritisonderzoek toont specifiek aan dat de gewrichtscapsule (bijv. synovium) een belangrijke bron van deze ontsteking is, maar er zijn geen menselijke modellen die essentiële synoviale architectuur repliceren. Om dit aan te pakken werd het Joint Space Analysis System, of JSAS, opgericht. Het voorste synovium werd intraoperatief verkregen van patiënten die een totale knieartroplastiek (TKA) ondergingen. Synovium werd ontleed en in 3 mm biopsiekernen gesneden. Kernen werden geplaatst in de bovenste put van een 5 μm of 0,4 μm transwell met 300 μl DMEM en 10% FBS. In de onderste put werd 600 μL media toegevoegd en elke 2-3 dagen uitgewisseld. De levensvatbaarheid werd tot 7 dagen beoordeeld onder hyperoxische (50%), atmosferische/standaard (~21%) en fysiologische (5%) incubatieomstandigheden. Stimuli in de onderste put omvatten monocyt chemoattractant protein 1 (MCP-1/CCL2), lipopolysaccharide (LPS), N-acetyl cysteïne, S. aureus en B. burgdorferi. Media werd opgeslagen voor ELISA, en weefsel werd opgeslagen voor formaline fixed paraffine embedded (FFPE) analyse. Onder standaardomstandigheden bleef het synovium 3 dagen volledig levensvatbaar. De stimulus veranderde de structuur en functie van de intimale bekleding en sublining synoviale cellen, waaronder het verlies van de residente macrofagenrand, sublining-uitbreiding, upregulatie van pathogene fibroblasten en productie van cytokines IL-1β en TNFα. Immuuncellen en fibroblasten migreerden naar de onderste kamer (5 μm porieën) volgens flowcytometrieanalyse. Mobiele B. burgdorferi migreerde in weefsel bij de poriegrootte van 0,4 μm, terwijl niet-beweeglijke S. aureus dat niet deed. Relevante cytokines werden in voldoende hoeveelheden tot expressie gebracht voor ELISA. JSAS is een modulair systeem dat in staat is acute veranderingen in het menselijke synovium te bestuderen, waardoor de complexiteit van 3D-structuren in een preklinisch model mogelijk is, terwijl biologisch relevante structuur en functie behouden blijven.

Inleiding

Artritis treft meer dan 20% van alle volwassenen in de VS en 50% van degenen ouder dan 65 jaar met chronische aandoeningen1. Het is ook een belangrijke oorzaak van invaliditeit wereldwijd2. Artritis omvat niet alleen kraakbeenschade, maar ook ontsteking van de gewrichtscapsule of het synovium (bijvoorbeeld synovitis). Chronische synovitis is waarschijnlijk een belangrijke bron van pro-inflammatoire cytokines die bot- en kraakbeenschade versterken bij artrose en reumatoïde artritis 3,4. Daarom is het begrijpen van de immuungemedieerde veranderingen in het synovium waarschijnlijk essentieel voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische en mogelijk preventieve opties voor patiënten met artritis.

Synovium is een georganiseerde structuur die bestaat uit twee hoofdlagen: de cellulaire intimale bekleding (IntL) en de subbekleding (SubL). De IntL verbindt zich met synovialvloeistof (SF), en de SubL maakt SF-componenten en bevat vaatstructuren5. Binnen de IntL zijn er zowel macrofagen als fibroblast-achtige synoviocyten (FLS). De macrofagen van de IntL zijn residentiële cellen, lokaal vernieuwd door interstitiële macrofagen binnen de SubL6. Deze residente synoviale macrofagen (RSM's) zijn M2-scheef door expressie van CD206 en TREM2, epithelialiseerd, en drukken nauwe junctionmarkeringen uit. Deze substructuur van de IntL kan essentieel zijn voor het functioneel en fysiek handhaven van de gewrichtsruimtehomeostase 5,6. Dit is waargenomen bij reumatoïde artritis (RA). Wanneer de IntL bijvoorbeeld afbreekt, ervaren patiënten met reumatoïde artritis opvlammingssymptomen, die verdwijnen wanneer het slijmvlies weer opbouwt 6,7. Spontane RA-remissie is specifiek geassocieerd met MerTK +CD206+ synoviale macrofagen7. RSM's werden ook geïdentificeerd in SF van patiënten met acute gewrichtspijn, waarbij werd vastgesteld dat de ernst van infectieuze of ontstekingsziekten correleerde met de hoeveelheid RSM's en ontstekingscytokines8. Helaas is de relatie tussen de IntL- en SubL-structuren, functionele veranderingen van RSM's en FLS, en de productie van ontstekingsmediatoren die kraakbeen en/of bot kunnen beschadigen, moeilijk te onderzoeken, vooral bij mensen.

Om onderliggende mechanismen van synovitis in meerdere klinisch relevante situaties te onderzoeken, werd een menselijk ex vivo model ontwikkeld genaamd het Joint Space Analysis System (JSAS). Dit systeem levert reproduceerbare resultaten op met modulaire elementen om een brede evaluatie van inflammatoire en infectieuze artritis mogelijk te maken. Dit artikel beschrijft de processen van weefselverwerving bij veelvoorkomende open-gewrichtsoperaties, zoals totale gewrichtsvervanging, JSAS-ontwerp, de histomorfometrie die nodig is om acute structurele veranderingen in het synovium te kwantificeren, en de functionele responsen van het weefsel, waaronder door immunofluorescentie (IF), RNAscoop en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). JSAS verschilt van gangbare menselijke in vitro-modellen doordat het de IntL- en SubL-structuren behouden blijft, waardoor bijna in vivo inzichten kunnen worden gegeven in acute of acute chronische synovitis die leidt tot kraakbeenschade. Door de natuurlijke structuur van het synovium te behouden, is het mogelijk om de intrinsieke capaciteiten van RSM en FLS te dissecten om ontstekingen te dempen of te bestendigen. Als ex vivo model vereist het noch differentiatie van perifere immuuncellen in synoviale macrofagen, noch vereenvoudiging van synovium tot slechts 1-2 afzonderlijke celtypen. Het verschilt van diermodellen zoals Collagen Induced Arthritis (CIA) door gebruik te maken van natuurlijk ziek menselijk weefsel, waardoor pathogeen-specifieke evaluatie mogelijk is die relevant is voor de mens. Ten slotte kunnen meerdere infecties worden gesimuleerd, waardoor een model van septische artritis naast artrose en inflammatoire artritis mogelijk wordt. De belangrijkste beperking is dat je onder standaardomstandigheden 3 dagen kweekt vóór het begin van apoptose.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Patiënttoestemming en het weefselverwerkingsprotocol zijn goedgekeurd door de lokale Institutional Review Board (IRB). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Weefselverwerving en biopsie

  1. Identificeer patiënten preoperatief op basis van de schema's van de chirurg. Rekruteer patiënten van 18-65 jaar die een open gewrichtsoperatie ondergaan, zoals totale knieartroplastiek (TKA) of Tibiale Tuberkelosteotomie (TTO, ook bekend als Fulkerson), en die geen systemische immunomodulerende medicatie gebruiken.
    OPMERKING: Idealiter kun je patiënten uitsluiten die meer dan één artroscopie of meer dan één glucocorticoïde-injectie ondergaan, omdat deze patiënten een hoger intraoperatief falen in weefselverwerving hadden dan andere populaties door fibrose. Gezien het risico op infectieoverdracht, stel de werving van patiënten met een geschiedenis van Hepatitis C of het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) uit, tenzij dit relevant is voor de uitkomsten. Hanteer altijd veilig met vers menselijk weefsel, ongeacht de status van infectieziekte.
  2. Orthopedisch chirurgen voeren arthrotomie en dissectie uit als onderdeel van de standaardprocedure. Identificeer het voorste synovium direct proximaal van de trochleaire groef en gebruik elektrocauterisatie om het synovium en bloc te verwijderen, terwijl dissectie van de articularis genu-spier of nabij de mediale en laterale epicondylen wordt vermeden. Synovectomie is relatief neutraal voor TKA-uitkomsten en kan bij ontstekingsaandoeningen gunstig zijn 9,10. Geef het synovium steriel aan het onderzoeksteamlid en plaats het in een steriele monstercontainer met koude Dulbecco's fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS) op ijs.
    OPMERKING: Beëindig de weefselacquisitie als er afwijkingen zijn vastgesteld door het chirurgisch team, of als een synovectomie de sluiting of het operatieresultaat zou belemmeren. Dit laatste zou in het bijzonder zeer ongebruikelijk zijn bij TKA, omdat synoviumexcisie kan worden gebruikt als een uitrekbare procedure om strakke gewrichten los te maken. De hoeveelheid excisie hangt af van de omvang van het experiment. Het is mogelijk om ongeveer vier 3 mm biopsiekernen per 1 cm2 weefsel te verkrijgen. In veel gevallen is het mogelijk om 24 cmof meer weefsel te verkrijgen. Weefselgewicht is sterk afhankelijk van de chirurgische dissectie, waardoor het minder betrouwbaar is dan het oppervlak om de geschiktheid voor het experiment te bepalen. Figuur 1 illustreert stappen 1.2-1.7.
  3. Breng het synovium terug naar het lab en was het twee keer in koude DPBS gedurende 10 minuten op een plate-rocker.
  4. Breng het synovium over in een steriele petrischaal van 10 cm of groter onder steriele omstandigheden in een biosafety level 2 (BSL2) gecertificeerde bioveiligheidskast. Voeg koud, steriel, glucosearm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) toe met natriumpyruvaat en L-glutamine, genoeg om het gerecht half te vullen. Identificeer de synoviale bekleding aan de hand van de parelmoerachtige IntL-laag (Figuur 2A), in tegenstelling tot de gecauteriseerde zijde (Figuur 2B).
    OPMERKING: De IntL is fragiel. Wees voorzichtig dat je het niet losmaakt, anders dissocieert het van de sublining (Figuur 2A, vastgegrepen door hemostaat). Parelmoerlijkheid kan worden beïnvloed door eerdere geschiedenis van hemarthrose (geel-oranje verschijnt door hemosiderine), een hoge BMI (bedekt met vet), of ontsteking (rood, broos en villous). Het is absoluut essentieel om de IntL correct te identificeren voordat je verder gaat. Onderzoek zorgvuldig op tekenen van chirurgische excisie, cauterisatie, bloedingen en stolling om te bepalen dat de volgende stappen niet plaatsvinden op de IntL.
  5. Verwijder overbodig vet- en stromaal weefsel aan de gecauteriseerde zijde om synovium te isoleren, waarbij je ongeveer 4-5 mm weefseldiepte in alle gebieden behoudt. Irisschaar of scalpels kunnen naar persoonlijke voorkeur worden gebruikt. Verander het petrischaalmedium indien nodig om het gezichtsveld te behouden.
    OPMERKING: Achterste stromale of vetweefsel kan gemakkelijk worden verwijderd. Echter, moeite met dissectie of het voelen van grote weerstand wijst op vastgehouden ligament, weefselmetaplasie zoals ongeschikte kraakbeenafzetting, of het doorsnijden van de IntL.
  6. Na dissectie tot de juiste diepte, verkrijg je 3 mm biopsiekernen indien nodig voor minimaal 2 technische replica's per geteste conditie. Werk met de synoviale bekleding gericht op het boorgereedschap in plaats van tegen het oppervlak van de petrischaal. Een kwalitatief goede biopsiepunch kan ongeveer 10-15 keer worden gebruikt voordat deze moet worden vervangen vanwege afstomping, omdat een botte biopsiepunch schade aan de intieme bekledingstructuur veroorzaakt.
    1. Voer kernboring uit met krachtige loodrechte belasting en zachte draaiing. Als dit het weefsel verdraait, is het biopsie-instrument bot geworden en moet vervangen worden. Stabiliseer met de niet-dominante hand met een tang of hemostaten.
      OPMERKING: 3 mm kernen werden gebruikt om de weefselperfusie en het aantal kernen per patiënt te maximaliseren en voldoende technische replica's voor deze experimenten te garanderen. Alternatieve kerngroottes kunnen worden gebruikt, maar er werd slechts 3 mm getest voor dit protocol.
      OPMERKING: Overtollig achtergehouden vetweefsel door onvoldoende dissectie kan ervoor zorgen dat de kern in JSAS gaat zweven, wat suboptimaal is. Als de kernen naar het oppervlak drijven in plaats van onder water te blijven, keer dan terug naar dissectie of kies een ondergedompelde kern.
  7. Open een tweede petrischaal en vul met 5-10 mL verwarmd (37 °C) medium met 10% FBS. Met platte of niet-getande pincetten breng je de kernen over op deze schaal om vuil weg te spoelen met 1-2 seconden zachte mechanische beweging. Knell de kernen niet te strak samen, anders kan dit de intimiteitsbekleding beschadigen.
    OPMERKING: Kan hier ≤24 uur pauzeren door weefselkernen in de broedmachine te plaatsen op een standaardinstelling van 37 °C en 5%CO2.

2. Opzetten van het Joint Space Analysis System (JSAS)

  1. Bereid de bodemput van JSAS voor met 600 μL verwarmde (37 °C) low glucose DMEM met 10% FBS. Hoewel 1% penicilline-streptomycine in dit systeem is getest zonder merkbare negatieve effecten, worden antibiotica doorgaans niet aan media toegevoegd als de steriliteit voldoende is gehandhaafd.
    OPMERKING: Bij co-culturatie met bacteriën of een cellijn die een ander medium vereist, kan de bodemput een ander medium zijn. Vermijd antibioticum als je co-cultiveert met bacteriën.
  2. Voeg onderaan de voorkeur de gewenste behandeling toe. Bijvoorbeeld lipopolysaccharide (LPS). Om osmolariteitsverschillen te voorkomen, wordt aanbevolen dat het behandelvolume niet meer dan 2,5% van het totale volume bedraagt (bijv. ≤15 μL voor 600 μL). Stop eventuele pH-veranderingen door behandelingen om pH 7,0-7,4 te behouden. Gebruik anders de voertuigbesturing.
  3. Kies de transwell-poriegrootte afhankelijk van het gewenste experimentele resultaat (Figuur 3).
  4. Voeg 300 μL low glucose DMEM met 10% FBS toe aan de transwell.
  5. Breng voorzichtig individuele kernen over met een steriele pincet in het medium van de transwell. De oriëntatie van het weefsel is niet te controleren; echter, de vetvorming en natuurlijke drijfkracht van het stromale weefsel zorgen er van nature voor dat de intimale bekleding voor het merendeel van de weefselkernen met de voorkant naar beneden staat.
    1. Visualiseer de kernen zorgvuldig, omdat het kernen de intimale bekleding kan verstoren, en vermijd het gebruik van kernen die aan het begin van het experiment versleten lijken. Als de kern zwevend is, verbeter dan de dissectie en kies een alternatieve kern.
      OPMERKING: Overweeg een collageenmatrix als weefseloriëntatie belangrijk is; Dit zal echter de tijd beïnvloeden om een chemische gradiënt met de bodemput te ontwikkelen.
  6. Plaats het in de broedmachine op 37 °C en 5%CO-2 gedurende de gewenste duur.
    OPMERKING: De vroegste aanbevolen tijd voor biologische veranderingen is 8 uur. De meest recente gevalideerde tijdstip voor biologische activiteit is 3 dagen.

3. Experimentele verwijdering en analyse

  1. Voor histologie gebruik je steriele, niet-getande pincetten om weefsel over te brengen naar 3-5 mL 10% neutraal gebuffreerd formaline (NBF) voor formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde (FFPE) analyse. Bewaar 3-7 dagen in NBF voordat je het inbedden en in secties plaatst.
    1. Laat het weefsel niet te lang blijven zitten, want dit verergert de autofluorescentie. Voer histologische analyses uit, waaronder hematoxyline en eosine (H&E)11 kleuring voor histomorfometrie, immunofluorescentie (IF)12 en/of RNAscope met IF13 volgens standaardmethoden.
      OPMERKING: Wees voorzichtig dat je de transwell niet doorboort met een tang bij het verwijderen van het weefsel. Wees extreem voorzichtig bij het verplaatsen van de kern, anders kan de intieme wand dissociëren. Plaats de kern voorzichtig in fixatief en beweeg niet op. NBF moet worden gebruikt in een gecertificeerde chemische dampafzuigkap, moet worden afgevoerd volgens de lokale richtlijnen voor milieugezondheid en veiligheid (EHS), en mag niet in gootstenen worden gegoten. Ongebruikt menselijk weefsel uit het experiment wordt 30 minuten in meer dan 10% bleekmiddel geplaatst, vervolgens in secundaire containment geplaatst volgens lokale EHS-eisen, en vervolgens weggegooid in gelabelde biohazard-bakken voor verbranding. De bleekoplossing kan in de gootsteen worden gegoten als deze is goedgekeurd door lokale EHS. Volg lokale richtlijnen, die per instelling kunnen verschillen.
  2. Embed technische replicaties in hetzelfde FFPE-blok. Gebruik afgeschermde cassettes om verlies van het sample te voorkomen. Doorsnede in de lengteas bij 5 μm dikte. Plaats drie seriële secties op één dia (Aanvullende figuur 1).
  3. Afbeelding H&E schuift met 10x en 40x met brightfield-microscopie. Identificeer de IntL als de georganiseerde cellulaire laag op het grensvlak tussen weefsel en lege ruimte.
    1. Verkrijg 3 representatieve 10x-secties en 10 representatieve 40x-secties verspreid over minimaal 2 technische replica's per behandelingsconditie, waarbij de IntL in het gezichtsveld behouden blijft. Maak beelden als TIFF's met hoge resolutie. Voer histomorfometrie-analyse uit:
    2. Voer metingen uit in ImageJ/FIJI. Stel eerst de schaal in via het menu Analyseren → Schaal instellen. Set Scale vereist het gebruik van een kalibratiedia, afgebeeld op elke respectievelijke microscoop bij elk objectief. Gebruik eerst het rechte lijn-instrument om een lijn van bekende lengte te creëren op basis van de kalibratiedia. Wijs de schaal globaal toe.
      OPMERKING: Bij 10x is de schaal 3 px/μm. Bij 40x is de schaal 12 px/μm.
    3. Meet de subL-dikte met de 10x-afbeeldingen met het rechte lijn-gereedschap. Meet de dikte als een looddiepte van het IntL-oppervlak tot aan de onderkant van de SubL (μm). Na het tekenen van elke lijn gebruik je de sneltoets m om de lengte van de lijn te meten.
      1. Neem gemiddeld minimaal 5 metingen per 10x-afbeelding (Figuur 4A,B). De overgang tussen SubL- en stromaal weefsel wordt gemarkeerd door een overgang naar minder georganiseerde, minder cellulaire gebieden met collageen en vetweefsel (Figuur 4B). Snijd het overgangspunt tussen weefselcompartimenten doormidden.
    4. Voor 40x metingen van IntL-dikte, IntL-cellulariteit, IntL-integriteit en SubL-cellulariteit, begin je met het openen van de 40x TIFF in Adobe Photoshop (of een vergelijkbare beeldeditor). De IntL wordt gedefinieerd als een laag van ~1-5 cellen dik, georganiseerd in een duidelijke cellulaire laag op het grensvlak tussen weefsel en lege ruimte (bijv. synoviale vloeistof) (Figuur 4C).
    5. Maak een nieuwe laag aan. Selecteer het Polygonal Lasso-gereedschap . Met een muisklik om de lasso te initiëren en ankerverbuigingen in de lijn, verdeel je de overgang tussen de IntL en de SubL over het gehele beeld. Vervolgens zet je de lasso net buiten de IntL in de lege ruimte.
      1. Sluit de lasso met een dubbele klik. Keer het geselecteerde gebied om (selecteer → inverse), en vul de ruimte vervolgens met zwart met het verfemmer-gereedschap . Dit dekt alle gebieden die niet de IntL zijn. Sla deze afbeelding op als een hoge resolutie JPG die de IntL vertegenwoordigt, en verberg dan de laag.
    6. Maak een nieuwe laag aan. Selecteer onder de polygonale lasso-instellingen de intersectiefunctie , die alleen aangeeft waar het nieuwe lassogebied en het oude lassogebied elkaar kruisen. Lasso rond de subline-laag door door het midden van de IntL te klikken, rond de linker- en rechterranden van het beeld naar het achtergronddoek, en vervolgens de overgang tussen SubL en acellulair weefsel erachter te halveren.
      1. Als de onderkant van de SubL groter is dan de afmetingen van de 40x-afbeelding, selecteer dan simpelweg het achtergrondcanvas rond de overgebleven rand. Selecteer opnieuw de inverse van dit gebied zoals hierboven en gebruik dan het verf-emmergereedschap om het met zwart te vullen. Sla deze afbeelding op als een hoge resolutie JPG die de SubL voorstelt. Bewaar deze gelaagde afbeelding als PSD voor toekomstige referentie.
        OPMERKING: Erytrocyten komen vaak voor in deze glaasjes en kunnen toekomstige celtellingmetingen verstoren. Als er grote gebieden met vaaten zijn, gebruik dan het polygonale lasso-gereedschap, het penseelgereedschap of andere gereedschappen naar keuze om maskers op een aparte laag te maken die deze gebieden bedekt.
    7. Open in FIJI de IntL-maskerafbeelding . Meet de IntL-dikte (μm) als gemiddelde van minimaal 5 metingen over het 40x-beeld met behulp van het rechte lijn-instrument zoals in stap 3.3.2-3.3.3.
    8. Meet de totale lengte (μm) van de IntL met behulp van het gesegmenteerde lijngereedschap. Meet vervolgens alleen de lengte van de intacte gebieden, ook met het gesegmenteerde lijngereedschap (Figuur 4D, E). IntL-secties die niet intact zijn, worden gemarkeerd door openingen tussen cellen, een mottengevreten uiterlijk en het afbreken of afbladderen van IntL uit het weefsel.
      1. Bereken de % intacte IntL-grens in als (intacte IntL/totale IntL)*100. Dit moet worden vergeleken met dezelfde tijdspuntcontroles om eventuele sectie-artefacten te compenseren.
    9. Meet de cellulariteit van de IntL met behulp van het IntL-maskerbeeld. Transformeer eerst naar 8-bit (Image → Type → 8-bits). Vervolgens de drempel (afbeelding → drempel) om ruis te minimaliseren en celidentificatie te maximaliseren. In het drempelmenu selecteer je donkere achtergrond uit en gebruik je de onderste schakelaar voor aanpassingen.
      1. Bepaal handmatig de drempel per beeld, geholpen door het verdwijnen van ruis (bijv. achtergrondartefact) terwijl het oorspronkelijke aantal kernlichamen behouden blijft. Vergelijk regelmatig de originele afbeelding om de kwaliteit te behouden. Wanneer ruis wordt geminimaliseerd (vals-positief) maar het hematoxylinesignaal wordt gemaximaliseerd (echt nucleair positief), is het passend de drempel in te stellen (aanvullende figuur 2).
        OPMERKING: De drempel is consistent over een enkele dia-scan, maar verschilt tussen dia-scans en ook tussen individuele 10x- of 40x-afbeeldingen. Het verschilt ook per batch H&E, omdat de kleurdiepte waarschijnlijk niet consistent zal zijn. Daarom zijn eenvoudige macro's ongeschikt als er verschillen zijn in een van de volgende categorieën tussen beelden: patiënt, H&E-batch, sectiedikte, lichtomstandigheden (lichtsterkte/kleurtemperatuur in de kamer of microscoop), software die wordt gebruikt om het beeld te verkrijgen, microscoop die het beeld verfilmt, en gebruik van witbalans- of kleurbalansalgoritmen. Deze lijst is niet uitputtend. Met de AmScope T390B-3M microscoop met een compatibele camera en software, met microscooplicht op maximaal in een schemerige kamer, met automatische witbalansinstellingen, 10 willekeurige 40x-beelden met 3 patiënten, varieerde de drempel van 96-182, met een gemiddelde van 137. Dit brede bereik weerspiegelt de verschillen in de onderliggende 8-bits histogrammen, niet de inconsistentie van de gebruiker. Het is dus essentieel om visuele trouwheid tussen het originele beeld en het drempelbeeld te waarborgen, niet het exacte aantal van de drempel. Het automatiseren van dit proces valt buiten het bereik van de typische laboratoriumwetenschapper en vereist programmering door een beeldanalyseprofessional.
    10. Gebruik Analyze Particles (Analyze → analyze particles) met celgrootte 8-150 μm2 om kernen te identificeren en te tellen als surrogaat voor celnummer. Selecteer overlay-maskers in de instellingen om de geïdentificeerde cellen te visualiseren, opnieuw vergeleken met de originele afbeelding. Aangezien de IntL voornamelijk een lineaire, niet volumetrische, structuur is, normaliseer deze 100 μm van IntL-lengte (bijv. #cells/100 μm). Dit was gemiddeld ongeveer 13,19 (bereik 5,4-21,9, SD 3,9) cellen per 100 μm in vers teruggewonnen synoviaal weefsel.
      OPMERKING: Het bereik 8-150 μm2 werd bepaald op basis van de Set Scale en iteratieve visuele vergelijking van het drempelbeeld met het oorspronkelijke beeld. De empirisch vastgestelde limieten in de dataset komen overeen met vormaannames gebaseerd op macrofagen met een celdiameter die kan variëren van ongeveer 8-20 μm14,15. Grotere groottes werden uitgesloten omdat dit vaak meerdere discrete kernen in nauwe afstand vertegenwoordigde die als één cel werden gelezen.
      OPMERKING: Vergelijkbare workflows kunnen bijvoorbeeld in QuPath worden opgezet.
    11. Open het SubL-masker met erytrocyten uitgesloten (Figuur 4G). Voer 8-bits transformatie uit, drempel en analyseer deeltjes zoals vermeld in stappen 3.3.9-10. Aangezien de SubL een volumetrische laag is, normaliseer het aantal getelde cellen tot 100 μm2 van SubL-oppervlakte (bijv. meting van niet-gemaskeerde gebieden) (Figuur 4H).
  4. Voor flowcytometrieanalyse van migrerende cellen in de bodemput, centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten en houd de celpellet op ijs. Verwacht ~20.000 levende, migrerende cellen per 3 mm biopsiekern bij 24 uur. Flowcytometriemethoden zijn eerder gepubliceerd8.
  5. Voor ELISA centrifugeer je media op maximale snelheid (>5000 x g) gedurende 5 minuten bij 4 °C om cellen of celresten te pelleten. Bewaar op de gewenste temperatuur. ELISA-methoden zijn eerder gepubliceerd8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Optimalisatie van zuurstofcultuurcondities

Fysiologische weefselperfusie bestaat uit ongeveer 6%-8% zuurstof, terwijl de standaard incubatiecondities voor celkweek op atmosferische zuurstofniveaus (~21%)16 liggen. Ter vergelijking: hyperoxygenatie kan de levensvatbaarheid van celkweek verbeteren of toxischzijn. Voldoende gebruik van JSAS vereiste vroegtijdige vaststelling van de levensvatbaarheid van synoviaal weefsel; Daarom wer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk toonde de capaciteiten van JSAS aan, met name het behoud van levend synoviaal weefsel met intacte, functioneel responsieve synoviale architectuur. Er was minimale celdood tot 72 uur kweek in de meeste incubatieomstandigheden. Om de microscopische veranderingen van de synoviale structuur te evalueren, werd een uniek histologisch meetsysteem beschreven, dat structurele veranderingen van de IntL en SubL kwantificeert. Dergelijke veranderingen wijzen op acute of acute-op-chronische ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit protocol zou niet mogelijk zijn zonder de vrijgevigheid van patiënten die hun weefsel hebben gedoneerd, en de vaardigheid van onze orthopedische chirurgische collega's, die bereid zijn veilig weefsel te verwerven voor het werk. K.I.C. wordt ondersteund door NIAMS K08 AR084605, en C.P.P. wordt ondersteund door het Veterans Affairs Career Development Program [IK2BX004532]. Deze groep erkent het gebruik van de University of Iowa Central Microscopy Research Facility, een kernvoorziening ondersteund door de vicevoorzitter voor onderzoek van de University of Iowa, en het Carver College of Medicine. Flowcytometriegegevens werden verkregen bij de Flow Cytometry Facility, een kernonderzoeksfaciliteit van Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center aan de University of Iowa. De faciliteit wordt gefinancierd via gebruikersbijdragen en de genereuze financiële steun van het Carver College of Medicine, Holden Comprehensive Cancer Center en Iowa City Veteran's Administration Medical Center. Het onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd werd ondersteund door: het National Center for Research Resources van de National Institutes of Health onder Award Number 1 S10 OD034193-01; en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Number P30CA086862.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm Petri schotelsCorningCLS430167
23srRNA RNAscope sondeACD/Biotechne468211
24 wel platenLife Sciences3524
3 mm biopsie ponsenIntegra12460406
50 mL kegelvormige flesjesN/A
70% ethanol (voor sterilisatie)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 moet worden gebruikt in de late exponentiële fase voor maximale pathogeniteit
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 antilichaamInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standaardcondities)N/A
Dulbecco's Phosphate gebufferde zoutoplossing (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
foetaal bovien serumBiotechneS11150Verhit in geïnactiveerde batch: F22100
forceps (tandenloos)N/A
kramptangN/A
Bevochtigde cellincubaor (standaardcondities)N/A
Hypoxia incubaorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, rest N2, fysiologische omstandigheden)N/A
IL-4 antilichaamThermofisherMA5-424701:100
iNOS antilichaamThermofisherPA1-0361:100
Iris schaarN/A
LipopolysacharideSigma-AldrichL2630
lage glucose DMEM (+Natriumpyruvaat, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 antilichaamThermofisherMA5-327051:1000
Modulaire incubaorkamer (hyperoxische omstandigheden)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteïneSigma-AldrichA9165Moet vers worden bereid voor elk experiment en gebufferd in gelijkmolaire natriumbicarbonaat naar een pH van 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 verdunning
Zuurstoftank met liter per minuut stroomregelaarN/A
PDPN antilichaamInvitrogen14-9381-821:100
Propidium JodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 verdunning
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X stock
TNF antilichaamThermofisherPA5-198101:100
transwell inzetstukken - 0,4 um maatMillicellPICM01250
transwell inzetstukken - 5 um maatCorningCLS3421

Referenties

  1. Fallon, E. A., et al. Prevalence of diagnosed arthritis - United States, 2019-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 72 (41), 1101-1107 (2023).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cart. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Alivernini, S., Firestein, G. S., Mcinnes, I. B. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 55 (12), 2255-2270 (2022).
  4. Mathiessen, A., Conaghan, P. G. Synovitis in osteoarthritis: Current understanding with therapeutic implications. Arthritis Res Ther. 19 (1), 18(2017).
  5. Culemann, S., Grüneboom, A., Krönke, G. Origin and function of synovial macrophage subsets during inflammatory joint disease. Adv Immunol. 143, 75-98 (2019).
  6. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572 (7771), 670-675 (2019).
  7. Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nat Med. 26 (8), 1295-1306 (2020).
  8. Cyndari, K. I., Scorza, B. M., Zacharias, Z. R., Pessôa-Pereira, D., Strand, L. Resident synovial macrophages in synovial fluid: Implications for immunoregulation. Clin Immunol. 271, 110422(2024).
  9. Kooner, S. S., Clark, M. The effect of synovectomy in total knee arthroplasty for primary osteoarthritis: A meta-analysis. J Knee Surg. 30 (4), 289-296 (2017).
  10. Lipina, M., et al. Arthroscopic synovectomy of the knee joint for rheumatoid arthritis. Int Orthop. 43 (8), 1859-1863 (2019).
  11. Rosas, L., Mora, A. L., Rojas, M. Osu tristate sennet H&E staining of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections. protocols.io. , (2023).
  12. Biologicals, N. Immunofluorescent IHC staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue protocol. , https://www.novusbio.com/support-by-application/Fluorescent-IHC-Staining-of-FFPE-Tissue (2025).
  13. Rnascope multiplex fluorescent reagent kit v2 with sample preparation and pretreatment. , Advanced Cell Diagnostics Inc. https://acdbio.com/rnascope-multiplex-fluorescent-v2-assay (2022).
  14. Fakoya, A. O., Naeem, A., Pierre, L. Statpearls. 20235, Treasure Island (FL). Internet (2024).
  15. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. Am Rev Respir Dis. 126 (2), 332-337 (1982).
  16. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  17. Pilarek, M., Grabowska, I., Ciemerych, M. A., Dąbkowska, K., Szewczyk, K. W. Morphology and growth of mammalian cells in a liquid/liquid culture system supported with oxygenated perfluorodecalin. Biotechnol Lett. 35 (9), 1387-1394 (2013).
  18. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 42, 473-518 (2021).
  19. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  20. Arvikar, S. L., Steere, A. C. Lyme arthritis. Infect Dis Clin North Am. 36 (3), 563-577 (2022).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , Advanced Cell Diagnostics Inc. Newark, CA. (2022).
  22. Feng, J., Wang, T., Zhang, S., Shi, W., Zhang, Y. An optimized SYBR Green i/pi assay for rapid viability assessment and antibiotic susceptibility testing for Borrelia burgdorferi. PLoS One. 9 (11), e111809(2014).
  23. De Buys, M., Moodley, K., Cakic, J. N., Pietrzak, J. R. T. Staphylococcus aureus colonization and periprosthetic joint infection in patients undergoing elective total joint arthroplasty: A narrative review. EFORT Open Rev. 8 (9), 680-689 (2023).
  24. Ross, J. J. Septic arthritis of native joints. Infect Dis Clin North Am. 31 (2), 203-218 (2017).
  25. Kwon, H. -K., Yu, K. E., Lee, F. Y. Construction and evaluation of a clinically relevant model of septic arthritis. Lab animal. 52, 11-26 (2022).
  26. Carrel, M., Perencevich, E. N., David, M. Z. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis. 21 (11), 1973-1980 (2015).
  27. Parlet, C. P., Brown, M. M., Horswill, A. R. Commensal staphylococci influence Staphylococcus aureus skin colonization and disease. Trends Microbiol. 27 (6), 497-507 (2019).
  28. Bünter, J. P., et al. Wild-type AGR-negative livestock-associated MRSA exhibits high adhesive capacity to human and porcine cells. Res Microbiol. 168 (2), 130-138 (2017).
  29. Patel, H., Rawat, S. A genetic regulatory see-saw of biofilm and virulence in MRSA pathogenesis. Front Microbiol. 14, 1204428(2023).
  30. Soong, G., et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus adaptation to human keratinocytes. mBio. 6 (2), e00289-e00315 (2015).
  31. Ni, F., Zhang, Y., Peng, X. Correlation between osteoarthritis and monocyte chemotactic protein-1 expression: A meta-analysis. J Orthop Res. 15, 516(2020).
  32. Tsai, P. H., Liou, L. B. Effective assessment of rheumatoid arthritis disease activity and outcomes using monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and disease activity score. Int J Mol Sci. 25 (21), 11374(2024).
  33. Boyce, B. F., Xing, L. Biology of rank, rankl, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 9 (Suppl 1), S1(2007).
  34. Asano, T., et al. Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone. Nat Metab. 1 (9), 868-875 (2019).
  35. Kanzaki, H., et al. Soluble RANKL cleaved from activated lymphocytes by tnf-α-converting enzyme contributes to osteoclastogenesis in periodontitis. J Immunol. 197 (10), 3871-3883 (2016).
  36. Zahan, O. M., Serban, O., Gherman, C., Fodor, D. The evaluation of oxidative stress in osteoarthritis. Med Pharm Rep. 93 (1), 12-22 (2020).
  37. Ozcamdalli, M., et al. Comparison of intra-articular injection of hyaluronic acid and N-acetyl cysteine in the treatment of knee osteoarthritis: A pilot study. Cartilage. 8 (4), 384-390 (2017).
  38. Kim, H. R., Kim, K. W., Kim, B. M., Lee, K. A., Lee, S. H. N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL production in rheumatoid arthritis. Korean J Intern Med. 34 (1), 210-219 (2019).
  39. He, T., et al. Efficacy of n-acetylcysteine as an adjuvant therapy for rheumatoid arthritis: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Br J Hosp Med (Lond). 85 (11), 1-16 (2024).
  40. Tsikas, D., Mikuteit, M. N-acetyl-l-cysteine in human rheumatoid arthritis and its effects on nitric oxide (NO) and malondialdehyde (mda): Analytical and clinical considerations. Amino Acids. 54 (9), 1251-1260 (2022).
  41. Yeh, Y. T., Liang, C. C., Chang, C. L., Hsu, C. Y., Li, P. C. Increased risk of knee osteoarthritis in patients using oral N-acetylcysteine: A nationwide cohort study. BMC Musculoskelet Disord. 21 (1), 531(2020).
  42. Kaneko, Y., et al. Oral administration of N-acetyl cysteine prevents osteoarthritis development and progression in a rat model. Sci Rep. 9, 18741(2019).
  43. Coleman, M. C., et al. Sci Transl Med. 10 (427), eaan5372(2018).
  44. Drehmer, D., et al. Nitric oxide favours tumour-promoting inflammation through mitochondria-dependent and -independent actions on macrophages. Redox Biol. 54, 102350(2022).
  45. Fang, F. C., Vázquez-Torres, A. Reactive nitrogen species in host-bacterial interactions. Curr Opin Immunol. 60, 96-102 (2019).
  46. Winyard, P. G., et al. Measurement and meaning of markers of reactive species of oxygen, nitrogen and sulfur in healthy human subjects and patients with inflammatory joint disease. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1226-1232 (2011).
  47. Xue, M., et al. Endogenous MMP-9 and not MMP-2 promotes rheumatoid synovial fibroblast survival, inflammation and cartilage degradation. Rheumatology (Oxford). 53 (12), 2270-2279 (2014).
  48. Piacenza, L., Zeida, A., Trujillo, M., Radi, R. The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite. Physiol Rev. 102 (4), 1881-1906 (2022).
  49. Dikalov, S. I., Mayorov, V. I., Panov, A. V. Physiological levels of nitric oxide diminish mitochondrial superoxide. Potential role of mitochondrial dinitrosyl iron complexes and nitrosothiols. Front Physiol. 8, 907(2017).
  50. Krenn, V., et al. Grading of chronic synovitis: A histopathological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 198 (5), 317-325 (2002).
  51. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Vet Pathol. 52 (5), 819-826 (2015).
  52. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  53. Felson, D. T., et al. Essential fatty acids and osteoarthritis. Arthritis Care Res (Hoboken). 76 (6), 796-801 (2024).
  54. Jarraya, M., et al. Prevalence of intra-articular mineralization on knee computed tomography: The multicenter osteoarthritis study. Osteoarthritis Cartilage. 31 (8), 1111-1120 (2023).
  55. Rai, M. F., Cai, L., Zhang, Q., Townsend, R. R., Brophy, R. H. Synovial fluid proteomics from serial aspirations of ACL-injured knees identifies candidate biomarkers. Am J Sports Med. 51 (7), 1733-1742 (2023).
  56. Rivellese, F., et al. Rituximab versus tocilizumab in rheumatoid arthritis: Synovial biopsy-based biomarker analysis of the phase 4 R4RA randomized trial. Nat Med. 28 (6), 1256-1268 (2022).
  57. Paggi, C. A., Teixeira, L. M., Le Gac, S., Karperien, M. Joint-on-chip platforms: Entering a new era of in vitro models for arthritis. Nat Rev Rheumatol. 18 (4), 217-231 (2022).
  58. Li, Z. A., et al. Synovial joint-on-a-chip for modeling arthritis: Progress, pitfalls, and potential. Trends Biotechnol. 41 (4), 511-527 (2023).
  59. Thompson, C. L., et al. Human vascularised synovium-on-a-chip: A mechanically stimulated, microfluidic model to investigate synovial inflammation and monocyte recruitment. Biomed Mater. 18 (6), acf976(2023).
  60. Thangadurai, M., Sethuraman, S., Subramanian, A. A 2d inflammatory co-culture model for investigating synovial fibroblast and macrophage interactions in rheumatoid arthritis. Sci Rep. 15 (1), 30105(2025).
  61. Rosso, F., Rossi, R., Cottino, U., Bonasia, D. E. Tibial tubercle osteotomy for patellofemoral malalignment and chondral disease provided good outcomes: A systematic review. J ISAKOS. 7 (2), 78-86 (2022).
  62. Kleuskens, M. W. A., Van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Orthop Res. 39 (4), 871-879 (2021).
  63. Schwab, A., et al. Ex vivo culture platform for assessment of cartilage repair treatment strategies. ALTEX. 34 (2), 267-277 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Synovitismodelmenselijk synoviumgewrichtskapselflowcytometrieELISA analysecytokineproductiesynoviale architectuurweefsellevensvatbaarheid

Gerelateerde artikelen