Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Orale Gavage bij neonatale muispups en functionele beoordeling van de integriteit van darmbarrières met behulp van Ussing-kamers

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69751

⸱

9 januari 2026

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft: (1) orale gavageafgifte van testmoleculen aan neonatale muizen al vanaf DOL 6; en (2) ex vivo evaluatie van de functie van colonische epitheelbarrières in biopten van DOL 10 tot spenende (DOL 20) jongen door het beoordelen van paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit met Ussing-kamers.

Samenvatting

Steeds meer bewijs onderstreept het belang van de eerste 1.000 levensdagen bij het vormen van de as van het darmmicrobioom. Dit vroege levensvenster is cruciaal voor het opzetten van langetermijnfysiologische trajecten en immunologische aanpassingen, wat mogelijk de vatbaarheid voor ziekten die samenhangen met dysbiose en barrièredisfunctie kan beïnvloeden. Een dieper begrip van de onderliggende mechanismen vereist een uitgebreide beoordeling van belangrijke fysiologische parameters, waaronder paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit van de neonatale darm. Het evalueren van deze parameters is essentieel om te verduidelijken hoe vroege blootstelling aan exogene moleculen de darmintegriteit en de langetermijngezondheidsuitkomsten kan beïnvloeden. Daarom beschrijft het eerste deel van dit artikel de orale toediening van moleculen van belang bij muisjongen vanaf dag 6, waarbij stress, risico op letsel en kannibalisme worden geminimaliseerd. Gesmeerde, afgeronde 24-G voedingsnaalden worden gebruikt om muisjongen met een minimaal 2,5 g gewicht te gaven. Het tweede deel beschrijft de ex vivo beoordeling van paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit met behulp van Ussing-kamerassays op colonmonsters van jongen tussen DOL-10 en het afbouwen. Pinloze schuifplaten, aangepast voor kleine biopsieën, worden gebruikt in combinatie met Ussing-kamers om neonatale colonische monsters te monteren. De paracellulaire probe FITC-Dextran 4 kDa en de transcellulaire marker mierikswortelperoxidase 44 kDa Type VI worden aan het begin van de assay toegevoegd aan het apicale compartiment van het systeem. Monsters worden verzameld in het basolaterale compartiment op 0 minuten, 30 minuten, 60 minuten, 90 minuten en 120 minuten om de doorgang van de sonde te kwantificeren. Het passeren van beide markers wordt direct (FITC) en indirect (HRP) gekwantificeerd door een plaatlezer, berekend met standaardcurves en uitgedrukt als flux.

Inleiding

De integriteit van de darmbarrière speelt een fundamentele rol bij het behouden van de algehele gezondheid door het cocosaal immuunrespons te coördineren en de selectieve permeabiliteit van het darmepitheel te reguleren. Dit barrièresysteem regelt de doorgang van voedingsstoffen terwijl het voorkomt dat pathogenen, antigenen en toxines worden overgezet in de systemische circulatie1. Chronische verstoring van deze grensvlak, geassocieerd met verhoogde darmpermeabiliteit, algemeen bekend als "leaky gut", wordt nu niet alleen als gevolg geïdentificeerd, maar ook als een oorzaak van chronische ontstekingstoestanden en een reeks extra-intestinale pathologieën2.

Zo is aangetoond dat een verzwakte functie van de darmbarrière een belangrijk onderdeel is van auto-immuun- en stofwisselingsziekten zoals inflammatoire darmziekten (IBD), juveniele idiopathische artritis (JIA) en type 1 diabetes (T1D). Dit benadrukt de darmbarrièretoestand als een belangrijke biomarker, maar ook als therapeutisch doel om het starten van pathofysiologische processen zo vroeg mogelijk te voorkomen en om de progressie van acute ontsteking naar een chronische toestand te voorkomen 3,4,5,6.

In deze context vertegenwoordigt de neonatale periode een uniek en zeer gevoelig ontwikkelingsvenster waarin de vestiging en rijping van de darm-microbiota-interface een diepgaande invloed heeft op de levenslange darm- en systemische gezondheid7. In dit vroege stadium vertonen het darmepitheel en het immuunsysteem een verhoogde gevoeligheid voor zowel endogene als exogene factoren, waarbij ze snel groeien en differentiëren terwijl ze zich tegelijkertijd aanpassen aan microbiële kolonisatie en dieetveranderingen. Verstoringen die de integriteit van de darmbarrière tijdens dit cruciale ontwikkelingsvenster aantasten, kunnen een cruciale rol spelen bij het ontstaan van een breed spectrum aan acute en chronische aandoeningen later in het leven. Deze aandoeningen omvatten immuungemedieerde ziekten zoals voedselallergieën, en ernstigere chronische aandoeningen zoals IBD, JIA en T1D 7,8,9. Deze ziekten benadrukken hoe pathofysiologische processen vaak vroeg ontstaan, aangezien het primaire begin meestal plaatsvindt tussen de kindertijd en vroegevolwassenheid. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die de werking van darmbarrières bij pasgeborenen regelen essentieel voor het ontwikkelen van preventieve en therapeutische strategieën die gericht zijn op het verminderen van de last van veel chronische ziekten.

Gezien deze context is er een dringende behoefte aan betrouwbare, fysiologisch relevante hulpmiddelen om de integriteit van darmbarrières, mechanismen van chronische ziekten en ontsteking specifiek binnen de neonatale setting te bestuderen. Dergelijke instrumenten moeten de replicatie mogelijk maken van experimentele assays die al in de volwassen context zijn bewezen, zonder precisie en effectiviteit op te offeren. Daarnaast wordt het steeds dringender om zowel korte- als langetermijneffecten van veel moleculaire kandidaten van belang te onderzoeken, waarvan wordt verwacht dat ze gunstige of schadelijke effecten hebben op de darmhomeostase in de neonatale context. Onder de beschikbare hulpmiddelen is orale gavagetoediening bij neonatale muispups een meer dan betrouwbare methode om moleculen van belang in een bepaalde ontwikkelingsfase af te leveren. Het maakt gecontroleerde onderzoeken mogelijk naar de effecten van verschillende bioactieve verbindingen, geneesmiddelen of microbiële metabolieten op de rijping van de darmen en de functie van barrières.

Het eerste deel van dit artikel beschrijft een methode voor het gavage van muisjongen al vanaf Day Of Life (DOL) 6, waarmee interventies vóór, tijdens en na de enorme uitbreiding van het aantal darmmicrobiotasoorten door voedseldiversificatie kunnen worden bestudeerd. Deze techniek maakt dus longitudinale analyses mogelijk van de behandelingseffecten op de darmgezondheid naarmate de welpen groeien en zich ontwikkelen.

In het tweede deel van dit artikel, ter aanvulling van deze benadering, biedt ex vivo beoordeling van de functie van colonische epitheelbarrières met behulp van Ussing-kamers een gevoelige en kwantitatieve maat voor permeabiliteitskenmerken. Evaluatie van zowel paracellulaire als transcellulaire permeabiliteit in colonbiopten van neonatale muizen (bijv. DOL 10-pups) maakt het mogelijk om nauwkeurig te bepalen hoe verschillende belangrijke kandidaten invloed hebben op de integriteit en functie van epitheliale barrières. Paracellulair transport is een in wezen passief mechanisme dat plaatsvindt via de intercellulaire ruimte van de epitheellaag. Het maakt de doorgang mogelijk van kleine opgeloste stoffen die worden aangedreven door elektrochemische en osmotische gradiënten van het lumen naar de basolaterale zijde. Dit mechanisme wordt voornamelijk gereguleerd door eiwitten uit de tight junction-familie, zoals claudins en occludine. Transcellulair transport daarentegen is een actief mechanisme, dat de opname van grotere opgeloste stoffen mogelijk maakt en via de epitheelcellen via specifieke kanalen, dragers en pompen plaatsvindt.

Fluoresceïneisothiocyanaat (FITC)-dextran (4 kDa) ondergaat voornamelijk paracellulair transport vanwege zijn grootte, terwijl mierikswortelperoxidase (HRP; 44 kDa) selectief via transcellulaire routes naar de basolaterale zijde wordt gebracht. Kwantificering van deze niet-endogene markers maakt het dus mogelijk om respectievelijk de paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit te beoordelen. De Ussing-kamertest met FITC en HRP behoudt de weefselarchitectuur en maakt realtime metingen mogelijk van respectievelijk de paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit van elk segment van het darmkanaal. Deze combinatie van neonatale gavage en Ussing-kameranalyse biedt een krachtige strategie om te bestuderen hoe specifieke moleculen de werking van de darmbarrière direct en over langere tijdsperioden beïnvloeden, en zo strategieën ondersteunt om ontstekingen te verminderen en chronische ziekten vanaf de vroegste levensfase te voorkomen.

Samenvattend beschrijft dit protocol twee complementaire experimentele procedures die mogelijk maken: (1) toediening van moleculen van belang in de vroege neonatale periode aan muisjongen (stap 1); (2) beoordeling van zowel para- als transcellulaire permeabiliteit in darmsegmenten van neonatale tot spenende pups met behulp van Ussing-kamers (stappen 2-6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de toepasselijke nationale regelgeving en goedgekeurd door het Franse Ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Innovatie via het APAFIS-platform (autorisatienummer: APAFIS#23855) en subsidies van de Agence Nationale pour la Recherche (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 en 18-IDEX-0001. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Gavage van neonatale muispups

OPMERKING: De volgende methode is aangepast van Franciscus et al.12. Hoewel het oorspronkelijke protocol gavage van muispups al vanaf DOL 2 toestond, werd gavage hier niet uitgevoerd vóór DOL 6, omdat de technische eisen op latere leeftijden de procedure aanzienlijk uitdagender maken. Daarnaast bemoeilijkt het gebruik van jongere pups de studies, omdat het het risico op dierverlies in de eerste dagen van de behandeling verhoogt en daardoor grotere cohorten vereist.

  1. Voorbereiding en installatie van gavage-oplossingen
    1. Weeg elke pup individueel.
    2. Pas de concentratie en het volume van de gavage-oplossing zo aan dat het totale toegediende volume niet hoger is dan 20 μL per gram lichaamsgewicht.
      OPMERKING: Onder standaardomstandigheden wegen muispups zelden minder dan 2,5 g bij DOL 6.
    3. Was een 24-G ronde tip voedingsnaald door deze grondig door te spoelen met gedeïoniseerd water, gevolgd door 70% ethanol met een spuit, en autocalaat het vervolgens.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elke behandelgroep een aparte voedingsnaald te gebruiken om kruisbesmetting te voorkomen.
    4. Leg schone papieren handdoeken op een ontsmett verwarmingskussen ingesteld op ~38 °C.
    5. Was handschoenen met 70% ethanol voordat je de dierenkooien opent om geuroverdracht naar de pups te beperken en het risico op kannibalisatie te verkleinen.
    6. Breng de moeder over naar een aparte kooi in een andere kamer om stress te beperken die veroorzaakt wordt door mogelijke vocalisaties van de pups.
    7. Wrijf schoongemaakte handschoenen met nestelmaterialen om het risico op overdracht van externe geuren tijdens het afgeven van geuren op de pups te beperken.
    8. Meet de afstand tussen het xiphoïde uitsteeksel (onderuiteinde van het borstbeen) en de snuit van een pup om de maximale inbrengingslengte op de voedernaald aan te geven (Figuur 1A,B).
  2. Intra-slokdarm gavage van muisjongen
    1. Bevestig de naaldkop op een steriele manier aan een spuit en neem meer dan de gewenste hoeveelheid gavage-oplossing op om het volledige benodigde volume toe te dienen zonder risico op luchtbellen, omdat deze het risico op aspiratie aanzienlijk verhogen.
    2. Met duim en wijsvinger van de niet-dominante hand knijp je voorzichtig in de huid tussen de schouderbladen om de pup op te tillen.
      OPMERKING: Trek niet te veel huid van de rug van de pup, omdat dit verstikking kan veroorzaken.
    3. Houd de pup in een bijna horizontale positie en steek de voedernaald voorzichtig in de mondholte, waarbij deze loodrecht op de farynx wordt verplaatst totdat deze de achterkant van de keel bereikt (Figuur 1C).
    4. Terwijl je dezelfde hoek en diepte behoudt, schuif je de naald naar het rechter- of linkerdeel van de mondholte om de tong te vermijden.
    5. Pas langzaam de hoek van de naald aan terwijl je het hoofd van de pup voorzichtig naar achteren kantelt, totdat de spuit, kop en rug uitgelijnd zijn, met het hoofd licht naar achteren gekanteld (Figuur 1D).
    6. Laat de spuit zonder druk langzaam onder eigen gewicht zakken totdat het maximale inzetpunt dicht bij of op snuithoogte ligt (Figuur 1E).
      OPMERKING: Als er weerstand is, draai dan voorzichtig de spuit door deze heen en weer tussen de vingers te draaien om de daling te vergemakkelijken. Als de spuit nog steeds niet vooruitgaat, probeer dan de inbrenghoek aan te passen of herstart de procedure met een voedingsnaald die is gesmeerd met de gavage-oplossing. De naald mag niet langer dan 20 seconden worden ingebracht om verstikking te voorkomen.
    7. Zodra het maximale inzetpunt is bereikt of dicht is, doseer je snel het gewenste volume. Als er weerstand is tijdens het doseren, controleer dan de uitlijning van de spuitkop en achterkant en pas de diepte van de inzet iets aan.
      OPMERKING: Snel doseren van het volume wordt aanbevolen, omdat langdurige naaldinsteek het risico op verstikking, worstelen en mogelijke letsel van het dier aanzienlijk verhoogt.
    8. Zodra het juiste volume is toegediend, trek je de naald voorzichtig terug langs dezelfde hoek als voor het inbrengen.
    9. Leg de pup op het papieren handdoekje dat eerder op het verwarmingskussen ligt gelegd en houd het herstel in de gaten. Een normaal ademhalingspatroon zou binnen 20 seconden terug moeten zijn.
      OPMERKING: Appareren van bellen uit de snoot of mond van het dier duidt op aspiratie en vereist onmiddellijke euthanasie bij jongeren jonger dan DOL 14. De aanwezigheid van een zeer kleine hoeveelheid bloed in de mond van het dier, veroorzaakt door een laesie tussen de orofarynx en de slokdarm, vereist monitoring van het dier, maar geen systematische euthanasie. Als het herstel van de pup onzeker is, leg hem dan op zijn zij. Als het niet probeert zichzelf recht te zetten, euthanace dan onmiddellijk.
    10. Zodra het herstel van het dier is bevestigd, plaats je de welp terug in het nest en groepeer je het met de moeder.
      OPMERKING: Tot DOL 10 hebben pups weinig mobiliteit en kunnen ze op het verwarmingskussen blijven totdat de gavage van elke pup in de kooi is voltooid. Oudere pups mogen niet onbeheerd op het pad worden gelaten, omdat ze kunnen proberen te ontsnappen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Gavage van pasgeboren muispup bij DOL 10. De afstand tussen de snuit en het xyphoïedproces wordt gemeten (A), waardoor de maximale inbrengingslengte op de voedingsnaald (B) kan worden gemarkeerd. De voedingsnaald wordt in het linker- of rechterdeel van de mondholte (C) geplaatst. Zodra de achterkant van de keel is bereikt, wordt de hoek van de naald aangepast totdat de spuit, kop en achterkant van het dier uitgelijnd zijn (D). De naald mag voorzichtig zonder weerstand naar beneden glijden totdat het maximale insteekpunt bijna is bereikt of bereikt (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Neonatale muizenpup-euthanasie en dikke darm-terugtrekking

  1. Voer euthanasie uit volgens de juiste methode die door de nationale wetgeving is voorgeschreven.
    OPMERKING: Onthoofding van pups tot DOL 10 en cervicale ontwrichting van pups van oudere leeftijd boven DOL 10 wordt aanbevolen. Euthanasie metCO2 of anesthetica wordt niet aangeraden, omdat pups een grote tolerantie voor deze methoden tonen.
  2. Plaats het geëuthanaseerde dier onder een verrekijkermicroscoop.
  3. Breng 70% ethanol aan op de buik van het dier.
  4. Met een tang knijp je de buikhuid en het onderliggende buikvlies en maak je een grote dwarse incisie in de buik met fijne schaar (loodrecht op de rostral-caudale as) zonder de darm door te snijden.
  5. Steek de fijne schaar voorzichtig in de incisie en steek de snede zijwaarts door het buikvlies aan beide zijden.
  6. Met een tang en een fijne schaar snijdt u zowel de bovenste als de onderste delen van het peritoneum open, van het thoracale gebied tot het onderste bekkengebied (Figuur 2A).
  7. Identificeer het distale deel van de dikke darm en maak een incisie parallel aan de as, richting het rectum.
  8. Maak een incisie in het terminale/rectale deel van de dikke darm om het te mobiliseren.
  9. Trek voorzichtig aan de dikke darm en beweeg richting het cekum, waarbij je eventuele stukjes bindweefsel of vetweefsel verwijdert.
  10. Maak de dikke darm los van het achterlijf door te snijden bij de ileocecale overgang, boven het cekum, (Figuur 2B).
  11. Verwijder het cekumum en de eerste paar millimeters van de proximale colon, en verzamel vervolgens één tot twee monsters uit de proximale colon die groter zijn dan de opening van de Ussing-schuif (Figuur 2C).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om twee oversized biopten te plaatsen, omdat de neonatale colon extreem fragiel is en tijdens het reinigen en monteren gemakkelijk kan worden gescheurd, gescheurd of doorboord.
  12. Met de schaar dicht verwijder je voorzichtig de fecale inhoud van de afgeplatte biopsie door lichte druk uit te oefenen en van het proximale naar het distale uiteinde te schuiven.
  13. Plaats het lege stuk dikke darm in een ijskoude KRB-buffer.

figure-protocol-2
Figuur 2: Dissectie van de dikke darm van DOL 10 pup. De epidermis en het buikvlies van de jongen worden in twee stappen doorgesneden en geopend om onwillekeurige incisie in de dikke darm te voorkomen, totdat de hele buikholte blootgelegd is (A). De dikke darm wordt uit de buik bevrijd via een eerste snede in het distale/rectale gedeelte, gevolgd door een tweede snede boven het cekum. De initiële millimeters van de proximale colon worden weggegooid, en één tot twee colonmonsters groter dan de opening van de Ussing-sliders worden verzameld (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Colonische permeabiliteitstest met behulp van muizenbiopten in Ussing-kamers

  1. Voorbereiding van de assay
    1. Op de dag vóór de dag van het Ussing-experiment. Om optimale assayomstandigheden te garanderen, wordt het voorbereiden van meerdere oplossingen op de dag vóór het experiment aanbevolen. Deze oplossingen worden voorbereid zoals aangegeven in Tabel 1.
      OPMERKING: de volgende tabellen geven de benodigde hoeveelheden aan voor 12 Ussing-kamers, waarbij KRB 10x in grote overschrijding is om aliquotatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: De KRB 10x-oplossing kan tot 6-12 maanden worden bewaard bij 4 °C.
    2. Op de proefdag, 30 minuten voor de euthanasie van de dieren:
      1. Bereid 400 mL KRB-buffer voor, zoals geïnstrueerd in Tabel 2.
        OPMERKING: De KRB 10x, gedeïoniseerd water en bicarbonaat moeten vooraf worden gemengd en gebubbeld met carbogengas (95% O2; 5% CO2) gedurende 15 minuten voordat CaCl2 wordt toegevoegd om neerslag te voorkomen.
      2. Met een carbogensysteem (95% O2; 5%CO2) laat je de verse KRB-buffer 15 minuten bubbelen.
      3. Splits de 400 mL KRB-buffer in tweeën en bereid 200 mL Krebs-glucose, 200 mL Krebs-Mannitol en de HRP-oplossing zoals beschreven in Tabel 3.
    3. Ussing-systeemopstelling
      1. Verwarm het Ussing-systeem voor tot 37 °C.
      2. Stel de kamers als volgt vooraf samen:
        1. Tilt de sluitingen van elke gleuf op.
        2. Plaats de kamers in hun sleuven zonder het systeem strakker aan te draaien.
        3. Steek de twee gasvoorzienende buizen in elk deel van de kamers.
        4. Breng de vier elektroden in de vooropeningen (indien beschikbaar - hier niet behandeld) of sluit de vier openingen af met 200 μL kegels gevuld met lijm voorafgaand aan het experiment.
        5. Plaats trays onder de kamers in afwachting van mogelijke lekkages.
      3. Tissuemontage
        1. Droog het eerder schoongemaakte dikke darmmonster licht met een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen.
        2. Plaats het stuk dikke darm onder een vergrootglas en steek heel voorzichtig een van de bladen van de fijne schaar in het luminale deel om het open te snijden (Figuur 3A).
          OPMERKING: De knip kan in één beweging worden gemaakt zodra de schaar volledig is ingebracht. De gebruikte colonsectie moet zo recht mogelijk zijn zonder torsie.
        3. Met fijne pincetten monteer je het weefsel op het witte deel van de schuif terwijl je het luminale deel omhoog houdt, naar de gebruiker toe. Het weefsel moet vrij zijn van sporen van vet, ontlasting, rimpels, perforaties en snijwonden, en moet de opening breed bedekken (Figuur 3B).
        4. Sluit de schuifregelaar onder de verrekijker en controleer op mogelijke verplaatsing van het weefsel. Een lichte vervorming van het weefsel moet zichtbaar zijn wanneer er druk op de schuif wordt uitgeoefend, wat aangeeft dat de schuif stevig gesloten is.
          OPMERKING: Installeer de schuifstukken in de Ussing-kamer (Figuur 4) en start de evenwichtsstap afzonderlijk zodra deze klaar is, om uitdroging van het monster te voorkomen.
        5. Terwijl je lichte druk op de schuif houdt om deze gesloten te houden, steek je de schuif in de Ussing-kamer, zodat de lumen (het transparante deel van de schuif) naar links is gericht.
        6. Sluit beide sluitingen en draai de schroef aan de rechterkant totdat de kamer waterdicht is en de schuif niet kan bewegen.
      4. Laatste opstelling en balancering
        1. Voeg 4 ml Krebs-Mannitol toe aan het linker (apicale) compartiment van de kamer.
        2. Voeg 4 ml Krebs-Glucose toe aan het rechter (basolaterale) compartiment van de kamer.
        3. Plaats een klein stukje parafilm tussen beide compartimenten om kruisbesmetting te voorkomen.
        4. Open de gasinlaat (95% O2 / 5% CO2) en stel de output in tussen 1-2 belletjes per seconde.
        5. Verwijder grote belletjes op het weefsel of in het systeem met een Pasteur-pipet.
        6. Laat het systeem tot 20-30 minuten in balans zijn.
        7. Bereid de FITC 4kDa + HRP + Mannitol oplossing voor zoals beschreven in Tabel 4.
  2. Start van de colonische permeabiliteitstest
    1. Zodra het evenwicht van het systeem is bereikt, vervang je 200 μL Krebs-Mannitol uit het apicale compartiment (links) door 200 μL FITC 4Kd + HRP + Mannitol-oplossing en start onmiddellijk een timer. Was de punt door zachtjes op en neer te gaan in het compartiment en gooi de punt tussen de kamers weg.
    2. Voor elke kamer verzamel je 2 x 100 μL (duplicaten) uit het basale (rechter) compartiment en plaats je de volumes in een zwarte 96-wellplaat. Bedek de plaat met aluminiumfolie om fotodegradatie van de aanwezige FITC in de plaat te voorkomen.
    3. Vervang onmiddellijk de eerder verzamelde 200 μL door 200 μL verse Krebs-Glucose.
    4. Herhaal de stappen (2) en (3) elke 30 minuten totdat het 2-uurstijdstip is bereikt, om de tijdspalken te verkrijgen: T0, T30, T60, T90 en T120.
    5. Sluit de plaat af met aluminiumfolie om fotodegradatie van de FITC te voorkomen en ga door met de kwantificering van de FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Eindvolume = 20 mLEindconcentratie
milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Eindvolume = 1LEindconcentratie
milli-Q H20Breng naar het laatste deel
NaCl58.4470 g1.198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO4 , 2H2O177.991 g5,62 mM
NaH2PO4 , 2H2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Bicarbonaat 750 mM
MW (g/mol)Eindvolume = 250 mLEindconcentratie
milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Eindvolume = 50 mLEindconcentratie
milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
CaCl211111,098 g2 M

Tabel 1: Oplossingsvoorbereiding op de dag voorafgaand aan het Ussing-experiment.

KRB-buffer (400 mL)
VolumeEindconcentratie
KRB 10X40 mL1X
H2O (milli-Q)352 mL
Bicarbonaat 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tabel 2: KRB-buffervoorbereiding op de dag van het Ussing-experiment.

Krebs-glucose/mannitol (200 mL elk)
Eindvolume = 200 mLEindconcentratie
KRB BufferBreng naar het laatste deel
Glucose360 mg10 mM
of
Mannitol364 mg10 mM
HRP-oplossing
Eindvolume = 1480 μLEindconcentratie
Krebs-MannitolBreng naar het laatste deel
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tabel 3: Bereiding van Krebs-glucose/mannitol en HRP-oplossingen op de dag van het Ussing-experiment.

FITC 4kDa + HRP + Mannitol-oplossing
Voor 12 kamersVolumeEindconcentratie
HRP (8,8 mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tabel 4: Bereiding van FITC 4 kDa + HRP + mannitoloplossing op de dag van het Ussing-experiment.

figure-protocol-3
Figuur 3: Montage van een darmmonster van een DOL 9 pup. Een blad van een fijn paar schaar wordt in het luminale segment van het monster gestoken om het in één beweging (A) te knippen. Het geopende monster is gemonteerd op de Ussing-schuifdiafragma met de luminale zijde naar de operator (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Afbeelding van volledig voorbereide Ussing-kamers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beoordeling van colonische paracellulaire permeabiliteit via FITC-kwantificatie

  1. Voorbereiding van FITC-standaarden
    1. Verdun de FITC 4Kd + HRP + Mannitol-oplossing in Krebs-Glucose om de standaardverdunningen te maken zoals beschreven in Tabel 5 en Figuur 5.
    2. Plaats 2 x 100 μL (duplicaat) van elke standaardverdunning van n°1 tot en met n°7 in de plaat. Sluit de plaat af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht totdat het plaatlezen begint.
  2. Gegevensverwerving: Gebruik een plaatlezer om de excitatiegolflengte in te stellen op 485 nm en de emissie op 535 nm, en lees de plaat zo snel mogelijk uit.
    OPMERKING: Het aflezen van de plaat zowel op optimale versterking als met een handmatig ingestelde versterking wordt aanbevolen om de vergelijking tussen plaatwaarden te vergemakkelijken en om interpolatie van gegevens mogelijk te maken als er een fout is gemaakt tijdens standaardverdunningen.
  3. Plaatopslag: Zodra de kwantificatiegegevens van FITC zijn opgeslagen, worden de platen 's nachts met aluminiumfolie op 4 °C opgeslagen als HRP-kwantificatie in de daaropvolgende dagen wordt uitgevoerd, of bevroren bij -80 °C voor langere opslag.

figure-protocol-5
Figuur 5: Visuele weergave van de voorbereiding van FITC-standaardverdunningen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

FTIC-standaardverdunningen
N°1234567
Verdunning1:10000 FITC-kolfoplossing1:2 van verdunning nr. 11:2 van verdunning nr°21:10 van verdunning nr. 11:2 van de verdunning nr°41:2 van de verdunning nr°5
Krebs-glucose
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tabel 5: Bereiding van FITC-standaardverdunningen op de dag van het Ussing-experiment.

5. Beoordeling van colonische transcellulaire permeabiliteit door HRP-kwantificatie

  1. Op de dag vóór de dag van de HRP-kwantificatietest:
    1. Zorg voor optimale omstandigheden op de dag van de assay; Voorbereiding van verschillende oplossingen is vereist op de dag voorafgaand aan het experiment. Deze oplossingen zijn voorbereid zoals beschreven in Tabel 6.
      OPMERKING: De volgende tabellen geven de benodigde hoeveelheden aan voor één plaat met 96 putten. HRP-standaarden kunnen worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C of -80 °C tot enkele maanden. Vanwege instabiliteit kun je alleen verse carbonaat-/bicarbonaatbuffers gebruiken.
    2. Na de voorbereiding van de anti-HRP-antilichaamoplossing wordt onmiddellijk een Clear 96-well Clear Flat Bottom High Binding microplate met 100 μL per put bedekt. Wikkel het in aluminiumfolie en laat het een nacht incuberen op 4 °C.
  2. Op de dag van de HRP-kwantificatietest:
    1. Bereid de 5% BSA Blocking buffer voor zoals beschreven in Tabel 7.
    2. Gooi de inhoud van het bord weg en was 4 keer met 280 μL PBS Tween, met 1 minuut schudden op 350 rpm tussen elke was.
    3. Voeg 200 μL BSA-blokkeringsbuffer toe aan elke put.
    4. Sluit de plaat af met aluminiumfolie en incubeer op een shaker bij 500 toeren per minuut gedurende minimaal 1 uur. In de tussentijd ontdooien en verdun je monsters (1:10 of 1:50) en bereid je de standaardverdunningen voor zoals beschreven in Tabel 8.
    5. Gooi de inhoud van het bord weg en was 4 keer met 280 μL PBS Tween, met 1 minuut schudden op 350 rpm tussen elke was.
    6. Voeg 50 μL standaard of verdunde monsters toe, sluit de plaat af en incubeer op 300 rpm gedurende 1 uur bij RT.
    7. Breng tijdens de incubatie de QuantaBlu-reagentia naar RT en bereid de werkoplossing voor zoals beschreven in Tabel 9.
    8. Gooi de inhoud van het bord weg en was 4 keer met 280 μL PBS Tween, met 1 minuut schudden op 350 rpm tussen elke was.
    9. Voeg 100 μL QuantaBlu Working Solution toe aan elke put bij RT of 37 °C (gemiddeld 1,5-90 min, 30 min).
      OPMERKING: De voortgang van de assay kan gevolgd worden door het verschijnen van een sterke blauwe fluorescentie onder een UV-lichtbron.
    10. Voeg 100 μL QuantaBlu Stop Solution toe aan elke put om de peroxidaseactiviteit te stoppen. Sluit de plaat af en incubeer 10 minuten bij RT onder schudding op 350 rpm.
    11. Met een plaatlezer stel je de excitatiegolflengte in op 315 nm en de emissie op 470 nm. Lees het kenteken zo snel mogelijk.
      OPMERKING: Het aflezen van de plaat zowel op optimale versterking als met een handmatig ingestelde versterking wordt aanbevolen om de vergelijking tussen plaatwaarden te vergemakkelijken en om interpolatie van gegevens mogelijk te maken als er een fout is gemaakt tijdens standaardverdunningen. Als alternatief voor de QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substratekit kunnen andere peroxidasesubstraten zoals Tetramethylbenzidine worden gebruikt (gemeten op respectievelijk 450 of 650 nm met of zonder stopoplossing), maar het gebruik van dit alternatief gaat ten koste van een lagere gevoeligheid.
BSA-oplossing
MW (g/mol)Eindvolume = 12,7 mLEindconcentratie
Milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glucose + BSA
MW (g/mol)Eindvolume = 30 mLEindconcentratie
Krebs-glucoseBreng naar het laatste deel
BSA-oplossing60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Eindvolume = 500 mLEindconcentratie
PBS 1XBreng naar het laatste deel
Tween-20500 μL0.1%
Natriumcarbonaat sol.
MW (g/mol)Eindvolume = 3,22 mLEindconcentratie
Milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Natriumbicarbonaat sol.
MW (g/mol)Eindvolume = 12,7 mLEindconcentratie
Milli-Q H2OBreng naar het laatste deel
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Coatingbuffer pH 9,6
Eindvolume ≈ 11 mL
Natriumcarbonaat sol.2,58 mL
Natriumbicarbonaat sol.Voeg toe tot pH = 9,6 (~8,4 mL)
10 μM HRP Standaard
Initiële concentratieEindvolume = 5 mLEindconcentratie
Krebs-glucoseBreng naar het laatste deel
HRP-oplossing8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
BSA-oplossing100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
1,5 nM HRP Standaard
Initiële concentratieEindvolume = 15 mLEindconcentratie
Krebs-glucoseBreng naar het laatste deel
2,0 μM HRP Standaard0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
BSA-oplossing0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Anti-HRP antilichaamoplossing
Initiële concentratieEindvolume = 10 mLEindconcentratie
CoatingbufferBreng naar het laatste deel
Anti-HRP-antistoffen5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tabel 6: Oplossingsvoorbereiding op de dag voorafgaand aan het HRP-experiment.

BSA-blokkeringsbuffer
Initiële concentratieEindvolume = 25 mLEindconcentratie
PBS 1X12,5 mL
BSA-oplossing100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tabel 7: BSA-blokkeringsbuffervoorbereiding op de dag van het HRP-experiment.

StandaardKrebs-Glucose + BSA1,5 nM HRP StandaardFmol HRP/50 μL
Leeg1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tabel 8: HRP-standaardvoorbereiding op de dag van het HRP-experiment.

QuantaBlu Werkoplossing
Eindvolume = 12 mL
QuantaBlu Substraatoplossing10,8 mL
QuantaBlu stabiele peroxideoplossing1,2 mL

Tabel 9: QuantaBlu werkoplossing voorbereiding op de dag van het HRP-experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificatie van standaardcurve en putconcentraties
De gemiddelde waarde van de blanks werd van elke put van de plaat afgetrokken. Met absorptiewaarden op de Y-as en concentraties op de X-as werd een standaardcurve gemaakt met behulp van de functie "Interpoleren een standaardcurve" van GraphPad Prism. Als alle standaardpunten zijn uitgelijnd, levert het "Line"-model de beste resultaten op. Alternatief biedt het model "Sigmoidal, 4 PL, X is concentratie" grote flexibi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Orale gavage maakt herhaalde toediening van een precieze, gedefinieerde luminale dosis aan individuele neonatale muizen mogelijk. Daarentegen vereist vrijwillig voeren, hoewel een haalbaar alternatief, een langere toedieningstijd per dier om een lagere hoeveelheid stof te geven met een verlaagde doseringsprecisievan 12. Bovendien biedt orale gavage grotere volumes op dan mogelijk via injecteerbare routes, waardoor hogere totale doses bij lagere concentrat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd uitgevoerd met financiële steun van het ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, een prijs van de Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012) en ANR-subsidies Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). De studie werd uitgevoerd binnen de context van het INFIBREX-consortium en profiteerde van de steun van het investeringsplan "France 2030", gelanceerd door de Franse overheid en uitgevoerd door de Université Paris Cité onder het "Initiative of Excellence" IdEx-programma (ANR-18-IDEX-0001). Wij danken het Ussing Chamber Technical Platform van het Inflammation Research Center van harte voor hun onschatbare ondersteuning en spreken speciaal hun dank uit aan Alexandra Willemtz en Maude Le Gall voor hun deskundige hulp. We willen ook onze oprechte dank uitspreken aan het Animal Facility Platform van het Inflammation Research Center voor hun essentiële steun, met speciale dank aan Isabelle Renault en Guillaume Anselmet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x DPBS W/O Ca & MgDulbeccos14200091
Anti-HRP antibodyNordic BiositeGTX10183Monoclonal Mouse Horseradish Peroxidase IgG [2H11]
Binocular loepOlympus SZ61Geen specificatie vereist.
Zwarte 96-well plaat met platte bodemThermoFisher Scientific137101Platen moeten zwart zijn en aangepast zijn aan fluorescentiemetingen. De deksel moet tijdens het lezen worden verwijderd.
BSAMerckA4503
C57BL/6J muizenCharles River632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Duidelijke 96-well plaat met platte bodem, hoge bindingCorning9018
D-(+)-GlucoseMerckG8270 
Gedestilleerd H2O
D-MannitolMerckM4125
Fijne pincetFST11445-12
Fijne schaarFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4TdB LabsGevoelig voor fotodegradatie.
VerwarmingskussenMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
P2300 EasyMount Ussing Systeem & KamersPhysiological InstrumentsEM6-C-CESystemen, kamers en schuifregelaars moeten allemaal compatibel zijn.
P2306 Ussing Chamber SliderPhysiological InstrumentsPI-P2306Er zijn verschillende modellen schuifregelaars beschikbaar voor verschillende maten en vormen van weefsels.
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase SubstraatkitThermoFisher Scientific15169
Herbruikbare voedingsnaalden met ronde puntFST18061-2424 Gauge, 1,25mm puntdiameter, ronde punt. Moeten worden gewassen met steriel water, ethanol 70% en worden geautoclaveerd voor gebruik.
NatriumbicarbonaatMerckS6297
NatriumcarbonaatMerckS7795
SpectrofotometerTECAN Spark 10MEen platenlezer met top-acquisitie is vereist als de 137101 zwarte platen worden gebruikt.
Tween-20MerckP7949

Referenties

  1. Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
  2. Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
  3. Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
  4. An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
  5. Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
  6. Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
  7. Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
  8. Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
  9. Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
  10. Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
  11. Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
  12. Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
  13. McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
  14. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
  15. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  16. Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
  17. Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
  18. Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
  19. Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
  20. Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
  21. Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ColonpermeabiliteitFITC-dextraan-assaymierikswortelperoxidaseparacellulaire permeabiliteittranscellulaire permeabiliteitmicroRNA-therapeutica
Orale Gavage bij neonatale muispups en functionele beoordeling van de integriteit van darmbarrières met behulp van Ussing-kamers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.