Methodenartikel

Een vereenvoudigde methode voor agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora

DOI:

10.3791/69753

⸱

20 maart 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een eenvoudig, effectief en reproduceerbaar protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora, dat ook toepasbaar is op P. capsici.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora is een geslacht oomyceten dat talrijke destructieve plantenpathogenen bevat, waaronder de breed gastheer zijnde soort P. palmivora. De functionele genomica van Phytophthora is beperkt door de beperkte beschikbaarheid van robuuste, gemakkelijk te implementeren transformatiemethoden. Onder de beschikbare benaderingen is Agrobacterium-gemedieerde transformatie (AMT) bijzonder aantrekkelijk omdat het minimale gespecialiseerde apparatuur vereist en vaak stabiele transformanten produceert met enkelvoudige geninserties. De meeste AMT-protocollen voor schimmel- en oomycetentransformatie gebruiken minimale medium (MM) zouten in Agrobacterium-inductie - en co-teeltmedium. Het bereiden van deze media omvat doorgaans het maken en mengen van meerdere bouillonoplossingen, waarvan sommige meerdere componenten met verschillende concentraties bevatten. Het proces is tijdrovend en foutgevoelig, wat leidt tot inconsistente transformatie-succes. Hier presenteren we een gestroomlijnd, eenvoudig en reproduceerbaar AMT-protocol voor P. palmivora dat gebruikmaakt van commercieel verkrijgbare Murashige en Skoog (MS) basaal medium om het Agrobacterium inductie- en co-teeltmedium te bereiden. Dit protocol is ook met succes toegepast om P. capsici te transformeren en kan ook worden toegepast op andere Phytophthora-soorten .

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora, een geslacht van oomyceten, omvat veel van 's werelds meest destructieve plantpathogenen en is verantwoordelijk voor ernstige economische verliezen 1,2. Onder hen is Phytophthora palmivora een ziekteverwekker met een breed gastheergebied dat veel economisch belangrijke gewassen infecteert, waaronder cacao en papaya3. Het is de meest voorkomende oorzaker van zwarte peulrot in cacao, een tropische vaste boom die het belangrijkste bestanddeel van de miljardenindustrie vanchocolade produceert. Het begrijpen van de moleculaire pathogeniciteitsmechanismen van deze destructieve pathogeen is cruciaal voor het ontwerpen van nieuwe, effectieve ziektebestrijdingsstrategieën, en genetische transformatie is een essentieel hulpmiddel om dergelijke onderzoeken mogelijk te maken.

Verschillende methoden zijn ontwikkeld om Phytophthora-soorten te transformeren, waaronder microprojectielbombardement7, polyethyleenglycol en calciumdichloride (PEG/CaCl2)-gemedieerde protoplasttransformatie 8,9,10,11, zoospore-elektroporatie 12,13,14, en Agrobacterium-gemedieerde transformatie (AMT)15,16. Onder deze benaderingen biedt AMT belangrijke voordelen omdat het doorgaans enkelvoudige genintegratiegenereert 15,16 en relatief eenvoudig uit te voeren is zonder gespecialiseerde apparatuur.

Er is eerder een protocol ontwikkeld voor efficiënte transformatie van P. palmivora met AMT. Met deze methode hebben we P. palmivora succesvol getransformeerd met meerdere constructen17,18. Deze methode maakt gebruik van minimaal medium (MM) zout gebaseerde Agrobacterium inductie- en co-teeltmedia, die vaak worden gebruikt voor schimmel- en oomycetentransformatie 15,16,19. Hoewel het MM-gebaseerde transformatieprotocol effectief bleek bij het genereren van transformanten, kan het voorbereiden van meerdere stockoplossingen en het combineren ervan om media te maken een taak zijn die zowel tijdrovend als foutgevoelig is.

Hier presenteren we een sterk vereenvoudigde methode voor AMT van P. palmivora door gebruik te maken van commercieel Murashige en Skoog (MS) basaal medium ter vervanging van de MM-zoutgebaseerde mediumcomponenten in het Agrobacterium inductie- en co-teeltmedium16. Deze methode elimineert de noodzaak om meerdere chemische voorraadoplossingen te bereiden, waardoor het proces minder tijdrovend en zeer reproduceerbaar wordt. Bovendien lijkt deze benadering een hogere transformatie-efficiëntie te leveren vergeleken met de eerder beschreven methode16, en is ook toepasbaar op P. capsici.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van voorraadoplossingen, media en andere materialen die nodig zijn voor de transformatie

  1. Oplossingen voor antibioticavoorraad
    1. Bereid bouillonoplossingen voor van kanamycine (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) en cefotaxime (100 mg/mL): Los de juiste hoeveelheden van de antibiotica op in water, filtersteriliseer de oplossingen, bereid 1-mL aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
    2. Maak een voorraadoplossing van rifampicine (15 mg/mL): Los de juiste hoeveelheid rifampicine op in DMSO, bereid 1-mL aliquots, wikkel ze in folie en bewaar ze bij -20 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat chemische oplossingen die in DMSO zijn bereid worden gefiltersteriliseerd met spuitfilters van DMSO-compatibele materialen, zoals nylon of PTFE (Teflon).
  2. Media voor de groei van Agrobacterium
    1. Luria-Bertani (LB) vloeibare media: Om 250 mL medium te bereiden, voeg 6,25 g LB-poeder toe aan 250 mL water, autocaaf de oplossing en bewaar deze op kamertemperatuur (RT).
    2. LB agar media: Om 250 mL medium te bereiden, voeg 6,25 g LB-poeder en 3,75 g agar toe aan 250 mL water, autocaaf de oplossing en bewaar bij RT. Voeg geschikte antibiotica toe aan de gesmolten LB-agar voordat je de platen maakt. Bewaar de platen met antibiotica aangevuld bij 4 °C.
  3. Media voor groei en transformatie van P. palmivora
    1. 10% V8 agar: Om 500 mL te bereiden, voeg 50 mL V8 originele 100% groentesap toe aan 450 mL water. Voeg daarna 0,5 g CaCO3 toe aan de suspensie en roer om het goed te mengen. Autoclaveer de oplossing en giet het op borden.
      OPMERKING: Voeg indien nodig de juiste antibiotica toe. Bewaar de platen met antibiotica aangevuld bij 4 °C.
    2. Halfsterkte Murashige en Skoog (1/2 MS) vloeibaar medium: Voeg 2,15 g Murashige en Skoog basaal medium (MS) toe aan 950 mL water, stel de pH aan naar 5,6 met 1 N KOH, en voeg water toe tot 1 L. Gebruik direct om 1/2 MS agar te maken (stap 1.3.3), autoclave de resterende 1/2 MS vloeistof en bewaar het bij RT.
    3. 1/2 MS agar voor Agrobacterium-zoospore co-cultivation agar (AZCA): Om 600 mL AZCA te bereiden, meng 567 mL 1/2 MS vloeistof uit stap 1.3.2 met 9 g agar. Autoclaveer de oplossing en sla die op bij RT.
    4. 50% glycerol: Meng 50 ml glycerol met 50 ml water, autocaaf de oplossing en bewaar het bij RT.
    5. 1M MES (pH 5,6): Om 200 mL te bereiden, voeg je 39,048 g MES Hydrate toe aan 160 mL water, en stel je vervolgens de pH aan naar 5,6 met NaOH-oplossing. Voeg vervolgens water toe tot 200 mL, steriliseer de oplossing met filter en bewaar het bij RT onder donkere omstandigheden.
      OPMERKING: MES lost geleidelijk op naarmate de pH stijgt. Gebruik in het begin 10 N NaOH om de pH dicht bij 5,6 te brengen, wat het poeder bijna zal oplossen. Voeg vervolgens 1 N NaOH toe om de pH exact op 5,6 te brengen.
    6. 20% glucose: Los 10 g glucose op in 40 ml water, voeg vervolgens water toe tot 50 mL, filter de oplossing met een filter en bewaar het bij RT.
    7. 200 mM Acetosyringon (AS): Los 40 mg 4'-Hydroxy-3', 5'-dimethoxyacetophenon op in 1 mL DMSO (zie NOOT onder 1.1.2) en bedek de oplossing met folie. Maak het fris op de dag van de transformatie.
    8. Agrobacterium inductiemedium (AIM): Om 40 mL medium te bereiden, voeg 400 μL 50% glycerol, 400 μL 20% glucose, 1,6 mL 1 M MES (pH 5,6), 40 μL 200 mM AS toe aan 37,6 mL 1/2 MS vloeibare (pH 5,6) oplossing (bereid in stap 1.3.2) in een steriele 50 mL buis. Meng de oplossing goed, bedek de tube met folie en gebruik hem binnen enkele uren vers.
    9. Agrobacterie-zoospore co-teeltagar (AZCA): Om 600 mL van de agar te bereiden, voeg 6 mL 50% glycerol, 3 mL 20% glucose, 24 mL 1 M MES (pH 5,6), 600 μL 200 mM AS toe aan autoclaven en gesmolten 567 mL 1/2 MS agar (pH 5,6) (bereid in stap 1.3.3). Giet de oplossing op borden en bedek deze met een zwarte doek om het licht te beschermen.
      OPMERKING: Voeg de chemische oplossingen toe aan gesmolten 1/2 MS agar (stap 1.3.9) wanneer de temperatuur 55-60 °C is. Doe de lampen in de motorkap uit tijdens stappen 1.3.7-1.3.9, want AS is lichtgevoelig. Voer deze drie stappen uit op de dag van de transformatie.
    10. Plich agar: Om 1 L van de agar te bereiden, voeg je in 950 ml water 0,5 g KH2PO4, 0,25 g MgSO4,7H 2O, 1 g L-asparagine, 5 g glucose, 0,5 g gistextract, 10 μL thiamine (100 mg/mL in water, bewaard bij 4 °C), 10 mg β-sitosterol toe (oplos in 3 mL ethanol voor toevoeging). Roer de oplossing om alle ingrediënten op te lossen, voeg dan water toe om het volume tot 1 L te maken. Verdeel de oplossing in porties van 500 ml en voeg 7,5 g agar toe aan elke 500 mL. Autoclave de oplossing, voeg de juiste antibiotica toe wanneer de temperatuur daalt tot 55 °C, en giet het dan op borden.
    11. Hybond N+ membraan: Snijd het membraan met de beschermplaten in stukken van 5 cm x 6 cm, wikkel de stukken in aluminiumfolie en autocaaf ze. Terwijl je het geautoclaveerde membraan op AZCA-media plaatst, behandel het met een steriele tang en gooi de beschermende doeken weg.

2. Kweek van P. palmivora

  1. Zeven tot acht dagen voor de transformatie kweek je P. palmivora papaja-isolaat P116 op vers gemaakte 10% V8 agarplaten door één agarplug van een eerder gekweekte Phytophthora-cultuur (of uit de bouillon) op het midden van de petrischaal te plaatsen.
    OPMERKING: Om een hogere concentratie zoösporen te verkrijgen, is het belangrijk om vers bereide, ongezuiverde 10% V8 agar te gebruiken.
  2. Breng de platen uit bij 25 °C onder een 12-uur licht/12-uur donkercyclus gedurende 7-8 dagen tot de transformatie.

3. Bereiding van Agrobacterium tumefaciens

  1. Drie dagen voor de transformatie stamt streep A. tumefaciens EHA105 met pCB301TOR-GFP16 op een LB agarplaat, aangevuld met rifampicine (15 μg/mL) en kanamycine (50 μg/mL). Broed de plaat 2 dagen op 28 °C.
    OPMERKING: De eerste bereiding van Agrobacterium (stap 3.1) kan een week voor de transformatie plaatsvinden, en de platen kunnen na de incubatieperiode van 2 dagen bij 4 °C worden bewaard.
  2. Neem op de dag voor de transformatie een kleine hoeveelheid Agrobacterium-cellen en verspreid deze op een nieuwe LB-agarplaat die wordt aangevuld met antibiotica (zoals beschreven in stap 3.1) met de onderkant en platte basis van een steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voor gemakkelijker verspreiding voeg je 20 μL LB vloeibaar medium toe aan het midden van de LB agarplaat, meng je de bacteriële cellen met de LB media en verdeel je ze vervolgens gelijkmatig over de plaat. Broed de plaat een nacht uit bij 28 °C gedurende ongeveer 16-18 uur.
  3. Schep de cellen die 's nachts zijn gekweekt met een pipettip van 1 ml en suspendeer ze opnieuw in 1 ml Agrobacterium inductiemedium (AIM) door op en neer te pipetten. Verdun de cellen tot OD600 = 0,4 met AIM in een steriele 50 mL buis bedekt met folie. Maak minimaal 5 ml om te gebruiken voor co-incubatie met P. palmivora zoosporen (stap 5.1).
    OPMERKING: Een OD600 variërend van 0,1 tot 0,8 zou een succesvolle transformatie mogelijk maken. OD600 = 0,4 wordt routinematig gebruikt omdat deze concentratie de hoogste transformatie-efficiëntie opleverde wanneer minimaal medium (MM) zout-gebaseerde Agrobacterium-inductie - en co-teeltmedia werden gebruikt voor transformatie16.
  4. Incubeer de bacteriën bij RT onder donkere omstandigheden gedurende 1,5-2 uur op een platformshaker met zachte beweging (ongeveer 70 rpm).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de motorkapverlichting uit te laten tijdens stap 3.3 en om de dop van de 50 mL buis los te maken tijdens de incubatie (stap 3.4).

4. Het vrijlaten van de zoosporen

  1. Na 1 uur van de Agrobacterium tumefaciens-incubatie (stap 3.4) vul je een 7-8 dagen oude P. palmivora-plaat met 10 ml voorgekoeld water op 4°C, verwijder de luchtbellen op het mediaoppervlak door zachtjes met een pipettip te tikken, en incubeer de plaat op 4 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 15 minuten bij RT onder licht.
  2. Breng de vrijgekomen zoösporen (ongeveer 7-8 mL) voorzichtig over in een 15 mL steriele centrifugebuis met een pipet, zonder de mycelia en sporangia te verstoren.
  3. Om de zoosporenconcentratie te meten, breng je wat van de zoospore-suspension (bijv. 20 μL) over in een 1,5 mL microcentrifugebuis en verdun deze 10 keer met water (180 μL H2O voor 20 μL zoosporen). Vortex de buis 1 minuut om de zoösporen te omsluiten voor eenvoudig tellen, en tel daarna het aantal zoösporen onder een microscoop met een hemacytometer. Vermenigvuldig het geteld getal met een factor 10 om de concentratie van de zoospore-suspensie te bepalen die in stap 4.2 is bereid.
    OPMERKING: De concentratie van zoösporen wordt gemeten voor het berekenen van de transformatie-efficiëntie. We gebruiken doorgaans concentraties variërend van 1,5 × 106 tot 5 × 106 zoosporen per mL, met succes in de transformatie.

5. Co-incubatie van Agrobacterium en zoösporen

  1. Voeg 5 ml Agrobacterium (bereid in stap 3.4) toe aan 5 mL zoospore-suspensie (bereid in stap 4.2) aan een steriele 50 mL buis bedekt met folie. Meng voorzichtig en incubeer de buis in RT gedurende 2 uur in het donker. Houd het deksel los en schud de buis niet tijdens de co-incubatie.
  2. Tijdens de co-incubatieperiode (stap 5.1) bereidt u de AZCA-platen voor (stap 1.3.9). Wanneer het medium is gestold, plaats je één stuk gesteriliseerd Hybond N+ -membraan (voorbereid in stap 1.3.11) op elke AZCA-plaat en houd je de platen in het donker.
  3. Na 2 uur co-incubatie van Agrobacterium en zoospore (stap 5.1), smeer men 300 μL van het mengsel uit op elk Hybond N+ membraan dat bovenop de AZCA-platen is geplaatst (stap 5.2) met een pipetpunt, waarbij de randen vrij blijven van de vloeistof.
  4. Laat het mengsel ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen in de kap door de petrischalen onbedekt te laten. Bedek de platen zodra de oplossing op het membraan stopt met rondstromen.
    OPMERKING: Houd tijdens stappen 5.1-5.4 de motorkapverlichting uit. Gebruik indien nodig lampjes terwijl je het mengsel toevoegt en verspreidt op de membranen (stap 5.3).
  5. Na het aan de lucht drogen incubeer je de platen 2 dagen lang bij 25 °C in het donker.

6. Selectie van G418-resistente transformanten

  1. Na 48 uur co-incubatie (stap 5,5) wordt de Hybond N+ membranen ondersteboven overgebracht met gesteriliseerde pincetten naar Plich-agarplaten aangevuld met G418 (30 μg/mL) en cefotaxime (100 μg/mL). Trek ze bij het plaatsen van de membranen niet over het medium oppervlak terwijl je de membranen plaatst.
    OPMERKING: De concentratie van G418 voor de selectie van transformanten voor elk P. palmivora-isolaat moet worden bepaald, aangezien verschillende gevoeligheidsniveaus worden waargenomen voor verschillende isolaten. Om dit te doen, plaats je een myceliumplug van 0,5 cm diameter in het midden van Plich-agarplaten, aangevuld met een reeks G418-concentraties in stappen van 5 μg/mL, beginnend vanaf nul. Bereid drie replicateplaten voor voor elke concentratie. Incubeer de platen 7 dagen op 25 °C. Identificeer de laagste G418-concentratie die de groei van het Phytophthora-isolaat volledig remt en gebruik deze voor de selectie van transformanten.
  2. Gebruik de platte basis van een 1,5 mL microcentrifugebuis om voorzichtig over het membraan te drukken en over het oppervlak te schuiven zodat het dicht bij het medium is. Observeer de onderzijde van de platen om de aanwezigheid van luchtbellen tussen het membraan en het medium te controleren. Knijp voorzichtig de luchtbel uit, als die er is, met de platte basis van dezelfde microcentrifugebuis.
  3. Incubeer de platen onder een 12-uur licht/12-uur donkercyclus bij 25 °C gedurende 2-3 dagen.
  4. Na 3 dagen incubatie verwijder je de membranen met een steriele tang en blijf je de platen onder dezelfde omstandigheden incuberen. De membranen kunnen na 2 dagen worden verwijderd als er zichtbare kolonies op de platen verschijnen.
    OPMERKING: De transformanten verschijnen meestal binnen 1-3 dagen na het verwijderen van het membraan, maar sommige kolonies kunnen later verschijnen. Om meer transformanten te verkrijgen, houd je de platen ongeveer een week na het verwijderen van de membranen in de gaten.
  5. Breng de transformanten over op 10% V8 agarplaten met dezelfde concentratie G418 of een concentratie die met 30% is verlaagd.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door dit protocol te volgen, voerden we twee onafhankelijke experimenten uit om P. palmivora te transformeren met behulp van A. tumefaciens EHA105 die pCB301TOR-GFP16 droeg. Zoals verwacht leverde co-incubatie van zoösporen met Agrobacterium G418-resistente kolonies op Plich-agarplaten op, aangevuld met 30 μg/mL G418, terwijl er geen kolonies werden waargenomen op controleplaten zonder infectie met Agrobacterium (Figuur 1A). Het aantal G418-resistente transformanten per 107 zoosporen geproduceerd uit deze twee experimenten was respectievelijk 55 en 50 (Tabel 1), wat bijna het dubbele is van het hoogste aantal (27 ± 5) dat eerder met het eerdere protocol16 was verkregen.

Echte transformanten werden geverifieerd met twee methoden: ten eerste observatie van GFP-fluorescentie met een fluorescentiemicroscoop, en ten tweede PCR-amplificatie van een 550 bp-fragment van het EGFP-gen met Taq 2X Master Mix (NEB) met het primerpaar EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACAAGTTC-3') en EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). In experiment (Exp) 1 vertoonden 15 van de 18 G418-resistente transformanten, en in Exp 2, 17 van de 21 transformanten GFP-fluorescentie (Tabel 1, Figuur 1B). Voor de zeven G418-resistente transformanten die geen fluorescentie vertoonden uit beide experimenten, werden er drie bevestigd als echte transformanten door PCR (Figuur 1C). In totaal werd het percentage ware transformanten geschat op 90%.

Daarnaast konden we ook met succes een P. capsici pompoenisolaat, PC2024-14sz, transformeren met behulp van A. tumefaciens EHA105 die pCB301TOR-GFP bevat, volgens het protocol met een kleine aanpassing in de voorbereiding van zoospore-suspensies (de incubatietijd bij 4 °C na het onderdompelen van een 7 dagen oude P. capsici-plaat met voorgekoeld water werd verlengd tot 30 minuten). Het aantal G418 (30 μg/mL)-resistente transformanten per 107 uit één experiment was 13. Negen transformanten werden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop, en allen produceerden fluorescentie (Supplementary File 1), wat suggereert dat het echte transformanten zijn.

figure-results-1
Figuur 1: Transformatie van P. palmivora met behulp van A. tumefaciens EHA105 die pCB301TOR-GFP draagt. (A) Verschijning van G418-resistente P. palmivora-transformanten op Plich-agar, aangevuld met 30 μg/mL G418. (B) Detectie van GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop in een representatieve transformant en P. palmivora wildtype (WT) stam. Beelden werden gemaakt onder zowel bright-field (BF) als GFP-fluorescentiekanalen. (C) PCR-versterking van EGFP van vier transformanten met detecteerbare GFP-fluorescentie en zeven zonder GFP-fluorescentie. Het universele primerpaar ITS4/ITS520 werd gebruikt om het interne getranscribeerde spacer (ITS)-gebied te amplificeren om de DNA-integriteit te controleren. Transformanten zonder GFP-fluorescentie zijn gemarkeerd in vetgedrukte, onderstreepte tekst. Afkortingen: M = NEB 100 bp DNA-ladder; WT = wildtype P. palmivora P1 isolaat; N = negatieve controle PCR met H2O als sjabloon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ExperimentOD600 van AgrobacteriumZoosporenconcentratie (/mL)Zoosporevolume (mL)Aantal G418-resistente transformantenAantal transformanten met detecteerbaar GFP-signaal (Gedetecteerd / Waargenomen)Aantal G418-resistente transformanten / 107 zoösporen
10.41,8 x 1064.34315/1855
20.42,9 x 1064.66717/2150

Tabel 1: Efficiëntie van agrobacterië-gemedieerde transformatie van P. palmivora met A. tumefaciens EHA105 die pCB301TOR-GFP draagt.

Aanvullend bestand 1: GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop in wildtype (WT) P. capsici en een representatieve transformant gegenereerd met A. tumefaciens EHA105 die pCB301TOR-GFP draagt. Beelden werden gemaakt onder zowel bright-field (BF) als GFP-fluorescentiekanalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van halfsterkte Murashige en Skoog basaal medium (1/2 MS) om componenten van minimale medium (MM) zouten te vervangen die vaak worden gebruikt in Agrobacterium inductie- en co-teeltmedia voor oömyceten- en schimmeltransformatie. Het bereiden van MM-zout gebaseerde media vereist het maken van meerdere voorraadoplossingen uit verschillende afzonderlijke chemicaliën en het vervolgens combineren vandeze oplossingen. 1/2 MS bevat ook veel chemische componenten; echter, omdat MS commercieel breed verkrijgbaar is als voorgemengd poeder, is de bereiding van het medium vereenvoudigd tot het oplossen van het poeder in water. Deze aanpassing verkort de voorbereidingstijd van media aanzienlijk en minimaliseert de kans op menselijke fouten. Daarnaast verbetert het protocol de transformatie-efficiëntie, waardoor er meer transformanten zijn dan de eerder beschreven AMT-methode16. Het is ook effectief voor de transformatie van P. capsici en is waarschijnlijk toepasbaar op andere Phytophthora-soorten . Ter ondersteuning van de potentiële bredere toepasbaarheid is MS-gebaseerd medium eerder gebruikt voor co-culturing van Agrobacterium tumefaciens-stammen die AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interactief eiwit 1) en P. infestans zoosporen tot expressie brengen, waardoor succesvolle transformatie van P. infestans21 mogelijk is.

Het is belangrijk op te merken dat dit protocol een laag percentage vals-positieven kan opleveren. Van de 39 G418-resistente transformanten die werden getest met GFP-fluorescentieobservatie of PCR, vertoonden vier noch fluorescentie noch amplificatie van EGFP (Tabel 1, Figuur 1C). Aangezien gedeeltelijke integratie van T-DNA tijdens Agrobacterium-gemedieerde transformatie niet ongewoon is22,23, is het mogelijk dat alleen het deel van het T-DNA dat het NPTII-gen bevat uit plasmide pCB301TOR-GFP16 is geïntegreerd in het P. palmivora-genoom. Alternatief kunnen de vals-positieven het gevolg zijn van onvoldoende contact tussen het membraan en het selectieve medium, waardoor ontsnapping aan G418-selectie mogelijk is. Het is daarom essentieel om ervoor te zorgen dat het membraan volledig in contact blijft met het medium (stap 6.2).

Dit protocol kan verder worden vereenvoudigd. Zo kunnen bijvoorbeeld MES in Agrobacterium induction media (AIM) en Agrobacterium-zoospore co-cultivation agar (AZCA) mogelijk worden weggelaten. MES wordt vaak gebruikt als bufferingsmiddel in biochemische en moleculaire biologische experimenten om een stabiele pH te behouden; het bereiden van een 1 M MES-voorraadoplossing bij pH 5,6 kost echter voldoende tijd en verhoogt de kosten. Bij AMT van planten, zoals zoete basilicum24 en papaya25, werden vergelijkbare MS-gebaseerde Agobacterium inductie- en co-cultivatiemedia zonder MES gebruikt, wat suggereert dat MES mogelijk niet essentieel is voor de transformatie van P. palmivora . Verdere experimenten zijn nodig om te bevestigen dat het weglaten van MES de transformatie-efficiëntie niet aantast.

Al met al biedt dit vereenvoudigde protocol een praktisch en toegankelijk platform voor routinematige genetische manipulatie van P. palmivora, P. capsici en mogelijk andere oomyceten. Het ondersteunt een breed scala aan fundamentele studies, waarvan sommige translationele potentialen hebben, waaronder fluorescentielabeling van pathogenen om infectiedynamiek te volgen, het taggen van eiwitten om subcellulaire lokalisatie te onderzoeken, en functionele analyses via gerichte veranderingen in genexpressie of eiwitcoderende sequenties. In combinatie met CRISPR-gebaseerde genoombewerking wordt verwacht dat het protocol de ontleding van pathogeniteitsmechanismen en de identificatie van belangrijke virulentiefactoren in deze destructieve pathogenen zal versnellen. De resulterende inzichten zullen op hun beurt de ontwikkeling van nieuwe, op mechanismen gebaseerde ziektebestrijdingsstrategieën mogelijk maken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie wordt ondersteund door de National Science Foundation (NSF Award nr. 2418799) en het National Institute of Food and Agriculture (NIFA Award nr. 2023-67013-42262).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Microcentrifuge TubesVWR525-1126
4'-Hydroxy-3',5' dimethoxyacetophenoneTCID2666Acetosyringone (AS)
50 mL TubeGreiner Bio-one227261
Absolute EthanolFisher BioReagentsBP28184
AgarFisher BioReagentsBP1423-500
Aluminium foil
Hybond-N+ membrane (30 cm × 3 m)CytivaRPN303B
Calcium carbonateSigma-Aldrich239216-500GCaCO3
Cefotaxime sodium saltThermo Scientific ChemicalsAAJ6269006
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
DNeasy PowerLyzer Microbial KitQiagen12255-50
Forceps
Fluorescence microscopeZeissZEISS Axioscope 5 fluorescence microscope with filter set 38 HE
G418 sulfateThermo Scientific ChemicalsAC329400010
GlycerolSigma-Aldrich911046-1L
Hemacytometer (Bright-Line)Hausser Scientific
Kanamycin sulfateSanta Cruz Biotechnologysc-257635
L-Asparagine anhydrousMP BiomedicalsICN10079425
LB Broth, MillerFisher BioReagentsBP1426-2
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-Aldrich63138-250GMgSO4·7H2O
MES HydrateSigma-AldrichM2933-100G
Murashige and Skoog Basal MediumSigma-AldrichM5519-50L
Petri Dish (100 mm x 15 mm)VWR25384-342
Potassium dihydrogen phosphateSigma-Aldrich1370391000KH2PO4
RifampicinSanta Cruz Biotechnologysc-200910
Taq 2X Master MixNEBM0270L
Thiamine hydrochlorideSigma-AldrichT4625-5G
UV-Visible SpectrophotometerFisher Scientific14-385-355
V8 Original 100% Vegetable JuiceCampbell Soup Company
VortexerFisher Scientific14-955-163
WaterMolecular Biology Grade, purified using Mill-Q water purification system
Yeast ExtractACROS611805000Currently available through Thermo Scientific Chemicals
β-SitosterolSigma-Aldrich85451-100G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Agrobacterium TransformationZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

Gerelateerde artikelen