Het gepresenteerde protocol heeft als doel een cellulair model te ontwikkelen dat menselijke obesitas nabootst. Om dit te bereiken worden stamcellen uit vetweefsel van mensen gedifferentieerd tot adipocyten, die vervolgens worden vetgemaakt met een mengsel van geselecteerde vetzuren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Differentiatie en inductie van lipidendruppelopbouw in menselijke adipocyten als model om obesitas in vitro te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Obesitasgerelateerde veranderingen in vetweefsel veranderen lokale secretorische profielen en beïnvloeden interacties met andere omliggende cellen, waaronder kankercellen. De voortdurende toediening van voedingsstoffen verschuift de stofwisseling van vetcellen, waardoor ze fungeren als een lipidenreservoir. Onderzoek naar obesitasmechanismen is doorgaans gebaseerd op diermodellen, die echter geen analyse van metabole processen op cellulair niveau toestaan. Daarom is er behoefte aan het ontwikkelen van een betrouwbaar in vitro model van menselijke obesitas dat kan helpen bij het onderzoeken van veranderingen in de functie van obese adipocyten ten opzichte van hun slanke tegenhangers. Dit werk presenteert een protocol voor de differentiatie van menselijke adipocyten van hun voorlopers (adipos-afgeleide stamcellen) met behulp van een mengsel van insuline, isobutyl-1-methylxanthine, dexamethason en indomethacine. Vervolgens werden gedifferentieerde adipocyten geïncubeerd met een set vetzuren, waaronder linoleat, palmitaat en oleaat, om lipidenaccumulatie te bevorderen. Als resultaat werd een waardevol model ontwikkeld dat de hypertrofische cellen onder obesitasomstandigheden nabootst, dat gebruikt kan worden voor verdere studies.
Inleiding
Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor een breed scala aan ziekten, zoals musculoskeletale aandoeningen, hart- en vaatziekten, insulineresistentie, metabool syndroom, diabetes en geselecteerde vormen van kanker1. Obesitas is een van de meest waarneembare en onderschatte volksgezondheidsproblemen, met oorzaken die multi-elementair zijn. Kortom, obesitas wordt veroorzaakt door een disbalans tussen het geconsumeerde en verbruikte calorieën, wat resulteert in een verbeterdevetopslag. Het calorieoverschot leidt tot pathologische uitzetting en disfunctie van vetweefsel (AT), het belangrijkste element in de controle van de energiehomeostase door het lichaam.
Adipocyten zijn het belangrijkste cellulaire bestanddeel van AT3. De belangrijkste oorzaak van de groei van AT onder obesitasomstandigheden is celhypertrofie, dat wil zeggen de toename van het volume van adipocyten door een toename van de hoeveelheid vet die in cytoplasma is opgeslagen in de vorm van lipidendruppels (LD's)4. Zelfs als obesitas een complexe pathologische aandoening is, kunnen studies naar de biologische werking van adipocyten dienen als model voor het analyseren van de oorzaken en het verkennen van nieuwe behandelstrategieën. Dit benadrukt de noodzaak van een dieper begrip van de moleculaire mechanismen die veranderingen in de functie van adipocyten aandrijven, om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen gericht op obesitasgerelateerde ziekten.
De diermodellen weerspiegelen fysiologische omstandigheden het dichtstbijzijn, waardoor ze veel worden gebruikt voor in vivo studies van obesitas5. Het trekken van conclusies over fundamentele biologische processen op cellulair niveau blijft echter zeer uitdagend in zo'n meerlaags systeem, dat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert. Het in vitro onderzoek is meestal gebaseerd op het muis 3T3-L1 celmodel, dat onder geschikte omstandigheden een adipocytachtig fenotype6 verkrijgt. Desalniettemin kan dit model vanwege zijn oorsprong niet worden gebruikt voor complexere analyses, zoals co-cultuurcondities met menselijke cellen, en kunnen de resultaten niet altijd direct worden vertaald naar menselijke adipocyten. Uit al deze redenen wordt er een model gezocht dat obesitas bij mensen nabootst, en het gebruik van stamcellen (ADSC's) afkomstig van menselijke vetstoffen (ADSC's) met hun daaropvolgende differentiatie lijkt rationeel. Dit model is daarom het meest geschikt voor het bestuderen van humane adipocytenhypertrofie in vitro vanwege de lage complexiteit. Het maakt het mogelijk om parameters van een enkel celcultuurtype onder verschillende omstandigheden te vergelijken, wat in vivo niet mogelijk is vanwege de aanwezigheid van meerdere celtypen in vetweefsel.
Menselijke preadipocyten en van vetweefsel afgeleide stamcellen die uit AT zijn geïsoleerd, zijn de meest voorkomende voorbeelden voor het bestuderen van de disfunctie van dit weefsel6. Deze cellen zijn, na differentiatie, een aantrekkelijk model om LD-niveaus in adipocyten te moduleren door extra vetmaak. Desalniettemin zijn er relatief weinig studies die hypertrofie in menselijke cellen onderzoeken 7,8,9, en de meeste gebruiken slechts één type vetzuur (FA) om LD-accumulatie te induceren.
Dit protocol stelt voor om menselijke adipocyten aan te vullen met een mengsel van FA's (palmitaat, oleate en linoleate) om obesitasomgevingen na te bootsen. Dit maakt het mogelijk een instrument te ontwikkelen dat gebaseerd is op menselijke adipocyten die overladen zijn met lipiden, wat direct kan worden vergeleken met controlecellen (naïeve) vetcellen. Dit model kan vervolgens worden gebruikt om fenotypische en functionele veranderingen bij normale en hypertrofische adipocyten te bestuderen, of, indien nodig, experimenten met co-kweekcondities.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Gebruik steriele technieken om alle stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flowcelkweekkap. Zie Materiaaltabel voor details over alle reagentia en apparatuur. Het hieronder beschreven differentiatieprotocol is geschikt voor stamcellen afkomstig van humane vetweefsels en kan verschillen tussen andere celtypen en hun oorsprong. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Voorbereiding van ADSC's voor differentiatie
- Bereid ADSCs groeimedium voor (ADSCs GM): Supplement Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 1 g/L glucose met 10% foetaal runderenserum (FBS), 2 mM glutamine en antibiotica - antimycotische oplossing (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amphotericine B).
- Verwarm de ADSC's GM, fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) en trypsins/EDTA-oplossing tot 37 °C.
OPMERKING: ADSC's worden verkregen uit commerciële bronnen. Gebruik de cellen bij de vroege passages. Meerdere passages leiden tot een afname van het differentiatiepotentiaal van ADSC's10. - Verwijder aseptisch de GM van de ADSC uit de ADSC's die groeien in een T75-fles die speciaal is bestemd voor celkweek.
- Spoel de resterende ADSC's GM uit door de celkweekschaal te spoelen met 5 mL PBS.
- Haal het volledige volume PBS uit de kolf.
- Voeg 2 ml trypsine/EDTA toe aan de kweekschaal en incubeer deze op 37 °C totdat de cellen loskomen. Monitor dit proces met een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Het tikken op de kweekschotel versnelt de celafscheiding. - Blokkeer de trypsine-activiteit door 6 mL verse ADSC's GM toe te voegen.
- Verplaats het volledige volume celsuspensie van de kweekschotel naar een buis die geschikt is voor centrifugatie.
- Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het supernatant.
- Sussend cellen in 2 mL van de nieuw toegevoegde ADSC's GM.
- Bereken de celdichtheid en levensvatbaarheid met een hemocytometer of een automatische celteller.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van cellen kan worden beoordeeld met trypanblauwe kleurstofkleuring. - Zaad de cellen in het gewenste aantal putten, 15.000 cellen per put, 96-put plastic plaat in 100 μL groeimedium van ADSC.
OPMERKING: Zaadcellen altijd in duplicaat om adipocyten te verkrijgen die bedoeld zijn voor controle en incubatie met FA-condities. Afhankelijk van het type experiment kunnen ADSC's op verschillende soorten plastic borden of schalen worden gezaaid. De aanbevolen zaaidichtheid is 30.000-60.000 cellen per cm². Afhankelijk van het celnummer dat nodig is voor de volgende analyses of downstream experimenten, past u het formaat van de celkweekschotel aan voor platen met 6 of 12 putten. - Kwek de cellen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%CO2.
- Wanneer cellen 100% samenvloeiing hebben bereikt (meestal 24-48 uur na platering), induceer dan hun differentiatie in adipocyten volgens de onderstaande instructies.
OPMERKING: Het is belangrijk om een hoog niveau van celconfluentie te bereiken voordat differentiatie wordt geïnduceerd. In andere gevallen kan het de efficiëntie van differentiatie beïnvloeden. Als het voor geplateerde cellen langer dan 48 uur duurt om een hoge confluentie te bereiken, vervang dan het medium elke 3-4 dagen voor het verse groeimedium van ADSC.
2. Inductie van adipogene differentiatie
- Bereid differentiëringsmedium voor (DM): Supplement DMEM/F12-medium met 10% FBS, 2 mM glutamine, antibiotica - antimycotische oplossing (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amfotericine B), 5 μg/mL insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 5 μM dexamethason en 200 μM indomethacine.
OPMERKING: Bereid DM alleen voor in het volume dat direct nodig is. Bewaar het niet voor een lange periode en gebruik altijd vers bereide DM. Verwarm de DM voor gebruik in een waterbad tot 37 °C. IBMX en indomethacine kunnen neerslaan als ze bij een lagere temperatuur dan 37 °C aan het medium worden toegevoegd. Om het op te lossen, verwarm je de vloeistof in een waterbad tot 37 °C. - Verwijder en verwijder aseptisch het volledige volume van het medium uit de confluente ADSC's.
OPMERKING: Het groeimedium van de ADSC moet volledig worden verwijderd voordat DM wordt toegevoegd. - Voeg voorzichtig 100 μL/put DM toe aan cellen die groeien in een plaat met 96 putten.
OPMERKING: Laat de cellen niet uitdrogen bij het wisselen van medium. - Incubeer de cellen in een couveuse bij een temperatuur van 37 °C, 5%CO2 gedurende 7 dagen.
- Verwijder en gooi het volledige volume DM uit de ADSC's.
- Voeg voorzichtig 100 μL/put verse DM toe aan cellen die groeien in een 96-put plaat.
- Incubeer de cellen in de incubator bij een temperatuur van 37 °C, 5%CO2, gedurende de volgende 7 dagen.
OPMERKING: De voortgang van adipogene differentiatie kan worden waargenomen door brightfield-observatie van lipidevacuolen die verschijnen in de geïnduceerde cellen.
3. Vetzucht van Adipocyten
- Bereid adipocytenkweekmedium voor met FA's: Supplement DMEM/F12 medium met 10% FBS, 2 mM glutamine, antibiotica - antimycotische oplossing (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amfotericine B), 0,33 mM linoleaat, 0,17 mM palmitaat en 0,17 mM oleaat.
- Bereid controle-adipocytenkweekmedium voor: Supplement DMEM/F12-medium met 10% FBS, 2 mM glutamine, antibiotica - antimycotische oplossing (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amfotericine B), 0,44% rundere-serumalbumine (BSA) en 0,26% ethanol (de laatste twee verbindingen werden ook als FAs-oplosmiddelen gebruikt).
OPMERKING: Bereid de controle voor en vul aan met FA adipocytenkweekmedium alleen in de hoeveelheid die nodig is voor direct gebruik. Bewaar het niet te lang en gebruik altijd vers bereide media. Verwarm het medium voor gebruik in een waterbad tot 37 °C. - Na in totaal 14 dagen differentiatie verwijder en gooi zorgvuldig het volledige volume DM-medium uit adipocyten die op een 96-wellplaat zijn onderscheiden.
- Voeg voorzichtig 100 μL/put van adipocytenkweekmedium aangevuld met FA's toe aan de helft van de putten met cellen die groeien in een plaat met 96 putten.
- Voeg voorzichtig 100 μL/put van controle-adipocytkweekmedium toe aan de tweede helft van de wells met cellen die groeien in een 96-well-plaat.
OPMERKING: Laat de cellen niet uitdrogen bij het wisselen van medium. - Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%CO2 gedurende de volgende 48 uur.
- Na 48 uur gebruik je de controlecellen en cellen die met FA's zijn geïncubeerd voor latere experimenten.
OPMERKING: In dit stadium kunnen verkregen vetgemaakte adipocyten worden gebruikt voor meerdere experimentele doeleinden, zoals celkleuring, analyse van cellulaire stofwisseling of co-cultuur met andere celtypen.
4. Lipide druppelvlekken
- Bereid adipocytenkweekmedium voor: Supplement DMEM/F12 medium met 10% FBS, 2 mM glutamine en antibiotica - antimycotische oplossing (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 0,25 μg/mL amfotericine B).
- Verdun fluorescerende kleurstof om LD's in adipocytenkweekmedium te kleuren met een verdunning van 1:1000.
- Verwijder en verwijder het volledige volume van het controle-adipocytenkweekmedium en het adipocytenkweekmedium, aangevuld met FA's van cellen die groeien in een 96-wellplaat.
- Voeg voorzichtig 50 μL/put van adipocytenkweekmedium toe met fluorescerende kleurstof.
OPMERKING: Laat de cellen niet uitdrogen bij het wisselen van medium. - Incubeer cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%CO2 gedurende 15 minuten.
- Was de fluorescentiekleurstof eruit door deze te vervangen door het 100 μL/put adipocytkweekmedium.
- Beeldverwerving in het groene fluorescentiedetectiekanaal (Ex 427 nm/Em 585 nm) met de fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Dit is het protocol voor levendcelkleuring. Kleuring kan ook worden uitgevoerd na formaldehydefixatie van de cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hier beschreven methode maakt het mogelijk om menselijke ADSC's te differentiëren tot volwassen adipocyten, gevolgd door verhoogde lipidenophoping, die de hypertrofische cellen nabootst die onder obesitasomstandigheden worden waargenomen. De tijdslijn van de differentiatie van menselijke ADSC's wordt weergegeven in Figuur 1. Op dag 0, wanneer cellen 100% confluentie bereiken (Figuur 1A), vertonen ADSC's een langgerekte, spind...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het huidige protocol is een reproduceerbare tweestapsprocedure voor de differentiatie van ADSC's, gevolgd door incubatie met FA's om een cellulair model te bereiken dat obesitas nabootst. De cruciale stap die de effectiviteit bepaalt, is het aantal passages van ADSC's na isolatie. Meerdere doorgangen leiden tot een afname van het differentiatiepotentiaal van deze cellen10.
Tijdens de differentiatie van adipocyten worden ADSC's verschove...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.
Dankbetuigingen
Het artikel werd gefinancierd door het Nationaal Wetenschapscentrum, Polen, met subsidies ontvangen door Dorota Nowak (OPUS 22, nr. 2021/43/B/NZ3/01458) en Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Merck | I5879 | |
| 0.25% trypsin/0.05% EDTA pH 7.2 | IITD PAN, Wroc aw, Poland | 20-500 | |
| 96-well plate | Thermo | 130188 | |
| antibiotics-antimycotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Cell counter | N/A | N/A | |
| Centrifuge | N/A | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | IITD PAN, Wrocaw, Poland | 10-500 | bevattend 1 g/L glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Ethanol | Chempur | 113964200#1L | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A5256701 | |
| hADSC Human Adipose-Derived Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Incubator | N/A | N/A | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I8280-5G | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Inverted microscope | N/A | N/A | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | 25030-024 | |
| Linoleic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | L8134 | |
| LipidSpot fluorescent | Biotium | 70065 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo | 10010023 | |
| Soduim oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Soduim palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| T75 cell culture flask | Thermo | 130190 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 95896HJ |
Referenties
- Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
- Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 298(2022).
- Sharma, S., Muthu, S., Jeyaraman, M., Ranjan, R., Jha, S. K. Translational products of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: bench to bedside applications. World J Stem Cells. 13 (10), 1360-1381 (2021).
- Guerreiro, V. A., Carvalho, D., Freitas, P. Obesity, adipose tissue, and inflammation answered in questions. J Obes. 2022, 2252516(2022).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 140-162 (2018).
- Ruiz-Ojeda, F. J., Rupérez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell models and their application for studying adipogenic differentiation in relation to obesity: A review. Int J Mol Sci. 17 (7), 1040(2016).
- Małodobra-Mazur, M., et al. Metabolic differences between subcutaneous and visceral adipocytes differentiated with an excess of saturated and monounsaturated fatty acids. Genes. 11 (9), 1-16 (2020).
- Ishaq, A., Tchkonia, T., Kirkland, J. L., Siervo, M., Saretzki, G. Palmitate induces DNA damage and senescence in human adipocytes in vitro that can be alleviated by oleic acid but not inorganic nitrate. Exp Gerontol. 163, 111798(2022).
- Berger, E., Géloën, A. Insulin prevents fatty acid induced increase of adipocyte size. Adipocyte. 11 (1), 510-528 (2022).
- Eom, J., et al. Visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker. J Vis Exp. (133), e57153(2018).
- Pietraszek-Gremplewicz, K., et al. Response of primary human adipocytes to fatty acid treatment. J Cell Mol Med. 29 (10), e70622(2025).
- Zhu, D., Shi, S., Wang, H., Liao, K. Growth arrest induces primary-cilium formation and sensitizes IGF-1-receptor signaling during differentiation induction of 3T3-L1 preadipocytes. J Cell Sci. 122 (15), 2760-2768 (2009).
- Rosen, E. D., et al. PPARγ is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell. 4 (4), 611-617 (1999).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Styner, M., Sen, B., Xie, Z., Case, N., Rubin, J. Indomethacin promotes adipogenesis of mesenchymal stem cells through a cyclooxygenase independent mechanism. J Cell Biochem. 111 (4), 1042-1050 (2010).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation: activation of CREB rescues adipogenesis from the arrest caused by inhibition of prenylation. J Biol Chem. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Inthanon, K., Sririwichitchai, R., Davies, N. M. Rapid screening of adipogenic responses to EGCG in non-induced L929 adipocytes using image-based analysis compared to the conventional 3T3-L1 method. J Appl Pharm Sci. 15 (5), 138-148 (2025).
- Abbasi, K., Mehdizadeh, A., Hamishehkar, H., Nouri, M., Darabi, M. Fatty acid composition of lipid fractions in white- and brown-like adipocytes derived from human mesenchymal stem cells. Adipocyte. 14 (1), 2566481(2025).
- Pieters, V. M., et al. A three-dimensional human adipocyte model of fatty acid-induced obesity. Biofabrication. 14 (4), 045009(2022).
- Watt, M. J., Hoy, A. J., Muoio, D. M., Coleman, R. A. Distinct roles of specific fatty acids in cellular processes: implications for interpreting and reporting experiments. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302, 1-3 (2012).
- Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: problems and solutions. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1863 (2), 143-150 (2018).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-induced changes in adipose tissue microenvironment and their impact on cardiovascular disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.