Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Circulair RNA ZBTB46 vermindert apoptose en oxidatieve stress in door lipopolysaccharide beschadigde menselijke endotheelcellen door ERBB2-AKT-signalering te moduleren

253 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

13 februari 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Sepsis-geassocieerd acuut nierletsel (SA-AKI) wordt geassocieerd met aanzienlijke sterftecijfers. Deze studie toont circZBTB46 in verlaagde regulering in door LPS geïnduceerde HUVECs (SA-AKI in vitro). De overexpressie ervan verhoogt de levensvatbaarheid van HUVEC, vermindert apoptose, ontsteking en oxidatieve stress in verband met ERBB2/AKT-signalering, wat wijst op een mogelijk therapeutisch doel dat relevant is voor SA-AKI.

Samenvatting

Circulaire RNA's zijn opkomende regulatoren van stressreacties, maar hun rol bij endotheelletsel dat leidt tot sepsis-gerelateerd acuut nierletsel blijft onvolledig gedefinieerd. We stelden de hypothese dat het circulaire RNA ZBTB46 (circZBTB46) endotheliale bescherming biedt door ERBB2-AKT-signalering te activeren. Met behulp van een celgebaseerd model waarin menselijke navelvenendotheelcellen werden uitgedaagd met lipopolysaccharide, kwantificeerden we circZBTB46-expressie en testten we de effecten van de gedwongen expressie op overleving, apoptose, ontstekingsmediatoren en redoxhomeostase. Cellevensvatbaarheidstests en flowcytometrie beoordeelden overleving en apoptose. Enzymgebonden immunosorbent-assays maten interleukine-6, tumornecrosefactor-α en interleukine-1β, terwijl reactieve zuurstofsoorten, malondialdehyde, superoxidedismutase en catalase werden geëvalueerd als indices van oxidatieve schade en antioxidantcapaciteit. Om het mechanisme te definiëren, voerden we transcriptoomprofilering uit met gensetverrijkingsanalyse, bevestigden we route-eiwitten met Western blotting en beoordeelden we de noodzaak met behulp van de ERBB2-remmer AG-825. Lipopolysaccharide onderdrukt circZBTB46. Overexpressie van CircZBTB46 verhoogde de levensvatbaarheid, verlaagde apoptose, verminderde pro-inflammatoire cytokines en reactieve zuurstof-types, verminderde malondialdehyde en verhoogde de activiteit van superoxide-dismutase en katalase. Transcriptomische en eiwitanalyses ondersteunden de activatie van de ERBB2-AKT-as, en farmacologische ERBB2-blokkade verzachtte cytoprotectie en keerde de winst in redoxbalans om. Deze bevindingen identificeren circZBTB46 als een endogene rem op lipopolysaccharide-geïnduceerde endotheelschade via ERBB2-AKT-signalering en noemen circZBTB46 als een mechanistische knoop en potentieel therapeutisch doelwit voor sepsisgerelateerd acuut nierletsel.

Inleiding

Sepsis, een levensbedreigende systemische ontstekingscascade die wordt geïnitieerd door pathogene invasie, culmineert vaak in multi-orgaanfalen1. Binnen deze kritieke context komt SA-AKI naar voren als een overheersende en klinisch significante complicatie op intensive careunits 2. Deze aandoening wordt gekenmerkt door een abrupte achteruitgang van de nierfiltratiecapaciteit gelijktijdig met systemische infectie en vertoont sterftecijfers die die van niet-septische AKI met 38%-42% overschrijden in klinische cohorten2. Ongeveer 60% van de personen die de diagnose sepsis of septische shock krijgen, zal naar verwachting SA-AKI3 ontwikkelen. Daarom is SA-AKI een grote uitdaging geworden op de intensive care, die aanzienlijk bijdraagt aan morbiditeit en mortaliteit4. Op dit moment is het mechanisme van SA-AKI nog onvolledig begrepen. Hoewel preklinische studies microcirculatiestoornissen, veranderingen in het cellulaire metabolisme en disbalansen binnen het renin-angiotensine-aldosteronsysteem (RAAS), mitochondriale disfunctie en inflammatoire disregulatie omvatten, blijft het pathofysiologische mechanisme van SA-AKI ongrijpbaar en is er momenteel een gebrek aan optimale maatregelen ter ondersteuning van vroege diagnose en voortdurende behandeling 5,6,7,8 . SA-AKI kent verhoogde apoptose, overmatige oxidatieve stress en ontsteking9. Binnen dit onderzoekskader werd lipopolysaccharide (LPS) gebruikt in een in vitro systeem om de manifestaties van sepsis-geassocieerde AKI in menselijke navelvenendotheelcellen (HUVEC's) na te bootsen voor voorlopige doelverkenning5.

In de afgelopen jaren hebben circulaire RNA's (circRNA's), een recent geïdentificeerde categorie niet-coderende RNA-moleculen, steeds meer aandacht gekregen vanwege hun rol bijdiverse ziekten. CircRNA's hebben een stabiele circulaire structuur en nemen deel aan cellulaire fysiologische en pathologische processen door te dienen als moleculaire sponsen voor microRNA's (miRNA's), gentranscriptie te reguleren of deel te nemen aan eiwitinteracties11. Onderzoeken hebben aangetoond dat circRNA's cruciaal betrokken zijn bij het moduleren van ontsteking, oxidatieve stress en apoptotische routes, wat leidt tot een grotere focus op hun mogelijke implicaties bij sepsis en aanverwante aandoeningen, waaronder acute nierbeschadiging12. Zo is hsa_circ_0072463 geïdentificeerd als een veelbelovende diagnostische marker en therapeutisch doelwit voor SA-AKI13. Circ_001653 werd gemeld dat het SA-AKI verlichtte door de rekrutering van BUD1314. De functionele betekenis van circRNA's in SA-AKI blijft echter grotendeels onontgonnen.

Deze studie was ontworpen om de invloed van circZBTB46 op de functie van endotheelcellen, oxidatieve stress en ontstekingsreacties te onderzoeken met behulp van een in vitro SA-AKI-systeem. Door een door LPS geïnduceerd HUVEC-model te construeren, onderzochten we endotheelletsel onder endotoxinestimulatie. Het moet worden opgemerkt dat LPS-uitgedaagde HUVEC's een reductionistisch endotoxine/TLR4-gedreven endotheliale stressmodel vertegenwoordigen dat relevant is voor, maar niet gelijkwaardig aan, de multifactoriële pathofysiologie van sepsis-geassocieerd acuut nierletsel. Dit model vangt voornamelijk TLR4-gemedieerde ontstekingsactivatie, oxidatieve stress en apoptose-gerelateerde endotheelresponsen vast, terwijl belangrijke in vivo componenten zoals hemodynamische veranderingen, complement- en stollingscascades, schade-geassocieerde moleculaire patronen en heterogene microbiële stimuli worden weggelaten. Binnen dit experimentele kader onderzochten we of circZBTB46 door LPS geïnduceerde oxidatieve stress en apoptose verlicht door het ERBB2-signaalpad te moduleren, waardoor de functie van endotheelcellen beschermd wordt. Voor zover wij weten levert deze studie het eerste bewijs dat circZBTB46 koppelt aan endotheliale stressreacties in de context van sepsis-geassocieerd acuut nierletsel. Door de moleculaire mechanismen achter circZBTB46-gemedieerde endotheelbescherming te verduidelijken, kan dit onderzoek het begrip van de pathogene mechanismen van SA-AKI verdiepen en de weg vrijmaken voor innovatieve therapeutische benaderingen gericht op circRNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol beschrijft de experimentele procedures die worden gebruikt om de effecten van circZBTB46-modulatie op inflammatoire signalering, oxidatieve stress en activatie van de ERBB2-AKT-route in HUVEC's te onderzoeken.

Celkweek
De HUVEC-cellen die in deze studie werden gebruikt, zijn afkomstig uit een commerciële bron. HUVEC's werden gebruikt als representatief endotheelcelmodel vanwege hun brede beschikbaarheid, reproduceerbare kweekomstandigheden en hoge transfectie-efficiëntie, die genetische manipulatie en mechanistisch onderzoek van endotheliale signaalroutes onder inflammatoire stressmogelijk maken 15,16. HUVEC's werden gekweekt in DMEM, aangevuld met 10% (v/v) foetaal rundserum en een antibioticum-antimycoticum cocktail in concentratie 1%. Alle celculturen werden onder standaard fysiologische omstandigheden in een bevochtigde kamer (37 °C, 5%CO2) onderhouden, wat een aanhoudende cellulaire proliferatie bevorderde terwijl >95% levensvatbaarheid behouden bleef, zoals bevestigd door de trypan blue exclusion assay. Hoewel endotheel-specifieke media (bijv. EGM-2 of M199 aangevuld met endotheelgroeisupplementen) vaak worden aanbevolen voor langdurig HUVEC-onderhoud, werd DMEM in deze studie gebruikt om consistentie tussen experimentele behandelingen en compatibiliteit met LPS-stimulatie en farmacologische remmer-assays te waarborgen. Voor de AG-825 inhibitor-assays incubeer je HUVEC's met verse DMEM die 10 μM AG-825 bevat gedurende 1 uur. Voeg vervolgens de LPS-oplossing toe aan de putten om een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL te bereiken, en zet de cultuur 24 uur voort. Om potentiële fenotypische drift te minimaliseren, werden HUVEC's gebruikt bij lage doorgangen en blootgesteld aan DMEM-gebaseerde experimentele omstandigheden alleen voor kortetermijntests. Alle functionele experimenten werden uitgevoerd binnen gedefinieerde behandelvensters in plaats van tijdens langdurige kweek.

Celtransfectie
Om de biologische rol van circZBTB46 te verduidelijken, werden overexpressieplasmiden (oe-circZBTB46) en gematchte negatieve controleconstructies (oe-NC) gesynthetiseerd en gevalideerd door GenScript. HUVEC's werden in 6-wellplaten gezaaid met een dichtheid van 1 x 10⁵ cellen/put en 's nachts gekweekt om bij transfectie ~70%-80% confluentie te bereiken. Voor elke put werd 2,5 μg plasmide-DNA (oe-circZBTB46 of oe-NC) verdund in 125 μL gereduzeerd serummedium en gemengd met 2,5 μL P3000-reagens (buis A). Parallel werd 3,75 μL Lipofectamine 3000 verdund in 125 μL gereduceerd serummedium (buis B). Buis A en buis B werden vervolgens gecombineerd, voorzichtig gemengd en 15-20 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd om complexvorming mogelijk te maken (eindvolume van het complex: 250 μL/put). De complexen werden druppelgewijs aan de cellen toegevoegd in een antibioticavrij volledig medium. Na 6 uur incubatie bij 37 °C, 5% CO2, werd het transfectiemedium vervangen door een nieuw volledig groeimedium. Cellen werden 48 uur gekweekt voorafgaand aan de volgende assays. Alle procedures volgden de instructies van de fabrikant.

LPS-geïnduceerd model
Om een in vitro SA-AKI model te genereren, werden HUVECs (5 x 105 cellen/put) getransfecteerd met oe-circZBTB46 of NC gezaaid in 96-wellplaten en 24 uur gehandhaafd totdat 80% confluentie was bereikt. Hierna ondergingen deze cellen een behandeling met LPS bij 10 μg/mL gedurende 24 uur. HUVEC's zonder LPS-behandeling dienden als controlegroep.

qRT-PCR
Volledige RNA-extractie uit HUVEC's maakte gebruik van een commercieel reagens. Reverse transcriptie voor cDNA-synthese werd uitgevoerd met de commerciële reagenskit. Kwantitatieve PCR (qPCR) werd driemaal uitgevoerd met behulp van een Real-Time PCR-systeem naast een mastermix. De expressiehoeveelheden van doelgenen werden gekalibreerd tegen U6, met analyse uitgevoerd via de 2−ΔΔCT-methode 17,18. Voor circRNA-expressieanalyse werd U6 small nuclear RNA gebruikt als interne referentie voor normalisatie, omdat het vaak wordt gebruikt voor kwantificering van kleine niet-coderende RNA's en relatief stabiele expressie vertoont tijdens kortetermijn in vitro experimentele omstandigheden. De primersequenties die in deze studie worden toegepast, zijn als volgt vermeld:

circZBTB46-Voor: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Achteruit: 5'-CGCCTCTTCTACAGAGGG-3'

U6-Vooraan: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Achteruit: 5'-GAGGTCATGCTAATCTCTCTCTCTG-3'.

CCK-8 assay
De levensvatbaarheid van HUVEC's werd beoordeeld met CCK-8 die commercieel was aangeschaft. Kort gezegd werden cellen in een 96-well-plaat geplant en ondergingen de cellen een adhesiekweek gedurende 24 uur. Daarna werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elke put toegevoegd, en de cellen werden verder geïncubeerd bij 37 °C gedurende 2 uur. Er werd een microplaatlezer gebruikt om de optische dichtheid (OD) te meten bij een golflengte van 450 nm. Voorlopige waarnemingen toonden aan dat 10 μg/mL LPS de levensvatbaarheid van HUVEC's significant verminderde, wat leidde tot de selectie van deze concentratie voor latere experimentele processen.

Flowcytometrie
Aanvankelijk werden HUVECs volgens standaardprocedures met EDTA-vrij trypsine losgekoppeld. In overeenstemming met de richtlijnen van de fabrikant voor de Annexin V-APC/PI Apoptosis Assay Kit werden celsuspensies gecentrifugeerd bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, na enzymatische dissociatie. De gepelleteerde cellen werden vervolgens 2x gewassen met ijskoude PBS onder identieke omstandigheden en opnieuw opgehangen in 100 μL van 1x bindingsbuffer. Elk monster werd behandeld met 5 μL Annexin V-FITC conjugatie en 5 μL propidiumjodide (PI) kleuringsoplossing, gevolgd door een 10 minuten incubatie in het donker bij kamertemperatuur (20-25 °C). Ten slotte werd 400 μL 1x bindingsbuffer aan alle monsters toegevoegd en werd de apoptose binnen 1 uur geanalyseerd met een flowcytometer. Evenementen werden eerst door FSC/SSC geblokkeerd om puin uit te sluiten. Voor apoptose-analyse werden kwadrantpoorten vervolgens toegepast op de Annexin V-FITC versus PI-grafiek met behulp van passende controles (ongekleurd en enkelkleurig/compensatiecontroles) om levende (Annexin V-/PI-), vroege apoptotische (Annexin V+/PI-), late apoptotische (Annexin V+/PI+) en necrotische (Annexin V-/PI+) populaties te definiëren. Dezelfde gating-sjabloon en drempels werden toegepast op alle monsters.

ELISA-assay
De concentraties van ontstekingsfactoren—tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-6 (IL-6) en interleukine-1β (IL-1β)—in de supernatant van gekweekte HUVEC's werden gemeten met commercieel verkrijgbare ELISA-kits. Specifiek werden de Human TNF-α ELISA Kit, Human IL-6 ELISA Kit en Human IL-1β ELISA Kit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Voor elke assay werd per put 50 μL onverdunde celcultuursupernatant geladen. Standaardkrommen werden gegenereerd met behulp van de meegeleverde seriële verdunningen (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Na monster en standaardtoevoeging werden platen 90 minuten geïncubeerd bij 37 °C, gevolgd door vijf wasbeurten met wasfilter. Vervolgens werd biotine-geconjugeerd detectie-antilichaam toegevoegd en 60 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Na een andere wasbeurt werd streptavidin-HRP toegevoegd en 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Na een laatste wasbeurt werd 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substraat toegevoegd en 15 minuten in het donker geïncubeerd bij 37 °C. De reactie werd beëindigd met stopoplossing en de absorptie werd onmiddellijk gemeten op 450 nm met een referentiegolflengte van 630 nm. Elke monster en standaard werd dubbel geanalyseerd en alle experimenten bevatten drie onafhankelijke biologische replicatieën. De niveaus van oxidatieve stressmarkers—malondialdehyde (MDA), superoxidedismutase (SOD) en katalase (CAT)—in het supernatant werden respectievelijk geëvalueerd met behulp van de MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit en CAT ELISA Kit, volgens de verstrekte protocollen 19,20,21. Voor MDA- en SOD-assays werd 40 μL supernatant per put gebruikt zonder verdunning; voor CAT werden monsters 1:10 verdund met een assaybuffer voorafgaand aan het laden. Standaardcurves werden voorbereid volgens de bouwpakketspecificaties (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; KAT: 0-100 U/mL). De incubatiestappen werden als volgt uitgevoerd: MDA - 60 min bij 37 °C; SOD - 60 min bij 37 °C; CAT - 30 min bij 37 °C. De borden werden vier keer gewassen tussen de belangrijkste incubatiestappen. Kleurontwikkeling werd bereikt door de respectievelijke substraten toe te voegen en te incuberen bij 37 °C (MDA: 15 min; SOD: 20 min; KAT: 15 min). De absorptie werd gemeten op 450 nm voor SOD en CAT, en bij 532 nm voor MDA. Alle metingen werden uitgevoerd in dubbele putten en herhaald op drie onafhankelijke biologische replicaten.

RNA-sequencing
Totaal RNA werd uit HUVEC's geëxtraheerd met commerciële reagentia volgens de instructies van de fabrikant. De zuiverheid en concentratie van RNA werden beoordeeld met een spectrofotometer door absorptie te meten bij 260 nm en 280 nm (A260/A280), en de integriteit van RNA werd geëvalueerd met een bioanalyzer. Alleen RNA-monsters met een RNA Integrity Number (RIN) ≥ 7 werden gebruikt voor de daaropvolgende bibliotheekvoorbereiding. Ribosomaal RNA werd verwijderd tijdens de bibliotheekvoorbereiding met behulp van een standaard rRNA-depletieprocedure uitgevoerd door een commercieel bedrijf. Waar geïndiceerd werd RNase R-behandeling toegepast vóór de bibliotheekbouw om lineaire RNA's selectief te verteren en circulaire RNA-soorten te verrijken. RNA-fragmentatie werd vervolgens uitgevoerd onder verhoogde temperatuurcondities volgens het standaardprotocol van de RNA Library Preparation Kit-handleiding om RNA-fragmenten van passende grootte te genereren. Sequencingbibliotheken werden voorbereid met de RNA Library Preparation Kit volgens de instructies van de fabrikant en gesequenced op een Illumina-platform met een paired-end sequencingstrategie en een leeslengte van 150 bp (PE150). De sequencingdiepte was voldoende om transcriptome-brede analyse te ondersteunen. Ruwe sequencing-reads werden verwerkt met standaard kwaliteitscontroleprocedures om adaptersequenties en laagwaardige reads te verwijderen. Schone reads werden afgestemd op het menselijke referentiegenoom en genexpressieniveaus werden dienovereenkomstig gekwantificeerdmet 22,23. Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen circZBTB46-overexpressieve HUVECs en NC-behandelde HUVECs onder LPS-stimulatie werden geïdentificeerd met behulp van gevestigde statistische methoden. Genset-verrijkingsanalyse (GSEA) werd uitgevoerd om signaalroutes te identificeren die geassocieerd zijn met circZBTB46-overexpressie. Genen werden gerangschikt op basis van differentiële expressie tussen experimentele groepen. Gecureerde gensets uit de Molecular Signatures Database (MSigDB) werden gebruikt voor verrijkingsanalyse. De verrijkingssignificantie werd geëvalueerd op basis van de genormaliseerde verrijkingsscore (NES) en het valse ontdekkingspercentage (FDR), waarbij FDR < 0,25 als statistisch significant werd beschouwd. CircRNA-sequencing en alle bijbehorende bio-informatische analyses werden uitbesteed.

Identificatie van DEG's
Om LEG's te screenen, werden de expressieniveaus tussen twee verschillende groepen vergeleken met behulp van het DESeq (2012) R-softwarepakket. De drempels voor statistische significantie werden gedefinieerd als p < 0,05 met een |log2FC| Waarde hoger dan 0,58. De heatmap werd gegenereerd door het pheatmap R-pakket, en de vulkaanplot gebruikte het Goplot2 R-pakket voor het tekenen.

Functionele verrijkingsanalyse
GO- en KEGG-verrijkingsanalyses afgeleid van lineaire transcripties werden uitgevoerd met het online platform EnrichR, en de Bubble Chart werd getekend op basis van het GOplot R-pakket. De GSEA-software werd gebruikt, gebaseerd op de expressiematrix- en gensetbestanden die door de MSigDB-database werden geleverd, met analyseparameters (bijv. aantal permutaties en statistische methoden). De verrijking van gensets werd geëvalueerd met behulp van de genormaliseerde verrijkingsscore (NES), P-waarde en FDR-waarde, wat een diepgaande verkenning bood van de functies en potentiële biologische mechanismen van de verschillend tot expressie gebrachte genen.

Westelijk vlek
Het totale eiwit werd geëxtraheerd uit HUVEC's (ongeveer 1 x 10⁶ cellen) met behulp van een RIPA-lysebuffer aangevuld met protease- en fosfataseremmers. De eiwitconcentratie werd bepaald met een BCA Protein Quantification Kit. Gelijke hoeveelheden eiwit (20 μg per baan) werden opgelost door elektroforese op 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) bij 80 V gedurende 30 minuten, gevolgd door 120 V gedurende 60 minuten. Vervolgens werden eiwitten overgebracht naar polyvinylidienfluoride (PVDF) membranen met behulp van een nat-overdrachtssysteem bij 100 V gedurende 90 minuten bij 4 °C. Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie met primaire antilichamen verdund in dezelfde blokkerende buffer (typisch 1:1000 voor doeleiwitten en 1:5000 voor GAPDH) bij 4 °C gedurende de nacht. De belangrijkste gebruikte antilichamen waren als volgt: ERBB2, p-AKT, AKT en GAPDH. Na de incubatie werden membranen 3x (10 minuten per was) gewassen met TBST en vervolgens geïncubeerd met een mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde geitenantikonijn IgG secundair anti-anti-konijn secundair antilichaam (1:5000 in blokkerende buffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na drie extra TBST-washes (elk 10 min) werden eiwitbanden gevisualiseerd met een Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Substrate Kit en gefotografeerd met een beeldvormingssysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met software.

Statistische analyse
Statistische evaluaties werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 10. Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± standaardfout van de gemiddelden (SEM's). Er werd een p-waarde < 0,05 gedefinieerd om statistische significantie aan te geven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

qRT-PCR-analyse van circZBTB46-expressie in een in vitro SA-AKI-model
Deze reeks experimenten werd uitgevoerd om de hypothese te testen dat circZBTB46-expressie veranderd is onder LPS-stimulatie en dat modulatie van circZBTB46 de levensvatbaarheid en apoptose van endotheelcellen beïnvloedt in een in vitro SA-AKI-model. Aanvankelijk werd circZBTB46-expre...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens sepsis activeren pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), zoals LPS die door pathogenen worden vrijgegeven, Toll-achtige receptoren (bijv. TLR4), wat een systemische ontstekingsreactie26 in gang zet. Dit proces veroorzaakt de secretie van meerdere pro-inflammatoire mediatoren, zoals TNF-α, IL-6 en IL-1β, wat resulteert in een cytokinestorm27. Tegelijkertijd beschadigt LPS direct de vaat-endotheelcellen, wat resulteert in micr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De auteurs verklaren dat de belangrijkste resultaten in dit manuscript niet eerder zijn gepubliceerd en niet elders worden overwogen voor publicatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AG-825 (ErbB2 Inhibitor)MedChemExpressHY-1019710 μM voor pathway blokkade
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BARNA integriteit (RIN ≥7)
AKT AntilichaamProteintech60203-2-IgWB (1:15000)
Annexin V-APC/PI Apoptose KitElabscienceE-CK-A327Apoptose detectie
Antibiotic-AntimycoticGibco152400621% concentratie
BCA Eiwit Kwantificering KitBeyotimeP0012Eiwitconcentratie
CAT ELISA KitMEIMIANMM-0897H2Antioxidant enzym
CCK-8 KitDojindoCK04Celviabiliteitstest
CircRNA seqFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150CircRNA sequencing en alle bijbehorende bio-informatica analyses
CytoFLEX Flow CytometerBeckman CoulterB53000Apoptose analyse
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Celcultuur medium
ECL Substraat KitMilliporeWBKLS0100Eiwit detectie
ERBB2 AntilichaamSino Biological100271-T32WB (1:10000)
Foetaal Rundserum (FBS)Biological Industries04-001-1ACS10% (v/v) supplement
GAPDH AntilichaamProteintech60004-1-IgWB (1:50000)
HUVECsProcell systeemCP-H082Bron van cellijn
IL-1β ELISA KitMEIMIANMM-0181H2Ontstekingsfactor
IL-6 ELISA KitMEIMIANMM-0049H2Ontstekingsfactor
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850RNA sequencing
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008Transfectiereagens
LPS (E. coli O111:B4)Sigma-AldrichL263010 μg/mL voor SA-AKI model
MDA ELISA KitMEIMIANMM-2037H2Oxidatieve stress marker
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000RNA kwantificatie
NEBNext Ultra II RNA Library KitNEBE7770SRNA-seq bibliotheek voorbereiding
oe-circZBTB46 plasmideGenScriptAangepaste synthesecircZBTB46 overexpressie vector
oe-NC plasmideGenScriptAangepaste syntheseNegatieve controle vector
p-AKT (Ser473) AntilichaamProteintech66444-1-IgWB (1:1200)
PrimeScript RT Reagens KitTakaraRR047AcDNA synthese
PVDF MembranenMilliporeIPVH00010Western blot overdracht
QuantStudio 5 SysteemThermo FisherA28137Real-time PCR
Ribonuclease RLucigenRNR07250rRNA verwijdering
RIPA Lysis BufferBeyotimeP0013BEiwit extractie
RNAiso PlusTakara9109Totale RNA extractie
SOD ELISA KitMEIMIANMM-25469H2Antioxidant enzym
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420AqPCR reagens
TNF-α ELISA KitMEIMIANMM-0122H2Ontstekingsfactor

Referenties

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CircZBTB46Lipopolysaccharide-letselRegulatie van apoptoseCelviabiliteitsassayFlowcytometrieAcute nierinsufficiëntie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.