Methodenartikel

Modellering van adipocyteninsulineresistentie met behulp van muis subcutane vetweefselafgeleide stromale vasculaire fractie

DOI:

10.3791/69769

⸱

27 maart 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een experimenteel protocol waarbij stromale vasculaire fractie wordt gebruikt die afkomstig is van subcutaan vetweefsel van de muis en behandeld met dexamethason om insulineresistentie te simuleren. Door de complexiteit van vetweefsel te behouden, biedt het een fysiologisch authentiek platform voor mechanistisch onderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insulineresistentie in vetweefsel is een centraal kenmerk van metabole aandoeningen zoals type 2 diabetes, maar veel in vitro modellen vertrouwen op geïmmortaliseerde cellijnen die de cellulaire complexiteit van het oorspronkelijke vetweefsel onvolledig weerspiegelen. Het doel van dit protocol is het opzetten van een reproduceerbare en experimenteel toegankelijke methode voor het modelleren van adipocyteninsulineresistentie met primaire adipocyten afkomstig van de stromale vasculaire fractie (SVF) van subcutane vetweefsel van de muis. Het protocol beschrijft de isolatie van SVF-cellen door enzymatische vertering, hun adipogene differentiatie tot lipidenrijke rijpe adipocyten, en de daaropvolgende inductie van insulineresistentie met behulp van dexamethason. Insulineresistentie wordt operationeel gedefinieerd en gevalideerd via functionele en moleculaire metingen, waaronder een verminderde insuline-gestimuleerde glucoseopname en -consumptie, evenals een verminderde fosforylering van belangrijke insuline-signaleringseiwitten in de PI3K-AKT-route. Door SVF-afgeleide cellulaire heterogeniteit te behouden, biedt deze aanpak een primair-cel gebaseerd systeem dat onderzoek ondersteunt naar adipocyteninsulinesignalering onder omstandigheden die meer lijken op de fysiologie van het vetweefsel dan conventionele cellijnen. Dit protocol is bedoeld voor onderzoekers die een gestandaardiseerd platform zoeken om mechanismen van adipocyteninsulineresistentie te bestuderen of metabole interventies te evalueren, terwijl wordt erkend dat de uitlezingen responsen weerspiegelen van een gemengde SVF-afgeleide cultuur in plaats van een gezuiverde adipocytpopulatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is uitgegroeid tot een van de snelst groeiende niet-overdraagbare metabole ziekten wereldwijd, met een totaal aantal patiënten dat nu meer dan 537 miljoen bedraagt en naar verwachting 783 miljoen zal overschrijden tegen 2045. De kernpathofysiologische kenmerken manifesteren zich als perifere weefselinsulineresistentie (IR), vergezeld van progressieve β-cel disfunctie2. De essentie van IR ligt in de aanzienlijk verminderde biologische effecten die worden veroorzaakt door fysiologisch geconcentreerde insuline in doelorganen, wat leidt tot een verminderde glucoseopname, verhoogde leverglucoseproductie en verminderde lipolyseremming3. Vetweefsel is een van de meest kritieke doelorganen van insuline. Obesitas zorgt ervoor dat vetcellen ongevoelig worden voor insuline, waardoor de glucoseopname afneemt, de synthese van triglyceriden wordt geremd, terwijl het tegelijkertijd de lipolyse verhoogt en meer vrije vetzuren vrijmaakt, waardoor systemische insulineresistentieverergert 4,5.

Onder fysiologische omstandigheden activeert insuline de PI3K-AKT-route om glucosetransporter 4 (GLUT4) naar het celmembraan te transloceren, wat de glucoseopname en triglyceridensynthese in adipocyten bevordert. Tegelijkertijd remt insuline de activiteit van adiposetriglyceride lipase (ATGL) en hormoongevoelige lipase (HSL) op het oppervlak van lipidendruppels, waardoor lipolyse6 wordt geblokkeerd. Wanneer IR optreedt, verzwakt een verminderde insulinesignalering de lipolyse-inhibitie, wat leidt tot een massale afgifte van vrije vetzuren (FFA's) in de bloedbaan. Dit resulteert in een massale afgifte van FFA's in de bloedbaan, wat leidt tot de afzetting van ectopische triglyceriden in organen zoals de lever, skeletspieren en alvleesklier. Dit veroorzaakt liptoxiciteit en chronische ontsteking, wat uiteindelijk bijdraagt aan het ontstaan en de progressie van T2DM7. Daarom is het opzetten van een volwassen adipocytenmodel dat in vivo IR-kenmerken reproduceert cruciaal om de moleculaire mechanismen van IR te verduidelijken en nieuwe interventiestrategieën te ontwikkelen.

Momenteel is de 3T3-L1 muis embryonale fibroblastcellijn een klassiek hulpmiddel geworden voor in vitro studies van adipocyten IR vanwege de korte inductiecyclus en goede reproduceerbaarheid 8,9. De embryonale oorsprong van 3T3-L1-cellen, hun uniforme genetische achtergrond en vatbaarheid voor fenotypische drift na langdurige passage leiden echter tot significante verschillen in metabolisch gedrag vergeleken met volwassen in situ adipocyten, waardoor hun translationele medische waardebeperkt wordt 10,11. Daarentegen is de stromale vaatfractie (SVF) die uit knaagdieren subcutaan vetweefsel wordt geïsoleerd rijk aan multipotente adipose stamcellen (ASC's). Rijpe adipocyten die onderscheiden zijn van deze ASC's vertonen morfologische, functionele en transcriptionele kenmerken die meer lijken op die van inheemse witte adipocyten dan de veelgebruikte 3T3-L1 cellijn. Dit maakt SVF-afgeleide adipocyten een complementair model voor het bestuderen van insulinesignalering en -resistentie in een context die de primaire weefselcomplexiteit12 beter benadert.

Dit protocol is het meest geschikt voor onderzoekers die de insulinewerking willen bestuderen in een primair adipocytenmodel dat een grotere weefselheterogeniteit behoudt dan geïmmortaliseerde cellijnen. Gebruikers moeten echter opmerken dat SVF een gemengde populatie is die endotheel- en immuuncellen bevat; Daarom weerspiegelen de uitlezingen het gedrag van een cultuur waarbij adipocyten een belangrijk, maar niet exclusief onderdeel zijn. Dit model is mogelijk minder geschikt voor studies die een pure, gesynchroniseerde adipocytenpopulatie vereisen.

Deze studie stelt een protocol voor voor het construeren van een insulineresistent celmodel met behulp van volwassen adipocyten afgeleid van SVF. Het protocol beschrijft het hele proces van SVF-isolatie, kweek, differentiatie en inductie van insulineresistentie, waarbij de insulineresistente toestand van adipocyten in vivo succesvol wordt nagebootst. Modelevaluatie zal worden uitgevoerd op het niveau van glucoseconsumptie, cellulaire morfologie en moleculaire mechanismen. Dit biedt een technische basis voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie in adipocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Experimental Ethics Committee van de Xinjiang Medical University (Ethische Goedkeuringsnr.: IAGUC-20240228-41).

1. SVF-isolatie

  1. Proefdieren: Gebruik muizen van 4-6 weken oud met SPF-kwaliteit C57BL/6J die 9-11 g wegen. Plaats ze op 22 ± 2 °C onder een licht-donker cyclus van 12 uur met vrije toegang tot voedsel en water.
  2. Steriele voorbereiding: Autoclave alle instrumenten en verbruiksartikelen op 121 °C gedurende 30 minuten. Spuit voor het experimenteren de laminaire flow hood met 75% ethanol en bestral met UV-licht gedurende ≥15 minuten. Voer alle procedures uit in een Klasse II bioveiligheidskast. Draag steriele handschoenen en mondkapjes.
  3. Vetweefseloogst: Muizen worden geëuthanaseerd door kooldioxide-inhalatie gevolgd door een cervicale dislocatie. Onmiddellijk 10 minuten onderdompelen in 75% ethanol voor oppervlaktedesinfectie. Maak met steriele oogschaar een cirkelvormige incisie langs de middenlijn van de borst en buik. Voer een stomp dissectie uit om het bilaterale inguinale witte vetweefsel bloot te leggen, gelegen aan de binnenkant van het dijbeen en uitstrekkend naar het testikelgebied in een V-vorm. Verwijder voorzichtig alle zichtbare lymfeklieren. Verzamel het vetweefsel in voorgekoelde PBS en voer drie snelle spoelingen uit.
  4. Collagenase-vertering: Breng het gewassen vetweefsel onmiddellijk over in een steriele kweekschaal en maal het in fragmenten van 1-2 mm³. Voeg 0,2% type II collagenase toe (opgelost in Dulbecco's PBS, pH 7,4, voorverwarmd tot 37 °C) op een volume van 1,5-2x dat van het weefsel. Incubeer bij 37 °C op een constant-temperatuur shaker bij 100 rpm gedurende 10 minuten. Keer voorzichtig elke 3 minuten om oververtering te voorkomen.
  5. Beëindiging en filtratie: Na voltooiing van de vertering voeg je een gelijk volume voorverwarmd volledig medium toe (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% penicilline-streptomycine) bij 37 °C om de reactie te beëindigen. Pipetteer voorzichtig 5x-8x met een pipettip van 1 mL. Filter door een 70 μm celzeef om onverteerde weefselfragmenten en rijpe adipocyten te verwijderen.
  6. Centrifugatie en wassen: Centrifugeer het filtraat op 300 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C. Gooi voorzichtig het supernatant met volwassen adipocyten weg. Sussie de pellet opnieuw in een volledig medium. Centrifugeer opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten op 25 °C. Herhaal deze wasstap twee keer om resterende collagenase en eventuele resterende rijpe adipocyten te verwijderen.
  7. Zaaien en kweken: Suss de laatste pellet opnieuw in 1 mL volledig medium. Zaad met een dichtheid van 4 muizen liesvetmonsters per 10 cm celkweekschaal. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂. Voer de eerste mediumwissel na 24 uur uit om niet-hechtende cellen te verwijderen. Vervolgens wissel je het medium elke 48 uur. Doorgang de cellen wanneer ze 80%-90% samenvloeiing bereiken.
    OPMERKING: Doorgang geen cellen wanneer de samenvloeiing meer dan 90% bedraagt, omdat de cellen contactremming hebben bereikt en hun proliferatieve capaciteit is verminderd.

2. Bereiding van type II collagenase werkoplossing

  1. Reagentia en verbruiksartikelen: Verkrijgen type II collagenase (activiteit ≥ 120 U/mg); BSA (vetzuurvrij ≥ 98%); HEPES; Dulbecco's PBS (met Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L), pH 7,2-7,4; 0,22 μm steriel laag-eiwitbindend filter.
  2. Bereiding van 0,2% type II collagenase-oplossing: Weeg 60 mg type II collagenasepoeder, 800 mg BSA en 48 mg HEPES in een 50 mL centrifugebuis. Verdunn tot 40 mL met Dulbecco's PBS. Stel de pH in op 7,4 ± 0,1 met 1 M NaOH of HCl. Steriliseer door filtratie via een 0,22 μm filter. Aliquot 5 mL per buis en bewaar bij -20 °C. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
  3. Induceer differentiatie wanneer cellen na passage 100% samenvloeiing bereiken. De optimale differentiatietoestand wordt aangegeven door cellen die een vortexachtige morfologie vertonen. Gebruik inductieoplossing I voor de eerste 48 uur, en schakel dan over naar inductieoplossing II (Tabel 1).
  4. Bevestig succesvolle differentiatie met de volgende criteria: op dag 4 van inductie onthult olierode O-kleuring lipidendruppelophoping in de meeste cellen (ongeveer 50%), vergezeld van een statistisch significante toename (p < 0,05) in de expressie van belangrijke adipogenese-markers.

3. Vaststelling van het insulineresistentiemodel

  1. Kies differentiatiedag 4 als startpunt voor het induceren van insulineresistentie. Bevestig onder de microscoop dat alle cellen een morfologische overgang vertonen van spilvormig naar rond, waarbij het cytoplasma van de meeste cellen gevuld is met lipidendruppels met een hoge brekingsindex.
  2. Vervang het medium door inductiemedium II met 1 μmol/L Dex en ga verder met cultiveren gedurende 48 uur (Tabel 1). Na deze procedure kun je het insulineresistente adipocytenmodel overwegen dat is opgezet. Let op dat deze cellen geen verdere morfologische veranderingen vertonen. Gebruik deze cellen direct voor glucoseopname-/consumptietests en voor de detectie van insuline-signaleringsroute-eiwitten.
  3. Criteria voor succesvolle opbouw van een insulineresistentiemodel: Na 48 uur dexamethasonbehandeling wordt bevestigd dat de opnamecapaciteit van glucose in de meeste cellen die met 100 nM worden gestimuleerd, insuline met ongeveer 40% afneemt. Bevestig ook een statistisch significante vermindering (p < 0,05) in de fosforyleringsniveaus van belangrijke insuline-signaleringsroute-eiwitten.
    OPMERKING: Dit proces vereist voortdurende toevoeging van inductieonderhoudsmedium II.

4. Detectie van restglucose in kweeksupernatant

  1. Verzamel celkweeksupernatanten op het afgesproken tijdstip. Verwijder cellen door centrifugatie bij 4 °C en 300 x g gedurende 5 minuten.
  2. Meet de glucoseconcentraties in de supernatanten met behulp van de glucose-oxidase-peroxidase (GOD-POD) assay kit. Bereken concentraties met de formule:
    Glucoseconcentratie (mmol/L) = (A(steekproef) - A(leeg) / (A(standaard) - A(leeg)) * C(standaard)
    Glucoseconsumptie (mmol/L) = Glucoseconcentratie in celvrij medium (mmol/L) - Glucoseconcentratie in celsupernatant (mmol/L)
    Genormaliseerde glucoseconsumptie (mmol/mg eiwit) = Rauwe glucoseconsumptie (mmol/L) / Totale cellulaire eiwitconcentratie (mg/L)

5. Western blot

  1. Stimuleer cellen op het aangewezen tijdstip met 100 nM insuline in volledig medium gedurende 10 minuten bij 37 °C om de PI3K-AKT-route te activeren. Voeg vervolgens 200 μL cellysebuffer toe aan elke 3,5 cm celkweekschaal. Bred 30 minuten op ijs. Centrifugeer op 13.040 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-werkoplossing.
  2. Laad monsters op een 8% SDS-PAGE gel. Draai de gel op 80 V totdat de monsters de stacking/separating gel interface bereiken. Verhoog de spanning naar 120 V en laat het draaien totdat de markerbanden volledig zijn opgelost. Voer overdracht uit bij een constante stroom van 200 mA gedurende 2 uur.
  3. Incubeer het membraan op kamertemperatuur met 5% magere melk of BSA gedurende 2 uur om te blokkeren. Was het membraan 3 keer met TBST. Vervolgens incubeer je met een primaire antistof 's nachts bij 4 °C. Primaire antilichamen (verdunning): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Actine: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. Was het membraan 3 keer met TBST. Vervolgens 1 uur incubeer met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur. Secundaire antilichamen (verdunning): Geitenanti-muis IgG-HRP: 1:5000, Geitenantikonijn IgG-HRP: 1:5000.
  5. Detecteer het signaal met ECL-chemiluminescentie. Visualiseer en leg de experimentele resultaten vast met een Western blot-imager.
  6. Analyseer de grijswaardenwaarden van de resulterende banden met behulp van ImageJ-software.

6. Glucoseopname-kleuringstest

  1. Laat de cellen op de twee gespecificeerde tijdstippen afzonderlijk 12 uur uithongeren met RPMI 1640 die 1% FBS bevat om interferentie door basale glucose te elimineren.
  2. Na 10 minuten stimulatie met 100 nM insuline, voeg je 1 mL 1x 2-NBDG oplossing toe aan elke put. Breng de plaat 1 uur uit bij 37 °C, beschermd tegen licht.
  3. Was de cellen 2-3 keer. Voeg 1 ml kant-en-klare Hoechst-kleuroplossing toe aan elke put. Breng de plaat 10 minuten in het donker uit op 37 °C. Voeg de kleuringsoplossing langzaam toe langs de zijwand van het kweekvat, waarbij direct contact met de cellaag wordt vermeden om loslating van cellen te voorkomen.
  4. Was de cellen 2-3 keer en voeg daarna PBS toe. Maakt fluorescerende beelden van de cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
  5. Voer kwantitatieve analyses uit van de beelden met behulp van de ImageJ-software. Gebruik ImageJ om elk kanaal te scheiden, waarbij het glucoseopnamesignaal (groen kanaal) wordt geïsoleerd van het nucleaire fluorescentiesignaal (blauw kanaal).
  6. Converteer alle afbeeldingen naar 8-bits grijswaardenafbeeldingen. Pas het standaard automatische drempelalgoritme toe om gebieden met positief signaal te definiëren.
  7. Meet de gemiddelde fluorescentieintensiteit binnen deze aangewezen gebieden. Normaliseer het fluorescentiesignaal van de glucoseopname door de gemiddelde fluorescentieintensiteit van het groene kanaal te delen door de overeenkomstige gemiddelde fluorescentieintensiteit van het blauwe kanaal.

7. Olierode O-kleuring

  1. Verdun de Oil Red O-voorraadoplossing met RNase-vrij water in een verhouding van 3:2. Filter de oplossing sequentieel door filterpapier en een 0,22 μm filter om de werkoplossing te bereiden.
  2. Aspireer het celkweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voeg 4% paraformaldehyde toe aan elke put en fixeer de cellen 30 minuten op kamertemperatuur.
  3. Voeg het fixatiemiddel toe en was de cellen met dubbel gedestilleerd water. Voeg 1 ml Oil Red O werkoplossing toe aan elke put. Incubeer het bord 25 minuten op kamertemperatuur in het donker.
  4. Na het kleuren aspiratief je de kleuringsoplossing. Was de cellen grondig met gedestilleerd water om achtergrond- en vlekartefacten te verwijderen. Voeg 1 ml gedestilleerd water toe om de cellen af te dekken. Maak onmiddellijk brightfield-beelden met een omgekeerde microscoop.

8. BODIPY

  1. Verdun de BODIPY-voorraadoplossing met steriel water in een volumeverhouding van 1:200 om de werkoplossing te bereiden.
  2. Was de dekfolies van de cel met steriele PBS. Voeg 30 μL 4% paraformaldehydeoplossing toe aan elke deklaag en fixeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  3. Aspiraat het fixatiemiddel en was 3 keer met PBS. Voeg 30 μL BODIPY-werkoplossing toe aan elke celbedekking. Breng 30 minuten in het donker op kamertemperatuur.
  4. Was de dekfolies 3 keer met PBS. Voeg 30 μL DAPI-beits toe aan elke deklaag. Incubeer 10 minuten in het donker op kamertemperatuur om celkernen te labelen.
  5. Was de dekfolies nog drie keer met PBS. Ga verder met monteren: Voeg 10 μL antifade montagemedium toe aan een schone microscoopglaas. Met een tang draai je de celdeksel (celzijde naar beneden) voorzichtig om op het montagemedium. Laat de mountant in het donker drogen.
  6. Maak onmiddellijk beelden met een laserscanning confocale microscoop.

9. Statistische analyse

  1. Elk experiment bevatte drie biologische replica's. Analyseer data met behulp van de GraphPad Prism 10.0-software. Presenteer kwantitatieve gegevens, die voldoen aan de criteria voor normale verdeling als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). Voor twee groepen die voldoen aan normaliteit en homogeniteit van variantie, pas de onafhankelijke steekproeven t-test toe. Voor meerdere groepen wordt eenrichtings-ANOVA uitgevoerd, p < 0,05 als statistisch significant beschouwd.

10. Veiligheid en afvalverwerking

  1. Behandeling van dierlijk weefsel
    1. Voer alle procedures uit waarbij primaire cellen betrokken zijn in een Klasse II bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden.
    2. Classificeer al het dierlijke weefselafval, ongebruikte organen en besmette verbruiksartikelen als biologisch gevaarlijk afval. Plaats dit afval in aangewezen biohazardzakken, verwerkt via autoclaving en uiteindelijk verwijderd.
  2. Behandeling van Dexamethason
    1. Draag handschoenen, medische maskers en labjassen bij het wegen van Dexpoeder. Voer de voorbereiding van de oplossing uit in een chemische dampkap.
    2. Verzamel afval dat met Dex is besmet apart en doe het als chemisch afval.
  3. Omgang met biogevaarlijke stoffen
    1. Desinfecteer werkoppervlakken en het interieur van bioveiligheidskasten grondig met 70% ethanol voordat de experimentele procedures kunnen beginnen.
    2. Zorg ervoor dat al het vloeibare afval dat uit celkweek wordt geproduceerd, wordt geautoclaveerd om het niet-besmettelijk te maken voordat het wordt afgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SVF-cellen geïsoleerd uit de iWAT van C57BL/6J-muizen vertoonden bij het eerste zaaien in kweekschalen een punctate suspensie. Ongeveer 40% van de cellen voltooide de primaire hechting na 18 uur zaaien; op dag 5 na het zaaien waren de cellen volledig verspreid, met een confluence van 95% (Figuur 1A, B). Wanneer cellen confluentie bereikten en een karakteristieke vortexachtige opstelling vertoonden, werd het differentiatiemedium vervangen. Op...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgebreid onderzoek wijst uit dat SVF-celmodellen een unieke waarde bieden bij het simuleren van pathologische kenmerken van vetweefsel. De lange constructiecyclus van deze modellen, die doorgaans ongeveer 14 dagen vereist voor weefselisolatie, primaire kweek, geïnduceerde differentiatie en Dex-behandeling, vormt echter uitdagingen voor de experimentele continuïteit en stabiliteit van cellulaire toestand. Om deze uitdagingen aan te pakken, hanteerde en optimaliseerde deze studie een exp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflict aan in dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82260177) en het State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Treatment of High Incidence Diseases in the Central Asia Program (SKL-HIDCA-2023-20). De financieringsinstantie had geen invloed op het ontwerp, de uitvoering of interpretatie van deze studie. De financieringsinstantie heeft niet deelgenomen aan het schrijven of indienen van dit manuscript voor publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm filterBiosharpBSF-XS-0232-01
2-NBDGBeyotimeS0561M
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma15879
4% PolyformaldehydeBiosharpBL1278A
70 μm cell strainerBiosharpBS-70-CS
Anti-AKTProteintech10175
Anti-C/EBPαAbcloneab40764
Anti-FABP4Cell Signaling Technology 2120S
Anti-pAKT (Ser473)Proteintech28731
Anti-PI3K Bioss10657R
Anti-pPI3K (p110)Bioss6417R
Anti-β-ACTINProteintech60008
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
BODIPY 493/503InvitrogenD3922
BSA SigmaA7030
Cell climbing slices Biosharp BiosharpBS-14-RC
Cell Culture Dish, 100mm x 20mmCorning430167
Cell Culture Dish, 35mm x 10mmCorning430165
DAPI SolutionSolarbio28718-90-3
DexamethasoneSigmaD2915
DMEM/F-12GibcoC11330500BT
Dulbecco’s PBSCytivaSH30264.02
Eppendorf tubeCorningMCT-175-C 
FBSLife-iLabAC03L0555
Fluorescence microscopeLeicaDMi8
Glucose oxidase-peroxidaseNanjing JianchengF006-1-1
Goat anti-mouse IgG-HRPBeijing Zhongshan JinqiaoZB-2305
Goat anti-rabbit IgG-HRPBeijing Zhongshan JinqiaoZB-2301
GraphPad PrismVersion 10.0.0/
HepesBioFroxx1112GR025
HochestbiosharpBL803A
ImageJVersion 1.54p/
InsulinSolarbio18040
Laser scanning confocal microscopeNikon Ti-E
Mounting Medium antifadingSolarbioS2100
Oil red O staining solutionSigmaO0625-25G
Penicillin-StreptomycinhycloneSV30010
RIPA BufferThermo Fisher89901
RosiglitazoneSigmaR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
Skim Milk PowderBioFroxx1132GR500
TBS BufferSolarbioT1060
Type II collagenaseSigmaC6885

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Insulinesignaleringadipogene differentiatieglucoseopnamemodel voor insulineresistentiePI3K AKT routedexamethason inductieprimaire adipocyten

Gerelateerde artikelen