Methodenartikel

Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

408 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een nieuw apparaat dat isotrope en uniaxiale spanningsgolfvormen op cellen toepast, terwijl het cultuur ondersteunt op substraten met instelbare stijfheid en aanpasbare eiwitmatrices. Dit eenvoudige, economische platform stelt onderzoekers in staat te onderzoeken hoe mechanische signalen de cellulaire functie reguleren in zowel fundamentele studies als ziektegerelateerde contexten.

Samenvatting

Cellen reageren op mechanische signalen uit hun omgeving, zoals veranderingen in stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) en cyclische spanning, die cellulaire processen reguleren zoals het bepalen van het cellot, intercellulaire communicatie en ontwikkeling. Veranderingen in deze krachten dragen bij aan of stimuleren de ziekteprogressie bij aandoeningen zoals astma, hoge bloeddruk en kanker. Hoewel bestaande in-vitro rekapparaten uniaxiale of isotrope spanningen kunnen opleggen, gebruiken ze vaak niet-fysiologische stijfheden, beperken ze live imaging of kunnen ze geen hoge spanningsamplitudes bereiken die relevant zijn voor fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier presenteren we een compact, microscoopcompatibel stretcher apparaat dat gecontroleerde isotrope of uniaxiale spanning toepast op hechtende cellen op elastomeerkweekschotels. Deze schalen hebben een instelbare Young-modulus en zijn compatibel met verschillende matrixproteïnecoatings voor celadhesie, waardoor onafhankelijke modulatie van substraatstijfheid en ECM-samenstelling mogelijk is. Belangrijk is dat het gebruiksgemak van het apparaat wordt vergemakkelijkt door het door de stappenmotor aangedreven ontwerp, dat de generatie van programmeerbare cyclische golfvormen ondersteunt. We tonen de capaciteit van het apparaat aan door intracellulaire calciumdynamica en celtractiekrachten in primaire gladde spiercellen van de menselijke luchtweg te kwantificeren onder mechanische rek. Dit platform biedt een veelzijdig hulpmiddel om het effect van mechanische signalen op de cellulaire functie in zowel gezonde als ziektegerelateerde contexten te onderzoeken.

Inleiding

Cellen ervaren mechanische krachten uit hun omgeving die een cruciale rol spelen bij het reguleren van veel aspecten van de cellulaire functie, waaronder het bepalen van cellot 1,2, intercellulaire communicatie 3,4 en gezonde groei 2,5. Daarnaast kunnen veranderingen in deze mechanische krachten leiden tot een verhoogde ziekteprogressie en het ontstaan van de ziekte, waaronder extracellulaire matrix (ECM) remodeling6 en tumorgroei 7,8,9,10. Cellen kunnen deze mechanische signalen waarnemen en erop reageren, waaronder veranderingen in de stijfheid van de ECM4, evenals cyclische spanning in organen zoals het hart, de longen en de spieren11,12. In vitro-studies hebben aangetoond dat ECM-stijfheid en samenstelling de stijfheid van het celcytoskelet kunnen beïnvloeden, zowel in rust als na blootstelling aan contractiele agonisten13. Talrijke in vitro- en in situ-studies hebben onderzocht hoe transiente, statische en cyclische stammen cellen en weefsels beïnvloeden, en hebben aangetoond dat reacties variëren op basis van stamtype, snelheid en amplitude14. Recente studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat een tijdelijke rek de stijfheid van hechtende cellen vermindert in verhouding tot de toegepaste spanning, waarbij een aanhoudende toename van de spanning leidt tot een aanvankelijke snelle toename van stijfheid, gevolgd door een geleidelijke ontspanningvan 15. Bovendien wordt calciumsignalering, de primaire moleculaire regelaar van krachtgeneratie, beïnvloed door rek en andere mechanische krachten 4,16,17,18,19,20. Het bestuderen van hoe stijfheid en spanning mechanobiologische routes beïnvloeden, vereist dat beide factoren worden gemoduleerd terwijl cellulaire reacties worden gemonitord. Daarom ontwikkelden we een nieuwe microscoopcompatibele celstretcher die zowel isotrope als uniaxiale rek kan induceren, met onafhankelijke controle over substraatstijfheid, matrixproteïnecoating en een reeks programmeerbare golfvormen.

In het verleden hebben onderzoekers op vergelijkbare wijze apparaten ontwikkeld om specifieke bewegingen en mechanische rekbewegingen op celculturen en weefsels uit te voeren21,22. Het eenvoudigste geval, uniaxiale beweging, is een mechanische rek die op één dimensie wordt opgelegd. Zo zijn er apparaten ontwikkeld om mechanische rek en spanning uit te oefenen op weefselstrips23 en collageenvezels24, of om cellulaire oriëntatie uit te lijnen en cellulaire migratiete induceren. Isotrope rek verwijst naar een type uitrekking waarbij een gelijke kracht wordt uitgeoefend op een gel of substraat vanuit alle richtingen, wat resulteert in een uniforme spanning over het materiaal. Deze rek simuleert de gelijkmatige krachtverdeling die cellen ervaren in bepaalde fysiologische omgevingen, zoals in de alveolen van de longen, waar cellen tijdens het ademhalingsproces worden blootgesteld aan radiale uitzetting en contractie26,27.

Bestaande brancard apparaten hebben verschillende beperkingen die hun gebruik voor mechanobiologie-gerelateerd onderzoek beperken. Veel ontwerpen gebruiken substraatstijfheidswaarden die het typische fysiologische bereik overschrijden om mechanische belasting te weerstaan en het gewicht van celkweekmedium28 te ondersteunen. Het gebruik van dergelijke niet-fysiologische stijfheid kan echter ook het celgedrag beïnvloeden, waardoor de relevantie van het model voor natuurlijke weefselomgevingenmogelijk beperkt kan worden 29. Bovendien blokkeren sommige brancardontwerpen het objectief of het lichtpad, waardoor beeldvorming wordt verhinderd, terwijl andere membranen gebruiken die te dik zijn voor helder observatie. Zelfs wanneer stretchers compatibel zijn met microscopen en dunne substraten gebruiken, komen problemen zoals membraanverzakking en concentratieverlies vaak voor. Commerciële platforms zoals Flexcell gebruiken vacuümgebaseerde vervorming om flexibele membranen te rekken. Hoewel deze aanpak stabiele, homogene rekvelden kan genereren, is deze niet geoptimaliseerd voor live-cel microscopie en vereisen microscoopcompatibele configuraties dure extra accessoires. Bovendien kunnen deze platforms een maximale stam van slechts 21,8% bereiken, terwijl diepe inspiraties stammen boven de 30% kunnen produceren, met zelfs hogere stammen waargenomen bij ziekten zoals astma en COPD31.

Daarom hebben we een nieuw celstretchapparaat ontworpen dat nauwkeurige materiaalcontrole van substraatstijfheid en ECM-samenstelling mogelijk maakt, terwijl variabele isotrope en uniaxiale vervormingen op hechtende cellen kunnen worden toegepast. Dit platform is zeer geschikt voor onderzoekers die mechanobiologische vragen onderzoeken en live imaging nodig hebben tijdens mechanische stimulatie met substraten met fysiologisch relevante stijfheid. Het apparaat gebruikt een mechanisch aangedreven benadering geïnspireerd op de geometrie van een tweedimensionale Hoberman-bol, die uitzet en samentrekt via schaarachtige verbindingen (Figuur 1, Aanvullende Figuur 1). Een enkele stappenmotor drijft 16 radiaal gerangschikte armen aan via een verbindingsmechanisme, wat zorgt voor gecoördineerde uitzetting en krimp van acht bevestigingspennen. Deze configuratie genereert homogene in-vlak rek door gelijke radiale verplaatsing gelijktijdig op alle pennen toe te passen. Het unieke ontwerp en de compacte afmetingen van het apparaat maken live-celbeeldvorming mogelijk met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop tijdens in-vlak isotrope en uniaxiale stretch, tegen een fractie van de kosten van commerciële alternatieven. De lineaire stappenmotor wordt aangestuurd met een aangepaste Arduino-code, waardoor programmeerbare cyclische golfvormen met instelbare perioden en amplitudes mogelijk is. In deze studie tonen we aan dat het apparaat precieze en reproduceerbare spanningen levert variërend van minder dan 1% tot 15%, met een geometrische capaciteit van meer dan 200%. Daarnaast kwantificeren we de effecten van mechanische rek op intracellulaire calciumdynamica en celtractiekrachten van de primaire gladde spiercellen van de menselijke luchtweg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De primaire milde cellen van de milde luchtweg (ASMC's) die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van ATCC (Virginia), en donorinformatie werd gedeïdentificeerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen. Deze studie werd goedgekeurd door de Biosafety Committee van Northeastern University voorafgaand aan de experimenten.

OPMERKING: Voor instructies over de fabricage van het apparaat en de afmetingen van het apparaat, zie het CAD-bestand dat beschikbaar is op onze GitHub-repository: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Ontwerp van 3D-geprinte mal

  1. Isotrope malafmetingen
    1. De buitendiameter van de mal is 37 mm.
    2. De buitenste hoogte van de mal is 4,1 mm.
    3. De dikte van de buitenwand is 2,1 mm.
    4. De bodemdikte van de mal is 2 mm.
    5. De bevestigingsgaten bevinden zich 2 mm van de rand.
    6. Het binnenste celkweekputoppervlak heeft een diameter van 20 mm en een diepte van 1,9 mm.
      OPMERKING: De voltooide PDMS-mal moet een cellulatiecultuurdikte van 200 μm hebben.
  2. Uniaxiale malafmetingen
    1. De buitenafmetingen van de mal zijn 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x B x H).
    2. De bevestigingsgaten zijn 3 mm vanaf de breedte en 4 mm vanaf de lange rand, met een paaldiepte van 1 mm.
    3. De dikte van de buitenwand is 1,5 mm aan de breedte en 2 mm aan de lange rand.
    4. De afmetingen van de binnenste celkweekput zijn 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x B x H).
    5. De basisdikte is 2 mm.
      OPMERKING: Mallen zijn ontworpen in SolidWorks, 3D-geprint met een FormLabs vloeibare grijze harssysteem, en vervaardigd in de makerspace van Northeastern University.
  3. Instructies alleen voor het eerste gebruik van de mal
    1. Schuur de ruwe randen van de malprint af.
    2. Breng de negatieve schimmel in met transparante nagellak om het verwijderen van de PDMS-schimmel na het uitharden te vergemakkelijken. Laat de schimmel 24 uur aan de lucht drogen.

2. Fabricage van optisch heldere, elastische gels met instellbare substraatstijfheid voor celkweek

OPMERKING: Draag geschikte PBM (handschoenen, labjas, oogbescherming) bij het hanteren van PDMS en NuSil.

  1. Voeg Sylgard 184 basis en uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 per gewicht toe aan een plastic schaal.
  2. Meng krachtig met een tongspatel (of een vergelijkbaar hulpmiddel) gedurende 2-3 minuten.
  3. Ontgass het mengsel 1 uur.
  4. Giet het PDMS-mengsel in de aangepaste negatieve mal (Figuur 2A,B).
    1. Voeg 1,3 g toe aan de isotrope mal.
    2. Voeg 0,5 g toe voor de uniaxiale mal.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gel gelijkmatig over de mal wordt verdeeld.
  5. Ontgass de mal 1 uur.
  6. Laat de gel in de mal 2 uur op een vlak oppervlak bij kamertemperatuur zakken.
  7. Uitharden bij 60 °C 's nachts.
  8. Mix de delen A en B van NuSil Gel-8100 in gelijke verhoudingen (1:1) gedurende 15 minuten.
    1. Meng met Sylgard 184 crosslinker bij 0,36% van het totale volume om een substraat te produceren met een stijfheid van 13 kPa 32.
    2. Voeg geen crosslinker toe om een substraat te produceren met een stijfheid van 0,3 kPa.
  9. Ontgass het mengsel 30 minuten.
  10. Verwijder voorzichtig de PDMS-gel uit de custom mall. Leg de gel op een deklaag van 40 mm.
    OPMERKING: Let erop dat je de gels niet scheurt, want ze zijn kwetsbaar.
  11. Giet het NuSil-mengsel op het negatieve gebied van de PDMS-gel.
    1. Isotrope gel: 100 μL.
    2. Uniaxiale gel: 50 μL.
  12. Bedek de respectievelijke PDMS-gels met het NuSil-mengsel met een spincoater gedurende 50 seconden van 7 x g om een uniforme substraatdikte van 100 μm te bereiken.
  13. Laat de gel 2 uur op een vlak, vlak oppervlak bij kamertemperatuur zakken voordat het een nacht bij 60 °C wordt uitgehard.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle uithardingsstappen op een vlak oppervlak worden uitgevoerd. Een ongelijke gel laat het volledige interessegebied niet in het beeldvlak van de microscoop blijven. Als beeldvorming scherpstellingsvariatie over het gezichtsveld laat zien, kan de gel zijn uitgehard op een ongelijkmatig oppervlak en moet opnieuw worden gemaakt.
  14. Bewaar de voltooide celkweekschalen in afgedekte petrischalen tot gebruik (Figuur 2D-E).

3. Matrixproteïnecoating

  1. Voeg 500 μL poly-L-lysine (PLL, 500 μg/mL) toe aan elk substraat.
  2. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  3. Was substraten 3 × met 1 mL PBS, gevolgd door 3 × met 1 mL 10 mM HEPES-buffer (pH 8,0).
  4. Voeg 500 μL mPEG-SVA (50 mg/mL) toe aan elk substraat.
  5. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  6. Was de substraten 3 × met 1 ml PBS.
  7. Vervang PBS door 500 μL PLPP (14,5 mg/mL).
  8. Met het PRIMO micropatterning-systeem en Leonardo-software projecteer je het vooraf gedefinieerde patroon op het substraatoppervlak met UV-licht gedurende 30 seconden.
  9. Was de substraten 3 × met 1 ml PBS en plaats ze 15 minuten onder UV voor sterilisatie.
  10. Voeg 500 μL 0,1% fluoresceïne geconjugeerde gelatine toe aan elk substraat.
  11. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  12. Was 3 × met 1 ml PBS.
    OPMERKING: Om patronen te visualiseren, incubeer je met 0,1% fluorescein-geconjugeerde gelatine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  13. Ga verder met beeldvorming.

4. Cultuur van gladde spiercellen in elastische schalen in de menselijke luchtweg

OPMERKING: Voer alle celkweekprocedures uit in een bioveiligheidskap met behulp van de standaard aseptische techniek.

  1. Verkrijg primaire menselijke warme spiercellen (ASMC's) van ATCC (Virginia) en zorg ervoor dat donorinformatie wordt gede-identificeerd volgens de NIH-richtlijnen. Bevestig goedkeuring door de Institutional Biosafety Committee voordat je experimenteert.
  2. Gebruik cellen van drie gezonde menselijke donoren van verschillende geslachten en leeftijden zonder voorgeschiedenis van astma/ziekte. Voorbeeld: één vrouw (18 jaar) en twee mannen (34 en 59 jaar).
  3. Kweek cellen onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO ₂) en gebruik cellen tot passage 6 voor alle experimenten.
  4. Kweek cellen in het volgende volledige groeimedium:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. 10% foetaal rundereserum (FBS) (50 mL)
    3. 1× penicilline/streptomycine (5 mL)
    4. 1× MEM niet-essentiële aminozuren (5 mL)
    5. Amfotericine B (0,5 mL)
  5. Schakel de cellen minstens 24 uur voor de meting over op een serumvrij medium. Bereid serumvrij medium met:
    1. Ham's F-12 medium (500 mL)
    2. 1 × penicilline/streptomycine (5 mL)
    3. Amfotericine B (50 μg/L)
    4. 1× MEM niet-essentiële aminozuren (5 mL)
  6. UV-steriliseer rekbare celkweekschotels gedurende 15 minuten.
  7. Incubeer gesteriliseerde schalen met 0,1% gelatine gedurende 1 uur op kamertemperatuur vóór het zaaien (Figuur 2F).
    1. Voor patroonbodems:
      1. Zaadcellen in elastische celkweek wellen met een dichtheid van 104 cellen/cm².
      2. Incubeer 10 minuten in 10% serummedium om hechting aan patroongebieden te bevorderen.
      3. Was putten met PBS om losstaande cellen te verwijderen.
      4. Vul putten met 10% serummedium en laat ze 24 uur incuberen.
      5. Vervang door serumvrij medium en incubeer 24 uur voordat je meet.
    2. Voor niet-patroonbodems:
      1. Zaadcellen met de gewenste dichtheid: 102 cellen/cm2 voor geïsoleerde cellen. 103 cellen/cm2 voor dunne cellen. 104 cellen/cm,2 voor confluente cellen.
      2. Incubeer in 10% serummedium gedurende 24 uur.
      3. Vervang door serumvrij medium en incubeer 24 uur voordat je meet.

5. Fluorescerend calciumbeeldvorming en analyse

  1. Serum-honger luchtweg-ASMC's gedurende 24 uur.
  2. Bereid FLIPR Ca2+ 6 kleurstof volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Meng FLIPR Ca2+ 6 kleurstof met serumvrij medium in een verhouding van 1:1.
  4. Incubeer cellen met de FLIPR Ca ² ⁺ 6-oplossing bij 37 °C en 5% CO ₂ gedurende 2 uur.

6. Beeldvorming opstellen

  1. Gebruik een Leica DMi8 omgekeerde microscoop uitgerust met:
    1. Leica DFC6000 camera
    2. Leica LED8 lichtmotor
    3. 5×/0,12 droge objectie
  2. Stel excitatie in op 480/40 nm en emissie op 527/50 nm.
  3. Verslaat 16-bits beelden met een framerate van 2 Hz tijdens stretch-experimenten.

7. Data-analyse

  1. Importeer beeldreeksen in Fiji (ImageJ) 33.
  2. Definieer handmatig interessegebieden (ROI's) in het cytoplasma van elke cel.
  3. Haal de gemiddelde grijswaardenintensiteit voor elke ROI over tijd uit.
  4. Verwerk fluorescentieintensiteitsgegevens met een aangepast MATLAB-script.
    OPMERKING: Fluorescentieintensiteit is evenredig met cytosolisch [Ca2+].

8. Metingen en analyse van de tractiekracht

OPMERKING: Alle codes, inclusief die voor beeldanalyse, tractiekrachtmicroscopie en motorcontrole, zijn beschikbaar in onze GitHub-repository: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Bedek PDMS-NuSil gelsubstraten met een laag fluorescerende kralen om te dienen als fiduciale markers voor tractiekrachtmicroscopie.
  2. Bereid een 0,025% oplossing van 1 μm diameter rode fluorescerende carboxylaat-gemodificeerde microsferen voor in HBSS door te verdunnen tot een verhouding van 1:4000.
  3. Vortex de kraaloplossing voor 10 seconden.
  4. Voeg de kralenoplossing toe aan de gel.
    1. 880 μL naar isotrope gel.
    2. 420 μL naar uniaxiale gel.
  5. Incubeer 1 uur op kamertemperatuur zodat de kralen kunnen hechten.
  6. Na 1 uur verwijder je de oplossing voorzichtig.
    OPMERKING: Giet de kraaloplossing voorzichtig af op zachte gels. Onjuiste verwijdering verhindert een juiste distributie van de kralen.
  7. Dep voorzichtig eventuele restoplossingen met een wattenstaafje of kimwipe.
  8. Maak beeld van de kralen met een Leica DMi8-microscoop uitgerust met een 10x/0,32 droogobjectief.
  9. Maak beelden in de pre-stretch conditie en continu gedurende het stretchingprotocol.
    OPMERKING: Voer alle beeldvorming uit in het midden van het substraat waar de uniformiteit van de spanning het hoogst is. Indien nodig, focus de microscoop opnieuw op de uitgerekte positie voordat je beelden maakt.
  10. Analyseer de beelden met behulp van een aangepaste MATLAB-code gebaseerd op Fourier-tractiekrachtmicroscopie om verplaatsingsvectoren en bijbehorende vlakke rekvelden 34 te berekenen.
  11. Geef de gegevens aan als het gemiddelde van N onderzoeken.

9. Kalibratie van het celstretchapparaat

  1. Voeg 500 μL H₂O toe aan de put om het gewicht van celkweekmedia te simuleren en het eiwitpatroon vochtig te houden.
  2. Voor protocol met betrekking tot het creëren van specifieke eiwitpatronen, zie sectie 3 getiteld "Matrix Protein Coating".
  3. Beeld fluorescentiepatronen elke 400 μm stappen van de motorverplaatsing in, oplopend tot een maximum van 2800 μm, en daarna terugkeren naar nul in omgekeerde stappen van 400 μm.
  4. Karakteriseer de relatie tussen lineaire verplaatsing van de stappenmotor en isotrope vervorming van de rekbare celkweekschotel op zowel macroscopische als regionale schaal door de veranderingen in oppervlakte en excentriciteit van fluorescerende eiwitpatroonletters die "BREATHE" spellen op het elastische substraat tijdens het rekken te meten. Gebruik een rechthoekige begrenzingsbox die alle letters omvat om het oppervlak en de excentriciteit van het hele woord te berekenen.
  5. Pas beeldsegmentatie toe in MATLAB om deze parameters voor elke afzonderlijke letter te kwantificeren.
  6. Definieer nul verplaatsing door de niet-uitgerekte dimensies van de celkweekschotel.
  7. Herhaal elk experiment in twee tot drie onafhankelijk voorbereide rekbare celkweekputten om reproduceerbaarheid te waarborgen.

10. Datapresentatie en statistisch testen

  1. Voor brancardkalibratie-experimenten definieer proeven als het aantal cycli.
  2. Toon elke proef afzonderlijk in plaats van ze samen te voegen tot één curve om de herhaalbaarheid van het systeem aan te tonen.
  3. Geef foutbalken aan als standaarddeviatie.
  4. Gebruik een eenrichtings-ANOVA om significante verschillen te testen in datasets met drie of meer groepen die door één onafhankelijke factor worden beïnvloed.
  5. Gebruik tweerichtings-ANOVA's gevolgd door post-hoc paarwijze vergelijkingen om significante verschillen te testen in datasets die door twee onafhankelijke factoren worden beïnvloed.
  6. Pas de t-test toe voor paargewijze vergelijkingen wanneer gegevens normaal verdeeld zijn.
  7. Pas de Mann-Whitney rank sum-test toe om mediaanwaarden te vergelijken wanneer gegevens niet normaal verdeeld zijn.
  8. Rapporteer de specifieke tests, het aantal monsters en de bijbehorende P-waarden, samen met de resultaten.
  9. Gebruik een P-waarde drempel van 0,05 om statistisch significante verschillen tussen datasets te bepalen.
  10. Voer statistische tests uit in SigmaStat.
  11. Plotfiguren in GraphPad Prism en MATLAB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De celstretcher veroorzaakt macroscopische gebiedsveranderingen die plaatselijke vervormingen weerspiegelen. Om isotrope gedragingen te beoordelen, hebben we de oppervlakteveranderingen gemeten van een fluorescerend gelatine-eiwitpatroon dat het woord "BREATHE" vormt op een rekbare celkweekput, samen met de afzonderlijke letters op een isotroop substraat. Onze resultaten toonden aan dat zowel het woord als de afzonderlijke letters equivalente veranderingen in oppervlakte vertoonden (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we het ontwerp, de ontwikkeling, validatie en implementatie van een nieuwe microscoop-compatibele celstretcher die isotrope en uniaxiale stammen kan nabootsen terwijl hij tegelijkertijd levende cellen in beeld neemt. Dit apparaat is compact en past op een Leica DMi8 microscoopstage, waarbij alle bewegende delen in één vlak worden beperkt om live beeldvorming mogelijk te maken terwijl de focus op het substraat en de onderliggende cellen behouden blijft. Dit wer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft concurrerende belangen om aan te geven.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken meneer Noah Joseph voor zijn hulp bij het fabriceren van de mallen. De auteurs bedanken Heitor Mourato en Glenn Thayer van de Boston University Scientific Instrument Facility voor hun hulp bij het bewerken van het apparaat. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (NSF) Career Grant #2047207 toegekend aan Harikrishnan Parameswaran. H.P. bedacht het onderzoek. S.E.S. en S.R.P. ontwikkelden het algehele ontwerp van het apparaat, en S.E.S. en H.P. ontwierpen de isotrope experimenten. S.E.S voerde de isotrope mallexperimenten uit, analyseerde de experimentele gegevens en interpreteerde de resultaten samen met H.P. V.C. ontwierp de uniaxiale mallen, optimaliseerde de gelvoorbereiding en kralen. B.M.G voerde de uniaxiale gelexperimenten uit, analyseerde de experimentele gegevens en interpreteerde de resultaten samen met H.P. en V.C. S.E.S. en B.M.G. stelden de cijfers op. B.M.G., S.E.S, V.C. en H.P droegen bij aan het opstellen en redigeren van het manuscript. H.P keurde de definitieve versie van het manuscript goed.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-benzoylbenzyl) trimethylammonium chloride (PLPP)AlvéoleN/A14.5mg/mL
0.1% fluorescein conjugated gelatin InvitrogenG13187
0.1% Gelatin SolutionSigma-AldrichES-006500 mL 
1 μm diameter red fluorescent carboxylate-modified microspheresFluoSpheresF8816
1× MEM nonessential amino acid solutionSigma-AldrichM7145100 mL
1× penicillin/streptomycinFisher Scientific15-140-122100 mL
10% fetal bovine serumThermo-ScientificA5256701500 mL 
15 mL tubeFisher Scientific14-959-53A
1x glutamine Fisher ScientificMT10010CM
1x Insulin-Transferrin-Selenium Growth SupplementCorning Life Sciences25-800-CR
amphotericin BSigma-AldrichA294225 μg/liter
Ball BearingsMcMaster-Carr N/A
Calcium Chloride DihydrateSigma-Aldrich223506
Carriage RailMcMaster-Carr N/A
FLIPR Ca2+ 6Molecular DevicesR8190
GraphPad PrismDotmaticsN/A
Ham’s F-12 medium Sigma-AldrichN8641500 mL 
Hanks' Balanced Salt Solution Thermo-Scientific14025092500 mL 
HEPES buffer Thermo-Scientific15630080100 mL
Leonardo SoftwareAlvéoleN/A
MatlabMathworksN/A
methoxy polyethylene glycol–Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)Laysan Bio IncN/A50mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil N/A
Petri DishesThermo-Scientific26399190 mm 
phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poly-L-lysine (PLL)Sigma-AldrichP8920500μg/mL
Primary human airway smooth muscle cells ATCCPCS-130-011
PRIMO optical module AlvéoleN/A
ScrewsMcMaster-Carr N/A
SigmaStatSystat SoftwareN/A
Spin CoaterLaurellModel WS-650MZ-23NPPB
Stretcher and Stage Attachment Components Boston University's Scientific Instrument FacilityN/AStainless Steel
Sylgard 184 base Elastomer and Curing agent kitDowH047J8Q026
T-25 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCellTreat229331
Tongue depressor Thermo-Scientific22-363-154

Referenties

  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celrekkingmechanische stimulitractiekrachtmicroscopieintracellulaire calciumimagingsubstraatstijfheidisotrope rekuniaxial rekmenselijke gladde luchtwegspiercellenlive cell imagingelastomere kweekschaal

Gerelateerde artikelen