Deze studie onderzocht het effect van elektroacupunctuur (EA) op vasculaire disfunctie veroorzaakt door veel zout. EA keerde vasculaire schade en darmdysbiose om, mogelijk door specifieke darmmicroben te moduleren.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Deze studie onderzocht het effect van elektroacupunctuur (EA) op vasculaire disfunctie veroorzaakt door veel zout. EA keerde vasculaire schade en darmdysbiose om, mogelijk door specifieke darmmicroben te moduleren.
Deze studie heeft als doel het therapeutisch potentieel en de mechanismen van elektroacupunctuur (EA) te onderzoeken bij het verlichten van vasculaire disfunctie veroorzaakt door zoutrijke diëten, met een focus op modulatie van darmmicrobiota. We verdeelden willekeurig 21 ratten in Normal Control, High-Salt Model en EA Intervention groepen (n = 7 per groep). Het "high-salt blood stasis syndrome" model bij Wistar-ratten werd geïnduceerd door intragastrische perfusie van 12% NaCl. De behandelingen werden uitgevoerd tussen 17:00 en 19:00 uur Beijing-tijd: ratten werden vastgebonden met een zachte doek, gevolgd door 20-minuten EA-stimulatie bij BL23 en KI3. Na het experiment werden rattenbloed, bloedvaten en ontlasting verzameld. Vasculaire effecten werden geëvalueerd via een coagulatiefunctietest, hemorheologische analyse en arteriële histopathologische beoordeling. 16S rDNA-sequencing werd gebruikt om de samenstelling en abundantieveranderingen van darmmicrobiota te analyseren. De bevindingen toonden aan dat chronische hoge zoutinname de viscositeit van het bloed verstoorde, de integriteit van de vasculaire endotheliale integriteit beschadigde en de darmmicrobiele dysbiose veroorzaakte. Opmerkelijk genoeg keerde de behandeling met EA deze pathologische veranderingen effectief om. Correlatieanalyse identificeerde verder specifieke darmmicrobiota (bijv. Lachnospiraceae en Ruminococcaceae) die sterk correleerden met veranderde bloedviscositeitsparameters (P < 0,05). Daarom concludeert de huidige studie dat door een hoog zoutdieet veroorzaakte vasculopathie kan worden omgekeerd door EA-behandeling, wat mogelijk wordt toegeschreven aan EA's vermogen om de darmmicrobiota te reguleren die betrokken is bij galzuurmetabolisme en kortketenvetzuursynthese.
Voedingszout speelt een cruciale rol bij het behouden van de vochtbalans en cellulaire homeostase, maar overmatige consumptie vormt een goed gevestigde risicofactor voor hart- en vaatziekten1. De Wereldgezondheidsorganisatie raadt aan om de dagelijkse natriuminname te beperken tot minder dan 5 gram voor gezonde volwassenen2. Onderzoek heeft aangetoond dat een zoutrijk dieet (HSD) de vasculaire functie aantast en dat hart- en vaatziekten (CVD), de meest voorkomende ziekte ter wereld, vaak gepaard gaan met vasculopathie3. Deze bevindingen onderstrepen dat het herstellen van vasculaire endotheelschade veroorzaakt door HSD een cruciale strategie is om CVD-progressie te voorkomen. "Bloedstasissyndroom" (gekenmerkt door stagnerende bloedcirculatie en interne bloedophoop) sluit aan bij meetbare stollingsstoornissen in de moderne geneeskunde. Belangrijke validatiebiomarkers zijn onder andere significant verkorte protrombinetijd (PT) en geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT), evenals duidelijk verhoogde fibrinogeen (FIB) en trombinetijd (TT). Deze indicatoren weerspiegelen een hyperstollingsbare toestand, die direct overeenkomt met de pathologische kenmerken van bloedstasis.
Darmmicrobiota, die zich in het hele maag-darmkanaal bevindt, fungeert als belangrijke regelaar van immunometabole processen en intestinale homeostase en beïnvloedt diverse fysiologische en pathologische routes4. Nieuw bewijs wijst erop dat overmatige zoutconsumptie darmdysbiose en voedingsdisbalans veroorzaakt, wat pro-inflammatoire immuunactivatie veroorzaakt die zich uit als gelokaliseerde ontsteking en tegelijkertijd microcirculatieschade, vasculaire remodelering en systemische endotheeldisfunctiebevordert 1,5. Chronische HSD is gerapporteerd als een relatieve toename van de niveaus van Bacteroides intestinalis, Aspergillus en Prevotella spp. bij muizen, en is in verband gebracht met bijdragen aan de ontwikkeling van hypertensie en vasculaire ontsteking6.
Acupunctuur, een hoeksteen van de Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM), maakt gebruik van nauwkeurige naaldinvoeging bij specifieke acupuntenpunten als een op bewijs gebaseerde complementaire en alternatieve therapie in de klinische praktijk. De National Institutes of Health (NIH) en de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) erkennen acupunctuur als een klinisch gevalideerde interventie voor meerdere pathologische aandoeningen. Nieuw bewijs toont aan dat acupunctuur een dubbel therapeutisch mechanisme heeft 7,8, waarbij de samenstelling van de darmmicrobiota wordt gemoduleerd terwijl vaatontstekingsmediatoren worden onderdrukt, waardoor de pathologische progressie van gerelateerde aandoeningen gezamenlijk wordt gemiteerd. Belangrijk is dat acupunctuur effectief is in het verlagen van de bloeddruk en het herstellen van de endotheelfunctie in beschadigde bloedvaten9.
EA werd gekozen boven handmatige acupunctuur vanwege de gestandaardiseerde en kwantificeerbare stimulatieparameters, die de operatorafhankelijke variabiliteit verminderen en de reproduceerbaarheid van resultaten vergroten. Daarom onderzochten we het effect van EA-behandeling op de darmmicrobiota bij ratten met het high-salt blood stasis syndrome (HSBS) model en beoordeelden we de effectiviteit van EA bij high salt-induced vasculopathie door bloedreologie en vasculaire histopathologische veranderingen. Om de rol van darmmicrobiota bij de verbetering van vasculaire laesies door EA-therapie beter te begrijpen, hebben we een correlatieanalyse uitgevoerd tussen verschillende geslachten van darmmicrobiota en de totale bloedafsnijsnelheid en bloedsedimentatie.
We stelden daarom de hypothese op dat EA HSD-geïnduceerde vasculopathie verlicht door de homeostase van de darmmicrobiota te herstellen. Om dit te testen, wilden we: (i) de beschermende effecten van EA op de vaatfunctie en -structuur kwantificeren, en (ii) de specifieke darmmicrobiële taxa identificeren die door EA worden gemoduleerd en die correleren met deze verbeteringen. Bovendien identificeerde Pearson-correlatieanalyse significante microbiota-vasculaire relaties, met name tussen verschillend overvloedige fluctuaties in genera en hemorheologische afwijkingen. Voor zover wij weten is dit de eerste studie die de beschermende mechanismen van EA onderzoekt bij het verbeteren van door het zoutgehalte veroorzaakte vasculopathie vanuit het perspectief van de darmmicrobiota. Het experimentele ontwerp van deze studie is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: Experimenteel technisch diagram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het hele experiment werd uitgevoerd in het Experimenteel Centrum van de Basisschool Geneeskunde van Chengdu Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde. Alle dierenwelzijns- en experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierenwelzijn van de Chengdu Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde (Ethiek nr. 2024078). Experimenten werden strikt uitgevoerd volgens de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (herziening 1986, publicatie 86-23).
Dieren en dieet
Mannelijke en vrouwelijke specifiek pathogen-vrije (SPF) Wistar-ratten, 6-8 weken oud, wogen 200 ± 20 g. Alle ratten werden gehuisvest in goed geventileerde kamers met een licht-donkercyclus van 12 uur en hadden vrije toegang tot voedsel en water.
Modellen en groepen
Diermodellen werden geïnduceerd met verwijzing naar eerdere onderzoekservaringen10. Na een acclimatisatieperiode van 7 dagen werden 21 Wistar-ratten (50% mannelijk/vrouwtjesverdeling) willekeurig toegewezen aan drie experimentele groepen (n = 7/groep) met behulp van de random number generator in Excel, waarbij het aantal mannelijke en vrouwelijke ratten in elke groep ongeveer in balans werd gehouden om de impact van geslacht op de resultaten11 te minimaliseren. Normale controle (NC): Kreeg dagelijks maag-gavage (1 mL/100 g) gezuiverd water. High-Salt Model (HS) en EA Intervention (EA): Toegediend 12% NaCl-oplossing (1 mL/100 g) via dagelijkse gavage. Alle interventies werden 30 opeenvolgende dagen gehandhaafd.
EA-behandeling
De behandeling werd gestart de dag na het succesvolle modelleren. EA werd gekozen boven handmatige acupunctuur vanwege de gestandaardiseerde en kwantificeerbare stimulatieparameters, die de operatorafhankelijke variabiliteit verminderen en de reproduceerbaarheid van resultaten vergroten. De locaties van BL23 (Shenshu, blaasmeridiaan) en KI3 (Taixi, niermeridiaan) werden bepaald op basis van de criteria voor de lokalisatie van rattenacupunctuurpunten van de Chinese Acupuncture and MoxibustionSociety 12. BL23 bevindt zich 6 mm lateraal van de dorsale middenlijn, inferieur aan de tweede lumbale wervel. KI3 bevond zich in de halve depressie tussen het hoogste punt van de mediale malleolus en de achterrand van de achillespees. Het lokale haar bij de acupunkturen werd verwijderd en gesteriliseerd. Wegwerpsteriele acupunctuurnaalden (0,18 mm × 13 mm) werden gebruikt om de acupunkturen verticaal te doorboren, met inzetdieptes van 4-6 mm voor BL23 en 3-5 mm voor KI3. De positieve elektrodeclip van het elektroacupunctuurapparaat was verbonden met het naaldhandvat van de acupunctuurnaald bij BL23 aan één kant, en de negatieve elektrodeclip aan die bij KI3 aan dezelfde kant. Parameters van het elektroacupunctuurapparaat: Golfvorm: Dichte-schaarse golf (10/50 Hz); Frequentie: 5 s voor spaarzame golf, 10 s voor dichte golf; Intensiteit: 1-2 mA, aangepast aan de convulsieve en pijnlijke reacties van de ratten (schreeuwen, weerstandsgedrag); Pulsbreedte: ≤ 1 MS. Stimulatieprotocol: De interventie werd dagelijks uitgevoerd van 17:00 tot 19:00 uur (Beijing-tijd), elke keer 20 minuten. Cyclus: Eén behandelcyclus bestond uit 7 dagen, met in totaal 4 cycli en 1 rustdag tussen elke cyclus. Het specifieke proces is weergegeven in Figuur 2 (gemaakt met BioGDP.com13).

Figuur 2: Experimentele tijdlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Monsterverzameling en -voorbereiding
Een maand na de gavage werd orbitaal veneus bloed verzameld bij ratten voorafgaand aan de EA-interventie. Plasmamonsters werden geëxtraheerd door centrifugatie bij 1.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Aan het einde van de behandeling werd verse ontlasting verzameld van elke groep ratten. Ratten werden verdoofd met 10% geëmulgeerde isoflurane (30 mg/kg) en geëuthanaseerd. De buikholte werd geopend en ongeveer 5 ml bloed werd uit de buikaorta genomen voor het meten van de viscositeit van de volledige bloedafschuiringssnelheid (WBSRV) binnen 4 uur. Abdominale aortaweefsels werden verzameld voor histopathologische analyse. Alle monsters werden opgeslagen bij -80 °C voor later gebruik.
WBSRV-test
Na voltooiing van de modellering werd ongeveer 4-5 ml volbloed uit de abdominale aorta van ratten afgenomen met een bloedafzuignaald en geplaatst in heparinenatrium-anticoagulantiebuizen. De buizen werden voorzichtig geschud om een grondige menging van de bloedmonsters met het antistollingsmiddel te garanderen. Binnen 4 uur werden de WBSRV en de erythrocytensedimentatiesnelheid (ESR) gemeten met een volledig geautomatiseerde hemorheologie-analyzer.
Vasculaire histopathologie
Vaatweefsels werden minstens 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehydeoplossing en op een dikte van 3 μm gesneden voor hematoxyline-eosine (HE) kleuring. Beelden werden gemaakt met vergrotingen van 100× en 400×.
16S rDNA-sequencing
Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit fecale monsters van elke groep. De V3-V4 primersequenties (341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') werden gebruikt voor PCR-amplificatie van totaal DNA. Het PCR-versterkingsprogramma was als volgt: pre-denaturatie bij 98 °C gedurende 30 seconden, denaturatie bij 98 °C voor 10 seconden, annealing bij 54 °C voor 30 seconden, en verlenging bij 72 °C voor 45 seconden, met in totaal 32 cycli, gevolgd door een laatste extensie bij 72 °C voor 10 minuten. PCR-producten werden gezuiverd en gekwantificeerd. Paired-end sequencing (2×250 bp) werd uitgevoerd op het NovaSeq 6000 sequencingplatform. Gepaarde eindlezingen werden samengevoegd en gefilterd om hoogwaardige data te verkrijgen. Met behulp van de DADA2-plugin in QIIME 2 werden lengtefiltering en geluidsdemping uitgevoerd. Dit proces genereerde ampliconsequentievarianten (ASV's) en ASV-abundantietabellen, gevolgd door het verwijderen van singleton ASV's. Taxonomische annotatie en abundantieprofilering werden uitgevoerd op basis van het ASV-sequentiebestand met behulp van de SILVA-database om soortverschillen en gemeenschapssamenstelling tussen monsters te onderzoeken. Soortendiversiteit en veranderingen in relatieve abundantie werden geëvalueerd via α-diversiteits- en β-diversiteitsanalyses, en er werd datavisualisatie uitgevoerd op deze website (https://www.omicstudio.cn/home).
Statistische analyses
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 26.0. Een waarde van P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Voor gegevens met homogene varianties werd eenrichtings-ANOVA gebruikt voor intergroepvergelijkingen, gevolgd door post-hoc least significant difference (LSD) tests indien significante verschillen werden gevonden. Voor gegevens met heterogene varianties werd de niet-parametrische Kruskal-Wallis eenrichtings-ANOVA per rang gebruikt. De Mann-Whitney U testanalyse werd toegepast om veranderingen in de samenstelling en gemeenschapsstructuur van de darmmicrobiota te beoordelen. Pearson-rangcorrelatieanalyse werd gebruikt om correlaties te evalueren tussen verschillend overvloedige darmbacteriën en andere indicatoren. Pearson-correlatieanalyse werd toegepast omdat de gegevens voldeden aan de aannames van normaliteit en lineariteit, die werden gevalideerd door de Shapiro-Wilk-test en Durbin-Watson-test. Statistische grafieken en heatmaps werden gegenereerd met behulp van GraphPad Prism 10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Validatie van het diermodel
De vier stollingsparameters spelen een cruciale rol in onderzoek naar vasculaire laesies door het monitoren van afwijkingen in stollingsfuncties die nauw samenhangen met vasculaire pathologische veranderingen. Post-modellering evaluatie van retro-orbitale veneuze plexusbloed toonde significante veranderingen in stollingsparameters (PT, APTT, FIB, TT) tussen HS/EA-groepen versus NC-controles (Figuur 3). Specifieke testwaarden worden weergegeven ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Vaatlaesies zijn een cruciale factor in de ontwikkeling en pathologische manifestaties van verschillende CVD- en metabole aandoeningen. De schadelijke effecten hiervan zijn onder meer vasculaire disfunctie, abnormale bloedstolling, lipidenafzetting en plaquevorming, wat kan leiden tot verhoogde bloeddruk, trombose en de vorming van arteriële plaque, wat uiteindelijk resulteert in verschillende CVD14, 15,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen belangenconflicten aan.
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Provinciale Departement Wetenschap en Technologie van Sichuan (Subsidienummer 2024NSFSC0717). Dank aan Figdraw voor de hulp bij het maken van de figuren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acupunctunalnaalden | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | 242059 | 0,18 × 13 mm |
| Geactiveerd partiële tromboplastinetijd (APTT) Assay Kit (stollingsmethode) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R21D24C4 | |
| AMPure XP kralen | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Automatische Coagulatie Analyzer | Beijing Succeeder Technology Inc. | SF-8050 | |
| Fibrinogeen (FIB) Assay Kit (stollingsmethode) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R31D24D2 | |
| Volautomatische Bloed Rheologie Tester | Beijing Succeeder Technology Inc. | SA-5600 | |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software, Inc. | ||
| H&E kleuringsoplossing | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| Illumina bibliotheek kwantificeringskit | Kapa Biosciences | 7960166001 | |
| Isofluraan | RWD Life Science | R510-22-10 | 100 mL |
| Magneetkralen-gebaseerde ontlasting genomische DNA extractie kit | Biotek | AU46111-96 | |
| Nikon Eclipse Ci-L rechtopstaand wit licht microscoop | Nikon | ||
| QIIME 2 | https://qiime2.org/ | ||
| SDZ-II Huatuo elektronisch acupunctuur apparaat | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | SDZ-II | |
| SILVA database | Release 138, https://www.arb-silva.de/ | ||
| Natriumchloride | Chengdu Jinshan Chemical Reagents Co., Ltd. | 20231008 | 500 g |
| SPF Wistar ratten | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SCXK (Beijing) 2024-0001 | |
| Trombine Tijd (TT) Assay Kit (stollingsmethode) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R4D24E1 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen