Temperatuurrespons van de afbraaksnelheden van organisch materiaal in de bodem: Constructie en toepassingen van een temperatuurgradiëntblok

Samenvatting

We introduceren een temperatuurgradiëntblok en beschrijven de constructie en het gebruik ervan. Het blok biedt 22 afzonderlijke temperaturen, lineair verdeeld over een door de gebruiker gedefinieerd bereik van 0 tot 90 °C. Gegevens die uit deze opstelling worden verzameld, maken het mogelijk om nieuwe theorieën te testen en te ontwikkelen over de temperatuurrespons van de afbreeksnelheden van organische stoffen in de bodem.

Samenvatting

De bodem is het grootste koolstofreservoir (C) van de aarde en bevat bijna twee keer zoveel C als de atmosfeer. Door klimaatverandering veroorzaakte temperatuurstijgingen kunnen de afbraak van organische stof (SOM) bevorderen, waardoor mogelijk kooldioxide (_CO2) in de atmosfeer vrijkomt, wat resulteert in een positieve terugkoppeling op klimaatverandering. Dit roept de vraag op: hoe kunnen we de respons van SOM-ontbindingsnelheden op kortetermijnveranderingen in temperatuur definiëren? Kunnen we deze data gebruiken om mechanistisch gedefinieerde vergelijkingen in aardsysteemmodellen te passen voor klimaatvoorspellingen? Het meeste onderzoek tot nu toe richt zich op laboratoriumbodemincubaties bij verschillende discrete temperaturen. Dit resulteert echter niet in een gedetailleerde temperatuurresponscurve, die nodig is om nieuwe hypothesen te testen die zijn opgelegd door de nieuwste ontwikkelingen in het veld, zoals de macromoleculaire snelheidstheorie (MMRT). In dit artikel introduceren we een temperatuurgradiëntblok, aangepast en verbeterd ten opzichte van eerder werk, beschrijven we het bouwproces ervan en geven we een gedetailleerde uitleg van het gebruik ervan. Het temperatuurgradiëntblok is een aluminium blok met vier rijen van 22 afzonderlijke gaten, waardoor 88 microkosmoss (60 mL buisjes) gelijktijdig kunnen worden incubeerd. Het blok wordt aan het ene uiteinde gekoeld en aan het andere uiteinde verwarmd, waardoor een lineaire temperatuurverdeling ontstaat. Het biedt 22 afzonderlijke temperatuurpunten langs een door de gebruiker gedefinieerd bereik binnen limieten van 0 tot 90 °C. Na 3,5 uur incubatie wordt de_{CO-2-productie} gemeten uit elk van de 88 microkosmos. De resultaten tonen aan dat het blok de door de gebruiker gedefinieerde temperatuurgradiënt produceert en de constructie van temperatuurresponscurves van SOM-decompositie vergemakkelijkt. Daarnaast kunnen de gegevens die uit deze opstelling worden verzameld worden gebruikt om nieuwe hypothesen en theorieën te testen en te ontwikkelen over de impact van temperatuurveranderingen op de SOM-ontbindingssnelheden, een gebied van steeds groter belang in de context van klimaatverandering.

Inleiding

Stijgende concentraties kooldioxide (_CO2) in de atmosfeer leiden tot hogere temperaturen op Aarde¹. Dit fenomeen werd voor het eerst gerapporteerd in 1856 door Eunice Foote², die een eenvoudig maar baanbrekend experiment uitvoerde. Ze vulde één cilinder met omgevingslucht en een andere met_CO2 en registreerde de temperaturen in beide¹. De resultaten waren duidelijk: cilinders met hogere_{CO2-concentraties} vertoonden hogere temperaturen, wat het opwarmingseffect van verhoogde atmosferische_CO21 aantoonde^. Deze observatie heeft aanzienlijke gevolgen voor klimaatverandering. Vandaag de dag blijven Foote's vroege inzichten de hedendaagse klimaatwetenschap informeren en leiden ze onderzoek naar hoe stijgende_CO2-niveaus de opwarming van de aarde beïnvloeden en verschillende ecosystemen beïnvloeden.

Bodems slaan bijna twee keer zoveel koolstof (C) op als de atmosfeer in de eerste meter, wat een cruciale rol speelt in de globale C-cyclus³. Een belangrijk proces dat de C-voorraden in de bodem beïnvloedt, is de afbraak van organische stof (SOM), die bepaalt hoe snel C weer in de atmosfeer wordt vrijgelaten ^4,5. Hogere gemiddelde jaarlijkse temperaturen, veroorzaakt door klimaatverandering, hebben het potentieel om de afbraak van organisch materiaal (SOM) te stimuleren, waardoor de afgifte van_CO2 in de atmosfeer met ^6,7 versnellen wordt. Dit vormt een positief terugkoppelingsmechanisme voor klimaatverandering, vooral wanneer hogere temperaturen C-verliezen door SOM-ontbinding meer versnellen dan dat ze fotosynthetische C-inputs⁶ stimuleren. Ondanks uitgebreid onderzoek naar het onderwerp blijft de omvang en richting van de zogenaamde land-koolstof-klimaatfeedback veel bediscussieerd 8,9,10,11. Deze onzekerheid is grotendeels te wijten aan fundamentele kennistekorten over de temperatuurrespons van SOM-decompositiesnelheden. Het aanpakken van deze hiaten is essentieel voor het verfijnen van aardsysteemmodellen en het integreren van theoretisch onderbouwde representaties van de temperatuurrespons van SOM-decompositiesnelheden.

De temperatuurrespons van SOM-decompositiesnelheden wordt gewoonlijk weergegeven door de Q_10-waarde en de Arrheniusvergelijking. De Q_10-waarde wordt gedefinieerd als de factor waarmee een snelheid wordt vermenigvuldigd wanneer de temperatuur met 10 °C stijgt. Ondanks uitdagingen aan de geldigheid 12,13,14,15, is Q₁₀ de standaardmethode geworden om de temperatuurrespons van verschillende behandelingen en bodems te vergelijken. De Arrhenius-theorie suggereert een exponentiële toename van processnelheden, zoals die van SOM-ontbinding, met een toename van^{temperatuur 16}. Echter, de daadwerkelijke enzymactiviteiten volgen meestal een unimodale vorm met een duidelijk thermisch optimum en nemen af bij hogere temperaturen ^17,18,19. Arrhenius-gebaseerde vergelijkingen proberen deze daling te verklaren door enzymdenaturatie voorbij het thermische optimum⁶ voor te stellen. Enzymdenaturatie vindt echter plaats bij hogere temperaturen dan die vaak in bodems voorkomen, wat aangeeft dat enzymen een thermisch optimum bereiken voordat denaturatie^{plaatsvindt 19,20}. Bovendien maakt het simpelweg toevoegen van een tweede functie aan de Arrheniusvergelijking om rekening te houden met de ineenstorting van de ademhalingssnelheid door denaturatie geen schatting van een inflasiepunttemperatuur mogelijk - de temperatuur waarbij de verandering in de ademhalingssnelheid wordt gemaximaliseerd:^21,22. Daardoor slagen Arrhenius-gebaseerde vergelijkingen er niet in de algemeen gemeten vorm van de algehele temperatuurrespons van SOM-ontledingssnelheden binnen het temperatuurbereik dat doorgaans in bodems^14,23 wordt waargenomen, volledig te vatten.

Om de beperkingen van de Arrhenius-theorie aan te pakken, zijn er meerdere vergelijkingen ontwikkeld om de temperatuurgevoeligheid van biologische processen weer te geven; maar weinig zijn gebaseerd op biologische theorie of zijn toegepast op bodems^24,25. Onder de biologisch gebaseerde benaderingen overwint de macromoleculaire snelheidstheorie (MMRT) enkele beperkingen van de Arrheniusvergelijking door de thermodynamische eigenschappen van biologische macromoleculen, zoals enzymen²⁶, te integreren. Evenzo verklaart de Enzyme-Assisted Arrhenius-theorie (EAAR) de temperatuurafhankelijke rol van enzymen bij het verlagen van de activatie-energie van reactie²⁴. Beide vergelijkingen zijn met succes toegepast op studies van de temperatuurrespons van biochemische reacties in bodems en micro-organismen 17,24,27,28. Deze vergelijkingen bieden waardevolle mechanistische inzichten in de temperatuurrespons van SOM-ontbinding en onderliggende reactiestappen. Hun brede adoptie en parametrisatie worden echter vaak belemmerd door experimentele uitdagingen.

Zowel veld- als laboratoriumstudies hebben voordelen en beperkingen voor het begrijpen van de temperatuurrespons van SOM-ontbindingssnelheden. Veldexperimenten leveren waardevolle inzichten op over de langetermijntemperatuurrespons van SOM-decompositiesnelheden. Het interpreteren van CO2-fluxmetingen in het veld kan echter lastig zijn vanwege verstorende variabelen zoals autotrofe ademhaling, vochtvariabiliteit en substraattoegankelijkheid 29,30,31,32,33^. Hoewel deze interacties essentieel zijn voor het kwantificeren van processen in de echte wereld, richten dergelijke studies zich over het algemeen op langetermijnreacties van ecosystemen in plaats van op het meten van kortetermijnmechanistische processen. Het begrijpen van de kortetermijntemperatuurrespons is cruciaal voor het parametriseren van vergelijkingen die worden gedefinieerd door recente theorieën, zoals MMRT en EAAR, en hiervoor zijn laboratoriumstudies essentieel. Veel laboratoriumstudies lijden doorgaans onder verstorende effecten van substraatuitputting, die toenemen met incubatietijd en temperatuurbehandelingen 34,35,36. Bovendien gebruiken de meeste laboratoriumexperimenten slechts enkele temperatuurbehandelingen 37,38,39,40, wat resulteert in het passen van eenvoudige exponentiële vergelijkingen of het berekenen van Q _{10-verhoudingen} in plaats van meer geavanceerde vergelijkingen, die vereisen dat snelheden bij een groter aantal discrete temperaturen worden gemeten 41. Om deze problemen aan te pakken, is het cruciaal om nieuwe experimentele benaderingen te ontwikkelen die nauwkeurige metingen van SOM-ontledingssnelheden over een breder temperatuurbereik mogelijk maken, waardoor de rigoureuze toetsing en ontwikkeling van SOM-ontbindingstheorieën met betrekking tot temperatuurrespons worden ondersteund.

In dit artikel beschrijven we de constructie en het gebruik van een temperatuurgradiëntblok, dat niet alleen de huidige experimentele beperkingen aanpakt, maar ook een state-of-the-art studie biedt om de kortetermijnrespons van SOM-ontbinding op temperatuur aan te tonen. Het hier gepresenteerde ontwerp is een aanpassing van de methodologie die eerst werd ontwikkeld door Thomas et al. (1963)⁴² en later werd aangepast door Robinson et al. (2017)⁴¹. De belangrijkste verschillen zijn onder andere 1) een verbetering van het koelsysteem, 2) een verkorte werktijd door het blok aan te sluiten op een CO2-analyzer voor directe meting van_{CO2-concentraties}, en 3) het elimineren van de noodzaak om buisjes tijdens het experiment te vervoeren. Hoewel eerdere rapporten^{21, 41, 43} een brede beschrijving van het temperatuurblok gaven, waren het gedetailleerde ontwerp, de bouwmethoden en het testen minimaal, waardoor andere onderzoekers deze aanpak konden gebruiken. Hier geven we volledige details van zowel het ontwerp als de bouw, en presenteren we resultaten van meerdere tests om de juiste functionaliteit van de opstelling voor verschillende bodemmonsters aan te tonen.

Protocol

Hier presenteren we de gedetailleerde constructie en het diepgaande gebruik van het temperatuurgradiëntblok. Alle materialen met hun respectievelijke specificaties zijn te vinden in de Aanvullende Tabel 1 en de Materiaallijst. De kosten voor de bouw en assemblage van het temperatuurgradientblok bedroegen ongeveer €20.000, exclusief de kosten van de gasanalyzer. Dit temperatuurgradiëntblok is 'Eunice' genoemd, naar Eunice Foote.

1. Constructie van het temperatuurgradiëntblok

1. Zie Figuur 1 voor het carrosserieontwerp van het temperatuurgradiëntblok.
2. Het bouwen van het aluminium blok
   1. Positioneer en bevestig het ruwe aluminium blok in een universele freesmachine. Voer de maten en locaties van elk gat in de software van de machine in. Figuur 2 geeft de locatie en diameter van elk gat voor de opstelling aan.
   2. Boor gaten voor verwarmingsstaven. Aan één uiteinde van het blok boren twee gaten met een diameter van 16 mm en een diepte van 133 mm. Plaats deze gaten zo dat hun middelpunten 25 mm van de bovenrand en 36,25 mm van de zijranden liggen (Figuur 2).
   3. Maak een kasteelpatroon voor een koelmiddel. Aan het andere uiteinde van het blok boor je een kasteelpatroon over een lengte van 180 mm (Figuur 3A). Zorg ervoor dat het kasteelpatroon een dikte van 16 mm en een diepte van 140 mm heeft. Boor 12 extra gaten binnen het kasteelpatroon, elk met een diameter van 10 mm en een diepte van 140 mm. Zie Figuur 3B voor de precieze locatie en verdeling van deze gaten.
      OPMERKING: Het kasteelpatroon is ontworpen om het contact van het koelmiddel met het blok te vergroten, en de 12 gaten dienen om overloop te voorkomen.
   4. Maak een pakking voor het kasteelpatroon. Snijd een aluminium pakking om het koelmiddel in het blok te omsluiten en plaats het bovenop het kasteelpatroon. Dit wordt gebruikt om lekkage van het koelmiddel te voorkomen.
   5. Boor gaten voor de koeleraansluiting. Aan de voor- en achterkant van het blok boor je gaten met een diameter van 15 mm voor de koelerverbinding (Figuur 4). Plaats het midden van de gaten op 75 mm diepte. Zorg ervoor dat het gat aan de voorkant 18 mm van de rand ligt en het gat aan de achterkant 162 mm van de rand. Zorg ervoor dat deze twee gaten het begin en einde van het kasteelpatroon met elkaar verbinden.
   6. Boor gaten voor temperatuursensoren. Boor 8 gaten met een diameter van 3 mm en een diepte van 150 mm. Deze sensoren bevinden zich in het midden van het blok en zijn gelijkmatig verdeeld over de lengte. Zorg ervoor dat het midden van het eerste sensorgat 940 mm van de rand is en het laatste sensorgat 205 mm van de rand.
   7. Boor gaten voor de 60 mL flesjes. Maak 88 gaten, elk met een diameter van 28 mm en een hoogte van 144 mm. Deze gaten zijn gelijkmatig verdeeld over het blok. Het midden van de eerste en laatste buisgaten is uitgelijnd met de centra van de eerste en laatste sensorgaten.
3. Isolatievoorbereiding
   OPMERKING: Het isolatiemateriaal is gemaakt van polyisocyanuraat met een dikte van 40 mm.
   1. Met een cirkelzaag zaag je het isolatiemateriaal in een trapeziumvorm onder een hoek van 135°. Om de vier lange zijden van het aluminium blok te bedekken, snijd je het isolatiemateriaal in een rechthoek van 1080 mm bij 230 mm. Snijd elke van de vier zijden van deze rechthoek onder een hoek van 135° zodat ze strak om het blok passen. Een van deze zijden wordt aan het deksel van het blok gelijmd. Gebruik aluminiumtape om het isolatiemateriaal voor het deksel van het blok te beschermen.
   2. Voor de twee korte zijden van het blok snijd je het isolatiemateriaal in een vierkant van 230 mm bij 230 mm. Snijd opnieuw elke kant van het vierkant onder een hoek van 135° om een goede pasvorm te garanderen.
4. Het koelsysteem aansluiten (Figuur 5)
   OPMERKING: Het koelsysteem dat in deze opstelling wordt gebruikt is compact en energiezuinig. Dit koelsysteem wordt bediend door een natuurlijke koellaag te circuleren met een koelcapaciteit tot -30 °C.
   1. Bevestig de kniekoppeling en de slangbarb aan het blok (Figuur 5C). Verbind vervolgens de slang die het koelmiddel naar de koeler leidt.
   2. Bedek de slang met flexibel isolatiemateriaal om de slang volledig te bedekken. Dit houdt het koelmiddel op de gewenste temperatuur. Snijd het flexibele isolatiemateriaal af en pas het stevig op de slang, waarbij je de isolatie met lijmkit bevestigt.
5. Steek de verwarmingsstang en sensoren in het blok om de pasvorm te waarborgen (Figuur 5D).
6. Zie Figuur 5 voor een overzicht van de hierboven uitgelegde stappen.

Figuur 1: Karosserieontwerp en delen van het temperatuurgradiëntblok. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Temperatuurgradiëntblok dat de locatie en diameter van de gaten die voor meerdere toepassingen worden gebruikt, aangeeft. De letter "S" staat voor sensor. De afmetingen zijn in millimeters (mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Ontwerp en metingen van het kasteelpatroon dat voor het koelmiddel wordt gebruikt. (A) Metingen van de dikte, lengte en diameter van het kasteelpatroon, en (B) afstand en locatie van 12 gaten die worden gebruikt om overloop te voorkomen. De afmetingen zijn in millimeters (mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Zijaanzicht van het temperatuurgradiëntblok dat de diepte van elk gat en de locatie van de koelere verbindingen aangeeft. De letter "S" staat voor sensor. De afmetingen zijn in millimeters (mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Overzicht van de constructie van het temperatuurgradiëntblok. (A) Het boren van gaten voor het plaatsen van de 60 mL flesjes; (B) het aanbrengen van het isolatiemateriaal dat het aluminium blok bedekt; (C) aansluiting en behuizing voor het koelmiddel; (D) de verwarmingsstang en sensoren in het blok plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Het bouwen van de roestvrijstalen behuizing.

1. Snijd het roestvrij staal voor de lange zijden met de afmetingen 1080 mm x 230 mm x 230 mm. Voor de korte zijden zaag je roestvrij staal met afmetingen van 230 mm x 230 mm. Zorg ervoor dat je gaten maakt voor de koelslang, sensoren, verwarmingsstaven en handgrepen.
   OPMERKING: Een van de lange zijden wordt gebruikt als deksel van het blok.
2. Verbind de handgrepen, scharnieren voor het deksel en sluitingen met de roestvrijstalen behuizing met warmteverbinding.

3. Bouw van de elektronica-eenheid

OPMERKING: Alleen een gekwalificeerde elektricien mag het elektronische apparaat bouwen. Het hier uiteengezette protocol is ontwikkeld in overeenstemming met Nederlandse en EU-wetgeving. Hieronder volgt een kort overzicht van de belangrijkste gebruikte componenten; gedetailleerde bedradinginstructies zijn te vinden in Supplementair Dossier 1.

1. Ontwerp het elektronische diagram (Figuur 6).
2. Monteer de lasdozen.
   OPMERKING: De lasdozen zijn geïnstalleerd ter bescherming van de elektrische componenten en verbindingen tegen externe objecten en schade.
   1. Bevestig de drie lasdozen stevig op de roestvrijstalen behuizing met behulp van de montageschroeven.
   2. Bereid kabelingangen voor. In de hoofdlasdoos maak je zes gaten voor kabelprofielen dicht. In de twee kleinere kasten maak je twee gaten voor kabelvertakkingen. De ene doos huisvest de 2-weg schakelaar, de andere de kabelverbindingen van de verwarmingsstang.
      OPMERKING: De 2-weg schakelaar wordt gebruikt om het apparaat aan en uit te zetten, wat betekent dat hij stroom levert aan de mini-zekering.
   3. In de hoofdinsteekdoos boor je één gat bovenop voor de groene LED.
      OPMERKING: Dit LED-lampje geeft aan wanneer het apparaat aan is en dat er stroom beschikbaar is voor elk component.
   4. Knip de DIN-rail af en plaats ze in de hoofdaansluitdoos. Markeer vervolgens drie gaten voor montageschroeven die de DIN-rail vasthouden. Bevestig de DIN-rail in de hoofdinsteekdoos.
      OPMERKING: De DIN-rail wordt gebruikt om de montage van de elektrische componenten te vergemakkelijken. Plaats het bij voorkeur ongeveer in het midden van de hoofdlasdoos.
3. Installatie van elektrische componenten.
   OPMERKING: Gebruik Figuur 7 als referentie en installeer elk elektrisch component.
   1. Zoek de lasdoos voor de 2-weg schakelaar. Verwijder de bovenste helft van de schakelaar om het deel te vinden dat door de afdekplaat gevoerd moet worden. Markeer en boor een gat in de afdekplaat van de schakeldoos, die goed moet passen en de schakelaar aan de afdekplaat moet monteren. Gebruik de montage-instructies van de schakelaar.
   2. In de hoofdaansluitdoos plaats je het PE/GND-terminal op de DIN-rail. Plaats vervolgens de miniatuurzekering (MFB) op de DIN-rail.
      OPMERKING: De PE/GND-terminals worden gebruikt als eindtoppen. De MCB is een miniatuurzekering en de belangrijkste veiligheidsschakelaar bij een storing of tekort. Wanneer de MCB aanstaat, geeft hij stroom aan de AC/DC-voeding.
   3. Plaats twee drievoudige doorvoerterminals op de DIN-rail. Twee dubbele brugterminals worden gebruikt om ze aan de boven- en onderkant van de feed-thru terminals te verbinden.
      OPMERKING: Gebruik feed-thru terminals om meer dan twee draden te verbinden en gebruik bruggen om meerdere feed-thru terminals met elkaar te verbinden. Zorg voor een veilige en betrouwbare verbinding door gebruik te maken van de ferrule-connectoren.
   4. Plaats de DC-voeding op de DIN-rail zoals op de foto.
      OPMERKING: Deze studie gebruikte een 24 V, 2,5 A AC/DC voeding. Dat gebruikt de wisselstroom en zet deze om naar 24 VDC voor de ingangsvermogensvereisten van de andere componenten.
   5. Plaats de thermostaat op de DIN-rail zoals afgebeeld. Zorg ervoor dat je de kabelaansluitingsmodule niet kwijt raakt (groen in Figuur 7).
      OPMERKING: Er werd een thermostaat gebruikt om de temperatuur te regelen en te monitoren. Het is een webbrowsergebaseerd softwaresysteem dat het IP-adres van het apparaat vereist om in te loggen, de temperatuur van de verwarmingsstaven in te stellen en de gegevens vast te leggen. Deze was aangesloten op het lokale netwerk (LAN) om vanaf elke computer op de campus verbinding te maken met de eenheid.
   6. Plaats zeven triple feed-thru terminals op de DIN-rail zoals afgebeeld. Met drie vijfvoudige bruggen verbind je de eerste vijf feed-thru's aan de bovenste, middenste en onderste feed-thru terminals.
   7. Gebruik twee vijfvoudige bruggen om de laatste twee doorvoerverbindingen aan de boven- en onderste doorvoer.
   8. Plaats één zekeringhouder op de DIN-rail zoals afgebeeld.
      OPMERKING: Een zekering van 630 mA werd gebruikt om de componenten van de eenheid te beschermen tegen schade bij kortsluitingen en stroompieken.
   9. Plaats twee enkelvoudige aansluitunits op de DIN-rail zoals afgebeeld.
   10. Plaats het solid-state relais op de DIN-rail zoals op de foto.
       OPMERKING: Het solid-state relais wordt gebruikt om de verwarmingsstaven aan en uit te zetten.
   11. Plaats één PE/GND-terminal als eindstop.
4. Voor de procedure voor het aansluiten van elektrische draad, zie Aanvullende Figuur 1.
5. Voor een overzicht van de elektronische eenheid, zie Figuur 7.

Figuur 6: Diagram van de elektronische eenheid. De draadkleuren zijn als volgt: bruin = Voltage Alternating Current (VAC) lijn, blauw = VAC neutraal, groen en geel = GND (Aarde/Aarde), rood = Voltage gelijkstroom (VDC) positief, zwart = VDC negatief. Datadraden zijn wit, maar voor het gemak van identificatie worden in deze afbeelding in groen weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Hoofdaansluitdoos van de elektronische eenheid aangesloten op het temperatuurgradiëntblok. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Het samenstellen van het temperatuurgradiëntblok

1. Gebruik lijmkit om het isolatiemateriaal aan de roestvrijstalen behuizing te lijmen. Laat het een nacht drogen.
2. Steek de sensoren en verwarmingsstaven in het aluminium blok.
3. Plaats het aluminium blok in de roestvrijstalen behuizing, zodat de kabels door hun respectievelijke gaten worden geleid voor aansluiting op de elektronische unit.
4. Gebruik de scharnieren om het geïsoleerde roestvrijstalen deksel aan het blok te bevestigen.
5. Bevestig het koelsysteem aan het aluminium blok.
6. Plaats het temperatuurgradiëntblok in het laboratorium, zodat alle verbindingen stevig en functioneel zijn (Figuur 8A). Zorg ervoor dat het laboratorium een stevige tafel van minstens 2 meter lang heeft. Bevestig dat er toegang is tot ethernet- en elektriciteitsverbindingen. Een gecontroleerde omgevingstemperatuur is gewenst voor optimale werking.

5. Constructie van het spoelsysteem

OPMERKING: De spoellijn is ontworpen om de_{CO-2-concentraties} in elk flesje aan het begin van de incubatie te standaardiseren. Zie Figuur 8B om het spoelsysteem met het temperatuurgradiëntblok te visualiseren.

1. Snijd de flexibele buis met een kleinere diameter in 10 stukken, elk 15 cm lang. Bevestig een naald aan één uiteinde van elk van de 10 kleinere buizen.
2. Snijd de buis met een grotere diameter in één stuk van 1 m lang. Plaats een stop aan het ene uiteinde van deze buis en verbind het andere uiteinde met de omgevingsluchtgeleider in het laboratorium.
3. Meet en markeer de grotere buis op 5 cm afstanden langs de lengte. Op elk gemarkeerd interval steek je een naald in die is verbonden met een van de kleinere buizen.

Figuur 8: Temperatuurgradiëntblok. (A) Temperatuurgradiëntblok geïnstalleerd in het laboratorium met het deksel gesloten en (B) open met het spoelsysteem in de tentoonstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Beschrijving van de gasanalyse-injectie-eenheid

OPMERKING: De gasanalyzer van deze opstelling maakt het mogelijk om de_{CO2-concentratie} direct te meten in de 60 mL glazen flesjes. Het bereik van deze gasanalyzer ligt tussen 0 ppm en 10.000 ppm met een precisie van 0,04 ppm bij 400 ppm. De gasanalyzer wordt geleverd met een debietreductiekit die een snelheid van 1,17 mL/s meet.

1. Pas de injectiebuis van de gasanalyzer aan door een extern 0,45 μm filter en een injectienaald toe te voegen (Figuur 9).
   OPMERKING: Het 0,45 μm filter werd toegevoegd als extra voorzorgsmaatregel om te voorkomen dat er water in de gasanalyzer terechtkomt. De naald heeft een maat van 18 G en afmetingen van 1,2 mm x 25 mm. De naald werd geselecteerd op basis van de diameter om schade aan de rubberen septa van de 60 mL glazen flesjes te minimaliseren.
2. Verbind de injectiebuis van de gasanalyzer met de aansluitinlaat van het instrument.
3. Aan het uiteinde van de injectiebuis bevestig je een mannelijke Luer lock-connector. Met een flexibele buis met een binnendiameter van 1/4 bevestig je de Luer-vergrendeling aan de injectiebuis. Bevestig vervolgens het 0,45 μm filter met een flexibele buis om alles luchtdicht aan elkaar te maken.
4. Aan het schroefuiteinde van het 0,45 μm filter gebruik je een mannelijke en vrouwelijke connector om de naald stevig te bevestigen.

Figuur 9: Gasanalyzer injectie-eenheid. (A) De injectiebuis van de gasanalyzer. (B) Een extern 0,45 μm filter en een injectienaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Ontwerpen van behandelingen voor incubatie

1. Selecteer bodemmonsters.
   OPMERKING: De bodemmonsters die voor dit manuscript zijn gekozen, tonen de functionaliteit van het protocol aan en tonen het type data dat met deze opstelling kan worden verzameld.
2. Selecteer een temperatuurbereik voor blokincubatie, dat is een door de gebruiker gedefinieerde range van 0 °C tot 90 °C.
   OPMERKING: Het temperatuurbereik voor dit manuscript was 4 °C tot 60 °C. Als het systeem boven dit bereik wordt gebruikt, volg dan de laboratoriumveiligheidsprotocollen bij het omgaan met hoge of onder nul temperaturen.
3. Plan de randomisatie van de steekproeven.
   OPMERKING: Voor dit manuscript werden monsters gerandomiseerd binnen het temperatuurblok (posities A-D). Hoewel deze studie aanvankelijk testte met het randomiseren van de steekproeflezing na incubatie, introduceerde dit labelfouten tijdens het leesproces. Daarom werd een consistente meetvolgorde (d.w.z. van hoge naar lage temperaturen) geprioriteerd.

8. Monsters voorbereiden voor pre-incubatie

OPMERKING: Om verschuivingen in microbiële gemeenschappen in de bodem te beperken, worden bodemmonsters bij voorkeur zo snel mogelijk vers na het bemonsteren geïncubeerd. Afhankelijk van experimentele beperkingen en logistiek moeten bodemmonsters echter mogelijk aan de lucht worden gedroogd voor transport en opslag vóór incubatie. In dit manuscript werd een luchtdroogprocedure gestandaardiseerd voor het verwerken van monsters vóór incubatie.

1. Zeef de verse grond met een zeef van 2 mm. Laat de gezeefde grond 24 uur droog worden bij 40 °C. Deze luchtgedroogde grond kan worden bewaard tot verdere verwerking.
2. Plaats het bodemmonster in een metalen blik en meng het grondig. Verdeel de gemengde grond over 22 vooraf gelabelde glazen flesjes van 60 mL. Voeg met weegpapier 3 ± 0,03 g aarde toe aan elk flesje van 60 mL.
3. Met een pipet past u de bodem aan op de gewenste watervasthoudende capaciteit (WHC) op basis van de trechtermethode. Na het aanpassen van de waterinhoud naar de doel%WHC, noteer je het exacte gewicht van elk flesje.
   OPMERKING: De bodemmonsters die voor dit manuscript zijn geselecteerd, zijn aangepast naar 60% WHC.
4. Sluit de flesjes af met watte om luchtuitwisseling mogelijk te maken.
5. Voorincubeer de monsters gedurende 10 dagen in een temperatuurgecontroleerd laboratorium bij 20 °C.

9. Aanpassing van WHC tijdens de pre-incubatie

1. Na 7 dagen pre-incubatie noteer je het gewicht van de flesjes en pas je het aan op de doel-WHC. Gebruik precies een pipet en voeg water toe waar nodig. Bereken het water dat aan elk flesje moet worden toegevoegd met behulp van Vergelijking 1.
   Water toevoegen = gewicht_T0 (g) - gewicht_T7 (g) (1)
   waarbij gewicht_T0 het gewicht van het flesje op tijdstip nul vertegenwoordigt en _{gewicht T7} het gewicht van het flesje na 7 dagen.

10. Het initialiseren van het temperatuurgradiëntblok

OPMERKING: Het koelsysteem wordt geregeld via het paneel aan de voorkant van het instrument. Het verwarmingssysteem wordt bediend via de schakelaar achter het instrument en een online interface.

1. Volg de instructies van de fabrikant om het koelsysteem AAN te zetten. Druk één keer op de aan/uit-knop (Item A, Aanvullende Figuur 2). Zorg ervoor dat de cijfers voor de temperatuur °C en het toerental knipperen met het bericht UIT. Dit geeft aan dat het systeem AAN is maar momenteel inactief.
2. Activeer de pomp door op de OK/Pompknop te drukken (Item E, Aanvullende Figuur 2) en druk op de + of - knop (Item G en F, Aanvullende Figuur 2) om het toerental op 3500 in te stellen. Controleer voordat je het koelsysteem activeert of het vloeistofniveau groen licht heeft (Item L, Aanvullende Figuur 2). Als het vloeistofniveau rood is, betekent dit dat er niet genoeg koelmiddel is. Neem contact op met de labmanager of raadpleeg de handleiding van de fabrikant.
3. Activeer het koelsysteem door op Temperatuur te drukken (Item B, Figuur S2) en druk op de + of - knoppen (Item D en C, Aanvullende Figuur 2) om de Temperatuur °C in te stellen op -1,6 °C. Het setpunt (Item O, Aanvullende Figuur 2) zou moeten knipperen. Dit geeft aan dat het koelsysteem nog niet op het ingestelde punt is.
   OPMERKING: De ingestelde temperatuur in het koelsysteem is niet hetzelfde als de temperatuur binnen het blok.
4. Zet de schakelaar achter het blok AAN (Aanvullende figuur 3). Zorg ervoor dat een groen lampje AAN gaat. Dit geeft aan dat het verwarmingssysteem AAN is, maar de temperatuurregeling niet actief is.
5. Om de temperatuurregeling van het verwarmingssysteem te activeren, opent u de online interface van het temperatuurgradiëntblok door het IP-adres 10.75.117.227 in een browser in te voeren. Log in met de opgegeven gebruikersnaam en wachtwoord om de temperatuur van elke sensor te bekijken (Aanvullende Figuur 4). Deze interface toont de sensorwaarden, die elke 3 seconden worden bijgewerkt.
6. Stel de ingestelde verwarmingstemperatuur in op 60,00 °C door op de omhoog/omlaagpijlen te drukken. Druk op de AAN-knop om het verwarmingssysteem te activeren.
   OPMERKING: Het duurt ongeveer een uur voordat het blok een stabiele lineaire temperatuurgradiënt bereikt.
7. Tien minuten nadat het blok is ingeschakeld, controleer je de verwarmingsregeling om te controleren of hij werkt. Het instrument werkt wanneer de temperatuur voor elke sensor anders is.

11. Het instellen van de gasanalyzer

1. Volg de handleiding van de fabrikant en zet de gasanalyzer AAN door één keer op de aan/uit-knop te drukken. Wacht 45 minuten tot het instrument is opgewarmd.
2. Verbind de pc met het Wi-Fi-netwerk van de gasanalyzer, geïdentificeerd met de unieke hostnaam (TG15-XXXXX), en gebruik het wachtwoord om verbinding te maken.
3. Schrijf de hostnaam of het IP-adres in een webbrowser en druk enter om verbinding te maken. Open vervolgens het instellingengedeelte en selecteer 'debiet verminderen'. Als de optie al is geselecteerd, verander dan niets in de software.

12. Klaarmaken om monsters te laden

1. Pas de WHC aan volgens sectie 6 van het protocol 1 uur voordat de incubatie begint.
2. Controleer de verwarmingsregeling om te controleren of deze de gewenste temperatuur heeft bereikt 10 minuten voordat je monsters in het blok plaatst.
3. Zet de omgevingsgeleider in het lab AAN.
4. Sluit het spoelsysteem aan en sluit de gasanalyzer aan op de computer.

13. Verzamel blanco patronen

1. Registreer blanco plekken volgens deze twee procedures:
2. Verbind de spoelleiding met het injectiesysteem van de gasanalyzer en registreer direct de CO₂ (in ppm) van de spoelleiding.
3. Plaats vijf glazen flesjes van 60 mL in een lege houder. Plaats voor elk flesje één spoelleiding. Na 1 minuut haal je de spoellijn eruit en sluit je de dop van het flesje. Wacht vier uur voordat je CO₂ in de flesjes meet.

14. Monsters laden in het temperatuurgradiëntblok

OPMERKING: In het blok heb je blokposities A, B, C, D. Plaats hetzelfde monster op dezelfde blokpositie over het blok (Figuur 10). Bijvoorbeeld, steekproefnummer 175 gaat in blokpositie A van 1 tot 22, steekproefnummer 45 in blokpositie B van 1 tot 22, enzovoort.

Figuur 10: Buisposities binnen het blok. De letter "S" staat voor sensor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Open het blok, plaats de computer en het spoelsysteem bovenop het blokdeksel (Figuur 11). Plaats op een verplaatsbare tafel de dozen met de monsters.
   OPMERKING: Draag een KN95-masker om de CO2-variabiliteit in de monsters te minimaliseren. Dit voorkomt dat CO₂ uit de ademhaling de flesjes besmet.
2. Maak een spreadsheet om de sluittijd (uur: minuut) van elk individueel flesje vast te leggen, en visualiseer parallel de tijd van de gasanalyzer.
   OPMERKING: De sluittijd van elk flesje wordt gebruikt voor snelheidsnormalisatie tijdens de gegevensverwerking.
3. Begin de monsters te laden in het temperatuurgradiëntblok. Werk in batches van acht monsters. Plaats de ongekapte monsters in het blok, beginnend bij de koelkop. Dit betekent dat de eerste acht monsters A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2 zijn.
4. Plaats de spoellijn in acht buisjes en wacht 1 minuut. Haal de spoellijn eruit en sluit onmiddellijk de flesjes. Noteer in een spreadsheet precies wanneer elk flesje werd afgedopt.
   OPMERKING: Steek voorzichtig de spoellijn in elk flesje, zodat deze niet in contact komt met de grond. Dit voorkomt kruisbesmetting en helpt de integriteit van het monster te behouden.
5. Terwijl de eerste acht flesjes worden doorgespoeld, laad je de volgende batch monsters in het temperatuurgradiëntblok. Bijvoorbeeld, de spoelmonsters zijn: A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2. De volgende batch monsters die worden toegevoegd zijn: A3, B3, C3, D3, A4, B4, C4, D4.
6. Plaats de spoellijn in de volgende batch monsters.
7. Herhaal deze stappen totdat het blok volledig geladen is.
8. Sluit het blok en wacht 3,5 uur vanaf het moment dat het laatste monster is gesloten.
9. Zet de gasanalyzer op slaapstand door de aan/uit-knop twee keer binnen 3 seconden in te drukken.
10. Zet het spoelsysteem UIT met de rode klep in de muur.

Figuur 11: Opstelling van het laadtemperatuurgradiëntblok. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

15. Te beginnen met CO_2-metingen

1. Haal de gasanalyzer uit de slaapstand door één uur op de aan/uit-knop te drukken voordat je begint met CO2-metingen. Controleer de instellingen van de analyzer zoals aangegeven in sectie 8.
2. Zet het spoelsysteem AAN en plaats de gasanalyzer op de beweegbare tafel (Figuur 12).
   OPMERKING: De beweegbare tafel moet hoog genoeg zijn zodat het injectiesysteem van de gasanalysator alle monsters kan bereiken.
3. Controleer het diagnostische gedeelte van de gasanalyzer (Aanvullende Figuur 5). Zorg ervoor dat de status van het instrument groen is voor alle componenten. Hier zijn er twee mogelijkheden:
   1. Als alles groen is, begin dan met de analyse.
   2. Als er rode of gele componenten zijn, controleer dan de handleiding van de gasanalysator en vraag indien nodig om technische hulp. Als de fout wordt opgelost, ga dan verder met de_CO2-metingen . Als de fout niet wordt opgelost, stop dan het experiment.
4. Open het grafiekgedeelte van de gasanalyzer om de realtime metingen te visualiseren. Houd er rekening mee dat het instrument constant_CO2 vanuit de lucht meet.
   OPMERKING: Het meetdisplay is vertraagd met ~3-5 seconden.
5. Na 3,5 uur incubatie begin je met het meten van de monsters. Te beginnen met de hogere temperaturen. Bijvoorbeeld, de eerste voorbeelden die gelezen moeten worden zijn: A22, B22, C22 en D22.
   OPMERKING: Draag het KN95-masker bij het meten van monsters bij temperaturen <15 °C. Dit zal ruis in de data verminderen.
6. Verbind de injectienaald van de analyzer op een spoellijn tussen de monsters. Dit maakt het opruimen van data makkelijker.
7. Bovenaan het scherm is er een BEOORDELINGSFUNCTIE in de gasanalysesoftware. Elke keer dat een monster wordt gemeten, maak je een UNIEKE en EENVOUDIGE opmerking. Vergeet niet om op REMARK te drukken voordat je elke sample uitvoert.
   OPMERKING: Gebruik unieke nummers of het unieke ID van het monster als OPMERKING. Als er een fout wordt gemaakt in de OPMERKING, noteer dan het tijdstip waarop het monster is gemeten. Maak bijvoorbeeld aantekeningen van late injecties, of de REMARK vroeg of te laat is beëindigd, enzovoort.
8. Steek de naald 20 seconden in het 60 mL monsterflesje. Na deze seconden haal je de naald uit het flesje.
   OPMERKING: De gasanalyzer krijgt drukproblemen als de naald langer dan 38 seconden in het 60 mL flesje blijft. Vermijd dit, want de gasanalyzer stopt een paar minuten met werken, totdat de druk weer stabiel is.
9. Volg deze stappen voor het aflezen van monsters en de vijf blanks met de gasanalyzer:
   OPMERKING: Druk op de REMARK-knop in de online software van de gasanalyzer om een opmerking te starten en te beëindigen.
   1. Begin RECOMMENT op hh:mm:00.
   2. Steek de naald in het flesje op hh:mm:10.
   3. Haal de naald uit het flesje op hh:mm:30.
   4. Stop OPMERKING bij: hh:mm:45.
10. Vervang het 0,45 μm filter dat is aangesloten op de injectienaald van de analyzer elke 16 monsters. Dit filter is bedoeld om vocht op te vangen en verstopping van de filters in de analyzer te voorkomen.
11. Herhaal deze stappen voor alle samples.

Figuur 12: Plaats de gasanalyzer op de beweegbare tafel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

16. Monsters lossen uit het temperatuurgradiëntblok

1. Haal één voor één monsters uit het blok en plaats ze in een doos. Volg een van deze opties:
   1. Ontladen terwijl je CO₂ meet.
   2. Ontladen na het meten van het laatste_CO2-monster .
      OPMERKING: Kies een van de twee opties op basis van de vereisten voor toekomstige monsteranalyse na blokincubatie of het labschema. Stap 16.1.1 kan bijvoorbeeld de incubatieduur van sommige monsters veranderen, wat invloed kan hebben op de resultaten van latere analyses. Het labrooster (bijvoorbeeld openings- en sluitingstijden) kan ook een beperkende factor zijn.
2. Verwerk en sla monsters op voor toekomstige analyse.
   OPMERKING: In dit geval zijn alle 88 monsters na blokincubatie bewaard gebleven. Met behulp van een spatel werd het hele monster van het 60 mL glazen flesje overgebracht naar vooraf gelabelde plastic zakken.

17. Het downloaden van de gegevens

1. Om de gegevens die met de gasanalyzer zijn verzameld te extraheren, ga je naar de online software van de gasanalyzer. Klik op Instellingen en klik dan op het download-icoon .
2. Selecteer het specifieke tijdstip waarop het eerste en laatste monster werden gemeten. Klik op Downloaden.
3. Open een nieuwe spreadsheet, selecteer Bestand openen. Verander de bestandszoekopdracht naar Alle bestanden (*.*) en zoek naar het document dat in de vorige stap is opgeslagen. Er opent een nieuw venster en selecteert dan Voltooien.

18. De instrumenten uitschakelen

1. Zet de gasanalyzer uit met de aan/uit-knop of via de software-interface. Om het instrument met de knop uit te schakelen, druk je drie keer op de uit-knop binnen 5 seconden.
2. Zet het koelsysteem UIT . Druk op vergrendelen (Item I, Aanvullende Figuur 2) en de OK/Pompknop (Item E, Aanvullende Figuur 2). De witte ruis zou moeten stoppen. Als de witte ruis helemaal verdwenen is, druk je op de UIT onderaan.
3. Zet het verwarmingssysteem UIT . Schakel het temperatuurgradiëntblokcontrolesysteem uit met de schakelaar achter het instrument. Zorg dat het groene lampje UIT gaat (Aanvullende Figuur 3).

19. Het omzetten van CO₂ ppm naar ademhalingssnelheden in μg C per kg grond per uur

1. Importeer de gasanalyzergegevens in de nabewerkingssoftware (we gebruikten R) en haal de volgende variabelen eruit: REMARK, TIME,_{CO 2} en H₂O.
2. Maak een nieuwe kolom om de seconden van belang te extraheren, specifiek van >30 s tot <35 s.
3. Verwijder alle observaties die problemen met drukval veroorzaken. Tijdens het experiment kunnen drukdalingen iets lagere_CO2-waarden hebben veroorzaakt dan verwacht. Deze lichte dalingen (tussen 3% en 5% lager dan de vorige of volgende waarde) zijn geen reële veranderingen in CO₂, maar eerder artefacten (fouten) veroorzaakt door drukval. Verwijder daarom CO_2-waarden die iets zijn gedaald (~3-5%) ten opzichte van de vorige of volgende CO_2-waarde .
4. Bereken de gemiddelde_{CO2-concentratie} (ppm) voor de resterende datapunten. Voor elk monster trekt u het gemiddelde van de vijf gemeten blanco's af.
5. Importeer de labgegevens in nabewerkingssoftware (bijv. R) en haal de volgende variabelen eruit: OPMERKING, droog bodemgewicht en sluittijd.
6. Om de CO₂ ppm gemeten door de analyzer om te zetten naar μg C per g grond, past Vergelijking 2 toe:
   
   waarbij de_{CO-2-concentratie} gemeten door de gasanalyzer wordt uitgedrukt in ppm; Het_CO-2 molecuulgewicht is gelijk aan 44,01 g·^mol-1; P is de barometrische druk, gelijk aan 1 en uitgedrukt in atm; R is de universele gasconstante gelijk aan 0,082058 uitgedrukt in atm·^mol-1· ^K-1; hoofdruimte wordt berekend op basis van de kopruimte van de 60 mL glazen flesjes uitgedrukt in mL; T is de veronderstelde interne temperatuur van het instrument, gelijk aan 293,15 en uitgedrukt in K; en het gewicht van de droge bodem wordt uitgedrukt in g.
7. Vervolgens deel je door de incubatietijd uitgedrukt in uren en vermenigvuldig je met 1000 om gram om te zetten in kilogrammen bodem.
8. Tot slot converteer je de μg CO₂ naar μg koolstof met behulp van de molecuulgewichten van CO₂ en C. Dit resulteert in ademhalingssnelheden uitgedrukt in μg C per kilogram bodem per uur.
9. Sla de verwerkte data op of exporteer ze voor verdere analyse.

Resultaten

Stabiliteit en verdeling van de bloktemperatuur
Tijdens de ontwikkeling van dit protocol testten we de lineariteit en temporele stabiliteit van de temperatuur binnen het blok. Na het aanzetten van het koelsysteem en de verwarming is de initialisatietijd van het blok ongeveer een uur, gedurende welke tijd de meeste van de acht gelijkmatig verdeelde temperatuursensoren de streeftemperatuur bereiken en na een overschrijding constant blijven (Figuur 13A). Na deze periode bevestigen de door de acht sensoren geregistreerde temperaturen een perfecte lineaire temperatuurverdeling langs het aluminiumblok (Figuur 13B).

Figuur 13: Lineariteit en temporele stabiliteit binnen het temperatuurgradiëntblok. (A) Temporele stabiliteit van de temperaturen binnen het blok gedurende de incubatieperiode, en (B) temperatuur die door de sensoren wordt geregistreerd bij het begin van de incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bloktemperatuur en bodemtemperatuur
We testten de tijd die nodig was voor het bodemmonster in het blok om de temperatuur te bereiken die door de acht sensoren werd geregistreerd (Figuur 14). In deze studie maten we de temperatuur van bodemmonsters op acht verschillende posities binnen het blok, vlakbij de sensoren. De sensoren, die zich in het blok bevonden, waren voorgestabiliseerd op hun doeltemperatuur. Volgens het hierboven beschreven protocol werden, zodra de temperatuur van het blok stabiel was, bodemmonsters in het blok geplaatst. Voor deze test gebruikten we extra sensoren die van het blok zijn gescheiden. We gebruikten 15 gram grond, zodat de sensorprobe volledig contact had met de grond. De bodemmonsters werden zonder dop gelaten en de temperatuur werd elke minuut geregistreerd, in totaal 30 minuten. Tijdens deze test werd het blok iets gesloten om temperatuurvariaties te minimaliseren en zoveel mogelijk reële gebruiksvoorwaarden te reproduceren (volledig gesloten). We ontdekten dat het ongeveer 12 minuten duurt voordat de bodemmonsters stabiliseren op de streeftemperatuur. We vonden deze stabilisatietijd acceptabel, aangezien de incubaties minimaal 3,5 uur duren. Daarnaast hebben we de lineariteit van de bodemtemperatuur beoordeeld na 12 minuten blokincubatie. De resultaten geven aan dat de bodemtemperaturen een lineaire relatie vertonen, die nauw overeenkomt met de lineariteit die in de acht sensoren wordt waargenomen (Figuur 15).

Figuur 14: Geregistreerde bodemtemperatuur geïncubeerd bij verschillende temperaturen. Monsters A, B, C en D werden geïncubeerd in flesjes die nabij de bijbehorende sensoren waren geplaatst (zie Figuur 10 ter referentie). De bodemtemperatuur werd gemeten door een thermokoppel dat direct in de bodemmonsters werd ingebracht. De specifieke temperaturen die door elke sensor worden gemonitord zijn als volgt: (A) Sensor 1 (S1) bij 4,1 °C, (B) Sensor 2 (S2) bij 12,5 °C, (C) Sensor 3 (S3) bij 20,1 °C, (D) Sensor 4 (S4) bij 28,1 °C, (E) Sensor 5 (S5) bij 36,1 °C, (F) Sensor 6 (S6) bij 43,8 °C, (G) Sensor 7 (S7) bij 51,9 °C, en (H) Sensor 8 (S8) bij 60 °C. Na het plaatsen van de bodemmonsters in het blok duurt het ongeveer 12 minuten om de streeftemperatuur te bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 15: Sterke lineaire correlatie tussen bodemtemperatuur en sensortemperatuur. Vier flesjes met aarde werden dicht bij de acht sensoren geplaatst in blokposities A, B, C en D. De bodemtemperatuur werd gemeten door een thermokoppel dat direct in de bodemmonsters werd ingebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Temperatuur-vocht interactie
Er is een onvermijdelijke wisselwerking tussen temperatuur en vocht die tijdens de incubatieperiode moet worden beoordeeld. Zo kunnen hoge temperaturen de verdamping versnellen, terwijl lage temperaturen watercondensatie kunnen veroorzaken. Voor deze test gebruikten we vier willekeurig geselecteerde bodemmonsters met verschillende texturen (aanvullende tabel 2). Volgens het protocol werd elk bodemmonster in dezelfde blokpositie geplaatst bij alle 22 temperaturen. De resultaten tonen aan dat na een gemiddelde incubatietijd van 3,5 uur hogere temperaturen resulteerden in groter vochtverlies dan lagere temperaturen, ongeacht de bodemtextuur (Figuur 16). Bodems die bij 60 °C werden geïncubeerd, verloren gemiddeld 12% van het totale toegevoegde water, terwijl bodems die bij 4,1 °C werden geïncubeerd gemiddeld slechts 1,88% van het totale toegevoegde water verloren. Dit betekent dat tijdens de 3,5 uur blokincubatie de bodems binnen optimale vochtomstandigheden werden gehouden, tussen 50% en 60% waterhoudende capaciteit, ongeacht de incubatietemperatuur^{van 44,45} (Aanvullende Figuur 6).

Figuur 16: Relatieve verlies van bodemvocht tijdens blokincubatie in vier verschillende monsters. Het vochtverlies werd berekend ten opzichte van de totale hoeveelheid toegevoegd water om te corrigeren voor WHC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

CO 2-concentratiemetingen
Om de nauwkeurigheid en precisie van de gasanalyzer te testen, voerden we vier metingen uit van een gecertificeerd referentiegas (413 ± 5 ppm_CO2), waarvoor de analyzer 413,71 ± 0,60 registreerde (ppm CO₂, gemiddelde ± SD). Dit bevestigde de hoge nauwkeurigheid en precisie van de CO2-metingen die door de gasanalyzer werden vastgelegd. Daarnaast moet er, om aan de specificaties van de fabrikant te voldoen, jaarlijks worden getest met een gecertificeerd referentiegas.

Gezien de vertraging veroorzaakt door de injectielijn en de debietreductiekit naar de gasanalyzer, werden meerdere tests uitgevoerd om de optimale meettijd te bepalen. De resultaten tonen aan dat de injectielijn een vertraging van ongeveer vijf seconden veroorzaakt. In deze opstelling is de ideale meettijd 20 s, waardoor voldoende tijd is om de_{CO2-detectieeenheid} te vullen en een evenwicht te bereiken voor 5 seconden (Figuur 17). Aangezien de kit met een flow reduction rate kit een snelheid van 1,17 mL/s meet, komt deze meettijd overeen met het bemonsteren van 39% van de luchtinhoud in de 60 mL flesjes. Daarnaast hebben we geobserveerd dat wanneer de gasanalyzer als gesloten systeem wordt gebruikt, er een drukval optreedt. Deze druppel ontstaat tijdens het interval van één seconde waarin er geen luchtinjectie plaatsvindt terwijl de naald uit het flesje wordt gehaald. Om rekening te houden met deze drukdaling tijdens de gegevensverwerking, sloten we_CO-2-waarden uit die iets lager zijn (tussen 3% en 5%) dan de vorige of volgende waarde.

Figuur 17: Optimale meettijd voor een individueel bodemmonster dat bij drie verschillende temperaturen is geïncubeerd. Deze grafiek toont de injectie- en extractietijd van de naald, het evenwicht van CO₂ voor 5 s, en de drukval die samenhangt met het geselecteerde tijdsbestek. Incubation_ID toont blokpositie (C) en buisposities (5, 10 en 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het volledige protocol testen
Om de functionaliteit en reproduceerbaarheid van het protocol te evalueren, hebben we twee verschillende monsters geïncubeerd, elk met vier technische replica's, over de 22 discrete temperaturen variërend van 4 °C tot 60 °C. Deze bodemmonsters zijn geselecteerd om het type data dat met deze opstelling wordt gegenereerd en de prestaties ervan aan te tonen. Specifieke steekproefkenmerken zijn te vinden in Aanvullende Tabel 2. Het temperatuurgradiëntblok ving betrouwbaar de bodemrespiratiesnelheden van de verschillende bodemmonsters op elk temperatuurpunt, waardoor we de temperatuurreactiecurve kunnen visualiseren. Bovendien waren de resulterende temperatuurresponscurves voor alle replicaten vrijwel identiek, zoals blijkt uit de kleine standaarddeviatie rond de gemiddelde ademhalingsfrequenties over alle temperaturen (Figuur 18). Deze resultaten tonen een hoge reproduceerbaarheid aan en bevestigen de precisie van het protocol.

Figuur 18: Representatieve SOM-ontledingssnelheden (Rs) voor twee bodems, elk gemeten met vier technische replicaten die over de volledige temperatuurgradiënt worden geïncubeerd. Punten geven het gemiddelde van de ademhalingsfrequenties bij elke temperatuur weer en foutbalken geven de standaardafwijking tussen technische replica's aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een tweede test werd uitgevoerd om de wetenschappelijke toepasbaarheid van het protocol aan te tonen. We maten de ademhalingssnelheid van de bodem over de volledige temperatuurgradiënt en pasten de gegevens aan met het Arrhenius- of MMRT-model (Figuur 19). Deze bodemmonsters zijn gekozen om de systeemprestaties voor contrasterende temperatuurresponscurves aan te tonen (monsterkenmerken zijn weergegeven in aanvullende tabel 2). De resultaten tonen aan dat de gegevens die met het temperatuurgradiëntblok zijn verzameld, verder kunnen worden geanalyseerd door verschillende theorieën te testen over de temperatuurgevoeligheid van SOM-decompositiesnelheden. Er ontstaan echter uitdagingen bij het werken met verse grond in elk experiment. Tijdens de 10 dagen pre-incubatieperiode zagen we schimmelgemeenschappen groeien in sommige van de flesjes in bodemmonsters buiten de reeks representatieve monsters. Ondanks onze inspanningen om de schimmelgemeenschappen zorgvuldig te verwijderen zonder de bodem te verstoren, had deze groei invloed op de resultaten van sommige monsters (Figuur 20). Daarom besloten we de getroffen monsters weg te gooien door het hele monster te verwijderen, niet alleen de individuele buisjes die door schimmelgroei waren getroffen.

Figuur 19: Representatieve resultaten en ademhalingsfrequenties (Rs) van vier verschillende bodemmonsters die in het temperatuurgradiëntblok zijn geïncubeerd. De rode lijn staat voor de (A,B) Arrhenius-fit, en de blauwe lijn de (C,D) MMRT-fit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 20: Ademhalingsfrequentiepatronen voor sommige monsters die door schimmelgroei zijn beïnvloed. Deze resultaten zijn voorbeelden van (A,B) twee besmette monsters die zijn uitgesloten van verdere analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Basis NO/NC-circuit. " C" kan ook als "COM" worden aangeduid voor Common. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Bedieningspaneel van het koelsysteem. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Systeemschakelaar en lichtindicator. (A) Schakelaar van het temperatuurgradiëntblokregelsysteem; en (B) groen lampje dat aangeeft dat de sensoren en het verwarmingssysteem AAN zijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Temperatuurgradiëntblokverwarmingsregeling in de online interface. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 5: Diagnostisch gedeelte van de gasanalyzer. Alles is groen, wat betekent dat het instrument klaar is voor metingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 6: Waterhoudende capaciteit van bodems die bij verschillende temperaturen zijn geïncubeerd, metingen vastgelegd na 3,5 uur blokincubatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Gedetailleerde bedrading-instructies. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Lijst van materialen met de vereiste hoeveelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Kenmerken van bodemmonsters die zijn gebruikt voor de vochtverliestest en het volledige protocol. Deze monsters zijn gekozen om de functionaliteit van het protocol te demonstreren. Textuurclassificatie volgt het USDA-systeem, waarbij grof, klei, slib en zand worden uitgedrukt als percentages. OC verwijst naar het organische koolstofgehalte (g C·^kg-1 bodem), de pH werd gemeten in water, en CaCO₃ vertegenwoordigt het calciumcarbonaatgehalte (g·^kg-1 grond). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het gebruik van een temperatuurgradiëntblok voor het meten van de kortetermijntemperatuurrespons van SOM-decompositiesnelheden brengt uitdagingen met zich mee, vooral bij het detecteren van ademhalingsfrequenties bij lage temperaturen. Lage temperaturen kunnen direct de katalytische activiteiten van intracellulaire en extracellulaire enzymen^{remmen 46,47}. Daarom moet de incubatietijd lang genoeg zijn om ervoor te zorgen dat de lage ademhalingsfrequenties aan de onderkant van het temperatuurbereik voldoende_CO-2 in de glazen flesjes toestaan om binnen het detectiebereik van de gasanalysator te vallen. In deze experimentele opstelling was de laagste temperatuur 4,1 °C; Deze monsters waren de eerste die in het blok werden geladen en als laatste werden geanalyseerd, wat extra incubatietijd opleverde. De ~3,5 uur blokincubatietijd bleek voldoende om detecteerbare veranderingen in de_{CO2-concentratie} in de monsters te veroorzaken. Deze incubatieduur hangt waarschijnlijk af van het bodemtype en vooral van het organisch materiaalgehalte. Zo kan het zijn dat zanderige bodems met een laag organisch materiaalgehalte langere incubatietijden vereisen dan koolstofrijke bodems. In de tests hier bleek echter dat de incubatietijd van 3,5 uur over het algemeen voldoende was voor de meeste bodemtypen en organische gehaltes.

Naast het optimaliseren van de incubatietijd voor_CO2-detectie bij lage temperaturen, is het even belangrijk om vochtverlies aan de bovenkant van de temperatuurgradiënt te minimaliseren. Bodemvocht speelt een cruciale rol bij transport, diffusie en oplossing van substraten naar microbiële gemeenschappen⁴⁸. Zo kan bodemvocht de ademhalingssnelheid beperken door substraatdiffusie bij lage vochtniveaus te beperken en de zuurstofbeschikbaarheid bij hoge vochtniveaus^45,49 te verminderen. Daarom is het minimaliseren van vochtverlies bij hoge temperaturen relevant om te voorkomen dat vocht de toegang van microbiële middelen tot substraten beperkt. Hoewel de flesjes in dit protocol volledig verzegeld waren, condenseerde er water op de doppen en binnenwanden van de flesjes. Deze condensatie werd beschouwd als vocht dat uit de bodem is verloren. Daarom hebben we de incubatietijd verkort van 4 uur, zoals in Robinson et al. 2017⁴¹, naar 3,5 uur. Hoewel het niet mogelijk was om bij alle temperatuurbehandelingen volledig constant vocht te houden, werden de bodems tijdens de 3,5 uur durende incubatieperiode op optimale vochtniveaus gehouden. Zelfs bij hoge temperaturen bleef de WHC van de bodem boven de 50%, waardoor de beschikbaarheid van water de toegang van microbiële substraten niet beperkte^{tot 44,45}.

Een andere belangrijke overweging is het temperatuurbereik van de incubatie. Hoewel het koelsysteem temperaturen kan bereiken tot -30 °C en het verwarmingssysteem tot 320 °C, heeft het isolatiemateriaal een temperatuurbestendigheid van -183 °C tot 148 °C. De glazen flesjes die in deze opstelling worden gebruikt, kunnen 500 °C verdragen. Hoewel deze bereiken breed zijn, vormt het incuberen van monsters boven 100 °C een veiligheidsrisico voor de operator. Om oververhitting te voorkomen werd een thermische weerstand toegevoegd, zodat het verwarmingssysteem automatisch uitschakelt als het aluminium blok 90 °C bereikt. De opname van deze thermische weerstand is cruciaal vanwege de waargenomen initialisatieoverschrijving (Figuur 13A). Als de temperatuur tijdens de initialisatie boven de 90 °C uitkomt, wordt het systeem uitgeschakeld. Gezien deze beperkingen raden wij aan deze opstelling te laten werken tot een maximale temperatuur van 60 °C voor veilige en betrouwbare prestaties. Aanvullende tests zijn vereist voor het incuberen van bodemmonsters onder 0 °C om betrouwbare detectie van_CO2 te garanderen, aangezien condensatie en de bijbehorende vochtvariabiliteit de metingen bij temperaturen onder nul kunnen beïnvloeden. Voor dit protocol kozen we een lagere temperatuurlimiet van 4 °C, waarbij geen condensatie werd waargenomen. Als het systeem bij grotere temperatuurbereiken wordt gebruikt, raden wij aan om aanvullende thermische veiligheidsrichtlijnen te implementeren.

Een andere mogelijke beperking van deze methode is dat de relatief korte incubatietijd microbiële gemeenschappen niet toestaat zich aan temperatuurveranderingen aan te passen. De temperatuurrespons van bodems die worden blootgesteld aan aanhoudende opwarming is het onderwerp geweest van veel studies, met name met als doel microbiële adaptatietheorieën te testen 27,43,47,50,51. Microbiële adaptatie is voorgesteld om het afnemende effect van experimentele opwarming op bodemademhalingssnelheden over tijd te verklaren⁴⁷. De hier gepresenteerde methodologie is echter ontwikkeld om de kortetermijntemperatuurrespons van SOM-ontbindingssnelheden te meten. Hoewel microbiële adaptatie waarschijnlijk niet in korte tijd plaatsvindt⁴⁷, gebruikte een recente studie een vergelijkbare methodologie om de snelheid van microbiële adaptatie te kwantificeren door bodems uit een geothermische gradiënt te incuberen. In deze studie werd MMRT toegepast om belangrijke parameters te schatten, waaronder de temperatuuroptima en de buigpunten. Door deze parameters te vergelijken over bodems vanuit de geothermische gradiënt, tonen de bevindingen aan dat de snelheid van microbiële aanpassing aanzienlijk lager is dan de snelheid van opwarming^{van 52}. Deze studie benadrukt het belang van het begrijpen van de volledige temperatuurresponscurve, met name het vastleggen van de temperatuuroptimum en kantelpunten van biologische bodemprocessen (Figuur 19C,D). Gezien deze bevindingen raden we aan microbiële gemeenschappen tijdens blokincubatie op meerdere temperatuurpunten te bemonsteren om te beoordelen hoe de samenstelling en functies van microbiële gemeenschappen correleren met ademhalingsfrequenties en temperatuurgevoeligheidsparameters.

Het temperatuurgradiëntblok dat in dit artikel wordt beschreven, biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele methodologieën. Een groot voordeel is dat het onderzoekers in staat stelt om de SOM-afbraaksnelheden efficiënt en nauwkeurig te meten bij 22 discrete temperaturen met kleine hoeveelheden grond. Dit is een methodologische verbetering ten opzichte van het incuberen van bodemmonsters bij enkele discrete temperaturen, wat onderzoekers dwingt de Q₁₀ temperatuurcoëfficiënt toe te passen – een methode die door veel studies met 12,13,15 wordt betwist. Een ander belangrijk voordeel is dat deze opstelling gegevens verzamelt die duidelijk de vorm en steilheid van de temperatuurresponscurve vastleggen. Het aantal afzonderlijke temperatuurbehandelingen langs een brede temperatuurgradiënt stelt ons in staat de inflektiepunttemperatuur en het optimum van biologische processen te identificeren, waardoor vergelijkingen tussen behandelingen mogelijk zijn. De voorbeelden in dit manuscript tonen twee verschillende patronen (Figuur 19A,B vs. Figuur 19C,D), die onderzoekers verder kunnen analyseren met behulp van verschillende temperatuurgevoeligheidstheorieën. Enkele voorbeelden ondersteunen de Arrhenius-theorie, waarbij reactiesnelheden exponentieel toenemen met de temperatuur (Figuur 19A,B). Daarentegen komen andere voorbeelden overeen met de MMRT-theorie, die een unimodale respons met een duidelijk temperatuuroptimum tonen (Figuur 19C,D). Deze twee verschillende patronen geven aan dat het gepresenteerde temperatuurblokincubatieprotocol in staat is beide typen responscurves te reproduceren, wat gebruikt kan worden om theorieën over de temperatuurgevoeligheid van SOM-decompositiesnelheden te testen, waardoor ons begrip van thermodynamica, biologie en chemie wordt verdiept.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
630 mA glazen zekering	RS	563-637	https://uk.rs-online.com/web /p/cartridge-fuses/0563637?gb=s
Klevende afdichting	Innotec	01.2451.0000	https://www.innotec.nl /producten/adheseal
Aluminiumblok	metaalketen	96082150.1	https://www.metaalketen .com/aluminium/
Aluminiumtape	Manutan	A159435	https://www.manutan.nl/nl/mnl/aluminiumtape -met-schutlaag-50565-50-m-x-50-mm-tesa -a159435?shoppingab=true&gad_source= 1&gclid=CjwKCAjw74e1Bh BnEiwAbqOAjE5Tw3-r3xiW 9FWALDZMlVUWpqJpQQ R_zwwXR8_R6Sb1Ce_8v x96jxoCtx4QAvD_BwE
Zwarte draad	RS	361-787	https://nl.rs-online.com/web /p/hook-up-wire/0361787
Blauwe draad	RS	724-4392	https://nl.rs-online.com/web /p/hook-up-wire/7244392
Bruine draad	RS	724-4395	https://nl.rs-online.com/web /p/hook-up-wire/7244395
Kabeldoorvoer	RS	807-9786	https://nl.rs-online.com/web/p /cable-glands/8079786?cm_ mmc=NL-PLA-DS3A-_-goog le-_-CSS_NL_EN_Cables_% 26_Wires_Whoop-_-(NL:Who op!)+Cable+Glands-_-807978 6&matchtype=&aud-8271861 83926:pla-339598489905&gcli d=Cj0KCQiAw8OeBhCeARIsA GxWtUyscrqjF3FwA6j2jqUyeg_ s70tOXBRuYRF90pwubv3Po8v sbZSJhV4aAq84EALw_wcB&gc lsrc=aw.ds
Rondzaag	Ryobitools	RWSL1801M	https://nl.ryobitools.eu/elektrisch-g ereedschap/zaagmachines/cirkelz agen/rwsl1801/rwsl1801m/?gad_so urce=1&gclid=Cj0KCQjw2ou2BhCC ARIsANAwM2Easx4PAZzvVYvFFUD ZKemTdqNDXsde_NDPSB8FAlGu7 8Hzy2j3TuoaAhTjEALw_wcB
Sluitingen	Kramp	HS491976	https://www.kramp.com/shop-nl/nl/p /verstelbare-haakvergrendeling-118- 128-typ.3--HS491976
Koeler en natuurlijk koelmiddel	Dijkstra Vereenigde	L035004186	https://www.laboratorium-apparatuur .nl/ika-rc2-green-basic-koelthermo staat-30-c-bad-volume-4-liter-l035004186
DIN-rail	RS	648-5722	https://nl.rs-online.com/web/p/din-ra ils/6485722?cm_mmc=NL-PLA-DS 3A-_-google-_-CSS_NL_NL_Pmax _Test-_--_-6485722&matchtype=&&g ad_source=1&gclid=CjwKCAjw8f u1BhBsEiwAwDrsjOqGDs92gjrJHkp SsYmOiS0OK6tC9U_fMHEhlmvu7r SbNp8VnmuDERoCC0UQAvD_ BwE&gclsrc=aw.ds
Dubbele bruggen	RS	803-7530	https://nl.rs-online.com/web/p/din-rail -terminal-accessories/8037530?sear chId=11c9702f-3312-4bb0-a826-e9d 50bd91ee1&gb=s
Ethernet-kabel	RS	657-2090	https://nl.rs-online.com/web/p/ ethernet-kabel/6572090
Gesichtsmaske	KN95	NA	https://www.bol.com/nl/nl/p/kn95- disposable-face-mask-ffp2-x-1-mask s-kn95-wegwerp-gezichtsmasker-ffp 2-x-1mondkapjes/930000000131403 0/?Referrer=NLGOOFS&utm_source =google&utm_medium=free_shopping
Vrouwelijke connector	qosina	17642	https://www.qosina.com/female- to-female-luer-lock-connector-17642
Filter 0,45 µm	Whatman	10462650	https://us.vwr.com/store/product/1394 3097/whatmantm-puradisc-aqua-30-m m-syringe-filter-0-45-m-whatman- products-cytiva
Flexibele isolatie (slang)	Celsis	4600000198	https://www.celsisbv.nl/k-flex-plaati solatie-op-rol-st-10e-1x10mtr-10mm .-bl-s3-d0/4600000198?gad_source =1&gclid=Cj0KCQjw8MG1