Methodenartikel

Lumbale intrathecale injectie van SOD1-ASO's voor precieze CNS-targeting en voorspellende effectiviteit bij menselijke SOD1-G93A ALS-muizen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

24 februari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft intrathecale toedieningsmethoden voor op het CNS gerichte therapieën bij volwassen muizen, met de nadruk op protocolprecisie en het mogelijk maken van herhaalde injectie. Het bevat bevindingen uit een validatiestudie waarbij antisense-oligonucleotiden de expressie van mutant SOD1 verminderden in SOD1-ALS-modelmuizen, wat het nut van deze aanpak ondersteunt in preklinisch onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Samenvatting

Intrathecal (IT) toediening van op het centrale zenuwstelsel (CZS) gerichte therapieën biedt een minimaal invasieve route voor directe toediening van geneesmiddelen in het hersenvocht (CSF), wat de specificiteit en doelbetrokkenheid verbetert. Hoewel IT-katheterisatie standaard is voor langdurige levering bij ratten, wordt de toepassing bij muizen beperkt door anatomische beperkingen en een verhoogd risico op procedurele complicaties, waaronder ruggenmergletsel en infecties. Om deze beperkingen te overwinnen, gebruikten we een acute naaldpriktechniek voor IT-geneesmiddeltoediening bij volwassen muizen, waarmee we een reproduceerbaar en minder invasief alternatief boden dat compatibel is met eenmalige of herhaalde doseringsschema's. In een transgeen muismodel van amyotrofische laterale sclerose (ALS) met de SOD1-G93A-mutatie, bereikten we een efficiënte IT-afgifte van antisense-oligonucleotiden (ASO's) gericht op het SOD1-gen. Deze aanpak heeft effectief de expressie van gemuteerde SOD1 verminderd en het ziektefenotype aanzienlijk verbeterd, zoals aangetoond door elektrofysiologische en biomarkerbeoordelingen. Deze resultaten valideren zowel de IT-toedieningsmethode als de therapeutische effectiviteit, met uitkomsten vergelijkbaar met intracerebroventriculaire (ICV) toediening. Het belangrijkste is dat de techniek procedures weerspiegelt die in klinische studies bij mensen worden gebruikt, en een sterke translationele relevantie en bruikbaarheid biedt bij preklinische evaluatie van door het CZS gerichte interventies. Hoewel technische expertise vereist is om consistentie te waarborgen en off-target effecten te voorkomen, vertegenwoordigt deze IT-leveringsstrategie een robuuste, reproduceerbare en klinisch relevante methodologie voor het bevorderen van therapeutische ontwikkeling in kleine diermodellen.

Inleiding

In deze studie beschrijven we een lumbaal intrathecal (IT) injectieprotocol, vergelijken dit met intracerebroventriculaire (ICV) toediening en evalueren we de farmacodynamische uitkomsten en verdraagzaamheid om de ontwikkeling van therapieën gericht op het centrale zenuwstelsel (CZS) te sturen. RNA-gerichte therapieën, met name antisense-oligonucleotiden (ASO's), vormen een veelbelovende modaliteit voor CNS-ziekten doordat post-transcriptionele modulatie van genexpressie mogelijk wordt. Deze benaderingen zijn vooral relevant voor neurodegeneratieve aandoeningen, waarbij progressief neuronaal verlies de noodzaak benadrukt van precieze, lokale en tijdige interventies om mogelijk de ziekteprogressie te veranderen. Hier vergelijken we direct de effectiviteit van het IT-injectieprotocol met de toediening van ICV bij ASO-therapieën.

In preklinische studies zijn lumbale intrathecale injecties bij volwassen muizen (mannelijk of vrouwelijk, 30-70 dagen oud, 13-20 g gewicht) gebruikt om farmacologische middelen of biologische vectoren direct in het hersenvocht (CSF) toe te dienen voor het CZS gericht op 1,2. Injectievolumes van 5-10 μL worden doorgaans langzaam toegediend om tijdelijke CSF-drukstijgingen en reflux te beperken, waarbij intrathecale toegang wordt bereikt via de L5-L6 intervertebrale ruimte 1,2. Procedureel succes hangt af van een zorgvuldige techniek om neurologische schade te voorkomen, waarbij leeftijd en lichaamsgewicht het volume en de behandeling van het CSF beïnvloeden. Het gebruik van fijne naalden (bijvoorbeeld een naald van 27-30 G gekoppeld aan een 25 μL Hamiltonspuit) maakt een betrouwbare leveringmogelijk 2. Belangrijke technische uitdagingen zijn het minimaliseren van dode ruimteverliezen, het voorkomen van mis-injectie en lekkage van epidurale elementen, en het verminderen van afhankelijke variabiliteit door de gebruiker die de doseringsnauwkeurigheid en CSF-distributie kan beïnvloeden.

Het ontwikkelen van effectieve therapieën voor CNS-aandoeningen blijft een grote uitdaging vanwege de structurele complexiteit en cellulaire heterogeniteit van het CZS. Deze kenmerken belemmeren gerichte geneesmiddelafgifte en beperken de biodistributie over meerdere anatomische en fysiologische barrières, waardoor gespecialiseerde toedieningsstrategieën noodzakelijk zijn. Een belangrijk obstakel ontstaat door fysiologische en anatomische barrières in het centrale zenuwstelsel (CZS) die de penetratie van drugs beperken. De hersenen en het ruggenmerg zijn omgeven door drie meningeale lagen: de dura mater, arachnoïdale mater en pia mater, die samen met de bloed-hersenbarrière (BBB) een sterke verdediging bieden tegen circulerende therapeutica en andere moleculen in het bloed. Hoewel essentieel voor het behouden van de stabiliteit van het centrale zenuwstelsel, belemmeren deze barrières aanzienlijk de afgifte van grote, hydrofiele moleculen zoals ASO's, monoklonale antilichamen en virale vectoren 1,2,3,4. IT-beheer biedt een manier om deze beperkingen te omzeilen door therapieën direct in het CSF in de subarachnoïdale ruimte te introduceren. Deze afgifteroute vergemakkelijkt de distributie van geneesmiddelen over de centrale zenuwcompartimenten, bevordert bredere weefselpenetratie en maakt zo effectieve betrokkenheid mogelijk met doelen die tot expressie komen in diverse celtypen binnen het CZS. Sinds het eerste gebruik door Hylden en Wilcox in 1980 voor morfineafgifte bij muizen1, zijn IT-injecties een meer gebruikte methode geworden voor het toedienen van diverse therapeutische middelen, waaronder kleine moleculen, biologische middelen, gentherapievectoren en ASO's 5,6,7,8,9,10.

ASO's zijn chemisch gemodificeerde enkelstrengs oligonucleotiden die zijn ontworpen om complementaire RNA-sequenties te binden en genexpressie te moduleren via mechanismen zoals RNase H-gemedieerde afbraak, splitsmodulatie en sterische remming van translatie 11,12,13,14,15. Chemische verbeteringen zoals fosforothioaat-ruggengraatmodificaties, 2'-O-methoxyethyl (2'-MOE) substituties en geconstrueerde ethylresiduen verhogen hun stabiliteit, bindingsaffiniteit en resistentie tegen nucleasen6. Deze eigenschappen ondersteunen hun toepassing op pathogene genen die betrokken zijn bij neurogenetische aandoeningen. ASO-gebaseerde behandelingen die intrathecaal worden toegediend, hebben klinisch voordeel aangetoond bij ziekten zoals spinale spieratrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS)12,13,14,15. Zo verbetert Nusinersen (Spinraza) de inclusie van exon 7 in SMN2-transcripten om het verlies van SMN1 in SMA 7,14 te compenseren. Vergelijkbare strategieën gericht op mutante huntingtine-transcripten werden ook onderzocht in Huntington's ziekte12,13. Hoewel deze proeven begin16 werden beëindigd, onderstrepen ze de blijvende interesse in door CNS aangestuurde ASO-benaderingen.

ALS is een fatale neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van zowel boven- als onderste motorneuronen. De ziekte, die wereldwijd tussen de 6 en 9 personen per 100.000 inwoners treft en voorkomt met ongeveer 2 gevallen per 100.000 persoonsjaren, vertoont geleidelijk verslechterende spierzwakte en spasticiteit, waarbij de meeste patiënten binnen 2 tot 3 jaar na het begin vande symptomen bezwijken aan neuromusculaire ademhalingsfalen. Hoewel de meeste gevallen sporadisch zijn (sALS), is ongeveer 10% familiair (fALS), wat inzicht geeft in genetische oorzaken van de ziekte. Een van de meest bestudeerde genen is Cu/Zn superoxide-dismutase 1 (SOD1), die bijna 15 tot 20% van fALS uitmaakt, minder dan 2% van sALS, en autosomaal dominant wordt overgeërfd18. SOD1 codeert voor een cytoplasmatisch antioxidant-enzym dat reactieve zuurstofsoorten ontgifte door superoxideradicalen om te zetten in waterstofperoxide. Mutante vormen van SOD1, zoals G93A, A4V en H46R, vertonen conformationele instabiliteit, wat leidt tot eiwitaggregatie en een toxische functiewinst die bijdraagt aan oxidatieve stress, mitochondriale disfunctie en excitotoxiciteit 19,20,21,22,23,24,25 . Bovendien wordt ALS-pathologie verergerd door niet-celautonome mechanismen met microglia en astrocyten, die bijdragen aan een chronische ontstekingsomgeving en progressieve neuronale schade 26,27,28,29. Het dempen van SOD1-expressie met behulp van ASO's biedt daarom een veelbelovende therapeutische weg om ziektepathogenese te beperken.

Het SOD1-G93A transgene muismodel (Jax Strain #: 004435), dat de menselijke G93A-mutante vorm van SOD1 onder controle van endogene menselijke SOD1-promotor tot expressie brengt, herhaalt nauwkeurig de klinische kenmerken van ALS, waaronder vroege motorische tekorten, ruggenmergneurodegeneratie en een verkorte overlevingsperiodevan 30. Eerdere preklinische studies hebben aangetoond dat het toedienen van SOD1-specifieke ASO's via langdurige intraventriculaire toediening met osmotische pompen bij SOD1-G93A-ratten op postnatale dag 65 bij een dagelijkse dosis van 100 μg gedurende 28 opeenvolgende dagen leidt tot significante onderdrukking van SOD1-niveaus, vermindering van neuro-inflammatoire reacties, vertraagde opkomst van klinische signalen en verbeterde motorische prestaties31. Bovendien is ASO-gemedieerde knockdown van SOD1 bij mensen met SOD1-ALS geassocieerd met verlagingen van het neurofilament light chain (NfL)-niveau, een bloedgebaseerde biomarker die wijst op axonale schade32. In dit onderzoek hebben we SOD1-gerichte ASO's toegediend via IT-injectie in SOD1-G93A-muizen en hun impact geëvalueerd op moleculaire, elektrofysiologische en biomarker-uitlezingen. Kwantitatieve analyse van ruggenmergweefsel toonde significante dalingen van SOD1 mRNA-niveaus aan. Elektrofysiologische beoordelingen van samengestelde spieractiepotentialen (CMAP's) toonden behouden neuromusculaire functie aan. Tegelijkertijd daalden de serum NfL-niveaus, wat een vermindering van aanhoudende neuronale schade weerspiegelt.

Om de ruimtelijke verdeling en relatieve effectiviteit van alternatieve toedieningsmethoden voor het centraal zenuwstelsel te evalueren, includeerden we een vergelijkende arm die gebruikmaakt van intracerebroventriculaire (ICV) injectie, waarbij het therapeutische middel in de laterale ventrikels wordt ingebracht voor verspreiding via CSF-stroming langs ependymale en perivasculaire ruimtes33. Door IT- en ICV-toedieningsroutes te vergelijken, wilden we verschillen in farmacodynamische uitkomsten en weefseltargeting afbakenen, waardoor de toedieningsstrategieën voor door het CNS aangestuurde ASO-therapieën werden verfijnd. Daarnaast hebben we, om de translatie-haalbaarheid te beoordelen, onafhankelijke tolerantiestudies uitgevoerd met maximaal vier IT-injecties per dier, met een tussenruimte van acht weken. Bij alle geteste regimes werden geen duidelijke tekenen van stress of morbiditeit waargenomen, wat de draagbaarheid van IT ASO-dosering in de context van overleving ondersteunt. Deze resultaten komen overeen met eerdere rapporten die de verdraagzaamheid van herhaalde intrathecale injecties bij muizen34 aantonen.

De klinische relevantie van de levering van IT ASO wordt verder ondersteund door de recente goedkeuringen van tofersen (QALSODY)® voor SOD1-geassocieerde ALS35. Klinische studies toonden robuuste doelbetrokkenheid aan, wat zich weerspiegelt in verminderingen van het CSF SOD1-eiwit, gevolgd door dalingen van het niveau van de lichte keten van de neurofilamenten, een biomarker van neuroaxonale schade. Hoewel het primaire eindpunt niet werd bereikt in de initiële fase 3 VALOR-studie, suggereerden geïntegreerde analyses inclusief de open-label verlenging mogelijke voordelen van een eerdere behandelingsstart35.

Gezamenlijk tonen de gegevens hier aan dat IT-levering van SOD1-gerichte ASO's in het SOD1-G93A ALS-muismodel effectieve moleculaire knockdown, biomarkerverbetering en functioneel behoud met gunstige draagbaarheid bereikt. Deze resultaten ondersteunen de levering van IT ASO als een rationele en klinisch haalbare benadering voor genetische aandoeningen van het Centraal Zenderpunt en bieden een robuust preklinisch kader voor verdere translationele ontwikkeling.

Protocol

Alle procedures hier zijn goedgekeurd en uitgevoerd volgens door de IACUC goedgekeurde protocollen en institutionele richtlijnen voor chemische hygiëne en bioveiligheid.
OPMERKING: Voer studies uit bij C57BL/6J (JAX #000664) en SOD1-G93A transgene muizen (JAX #004435) die onder standaardomstandigheden worden gehuisvest (12-uur licht/donker cyclus, 22-24 °C, ad libitum toegang tot voedsel en water).

1. Het toepassen van chemisch gemodificeerde ASO's om menselijke SOD1 te targeten

  1. Gebruik gevalideerde antisense-oligonucleotiden (ASO's) om specifiek nucleotiden 613-629 binnen het 3' niet-vertaalde gebied (UTR) van het menselijke SOD1-gen te targeten (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*T*C
  2. Bevat gevalideerde chemische aanpassingen om stabiliteit en effectiviteit te verbeteren, door MOE (2'-O-Methoxyethyl) (aangeduid in het gewone lettertype), cEt (Constrained Ethyl) (cursief), DNA (vetgedrukt), fosfaatverbindingen (o) en fosforothioaatverbindingen (*) toe te voegen, zoals eerder gerapporteerd36. Aanvullend Bestand 1 presenteert de ASO-chemie met bijbehorende kleurcodering.
  3. Bereid een niet-doelgerichte controle-ASO voor zonder complementariteit met menselijke of knaagdiergenomen, volgens hetzelfde modificatieschema voor gebruik als controle: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*C*AoGoGoA*A

2. Het voorbereiden en hanteren van ASO-oplossingen onder steriele omstandigheden

  1. Reconstrueren ASO in steriel kunstmatig cerebrospinaal vocht (aCSF; Tabel 1) tot een concentratie van 10 mg/mL onder steriele omstandigheden, gericht op een uiteindelijke injectievolume van 10 μL (100 μg) per dier.
  2. Meng de oplossing voorzichtig met een steriele pipet om de moleculaire integriteit te behouden, en laat de oplossing dan 5-10 seconden lichtjes vortexen om te zorgen dat het goed gemengd is.
  3. Filter de verdunde oplossing door een steriele 0,2 mm spuitfilter om deeltjes en verontreinigingen te verwijderen.
  4. Aseptisch aliquot de eindoplossing in steriele microcentrifugebuizen en tot 1 week opslaan bij 4 °C in een gecontroleerde, temperatuurgecontroleerde eenheid, waarbij vries-dooicycli worden vermeden om stabiliteit te behouden.

3. Muisvoorbereiding voorafgaand aan intrathecale injectie

  1. Weeg elke muis tot de dichtstbijzijnde 0,1 g met een digitale weegschaal, breng dan over naar een neuskegel en induceer verdoving met isoflurane bij een concentratie van 2-2,5% zuurstof; Monitor de diepte continu en bevestig het chirurgische vlak door verlies van de pedaalreflex.
  2. Bereid een thermostatisch geregeld verwarmingskussen voor en stel het in op 37 °C om muizen te ondersteunen tijdens de voorbereiding en het herstel.
  3. Breng onmiddellijk na de inleiding van de anesthesie oogvocht op beide ogen aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Vervolgens plaatst de muis in ventrale ligging op het verwarmingskussen om onderkoeling te voorkomen, fysiologische stress te minimaliseren en normale cardiovasculaire en ademhalingsfuncties gedurende de procedure te ondersteunen.
  4. Dien buprenorfine met verlengde afgifte injecteerbare suspensie (1,3 mg/mL) subcutaan toe bij 3,25 mg/kg met een steriele spuit met een 25-G naald en injecteer 0,05 mL per 20 g lichaamsgewicht voorafgaand aan de ingreep.
  5. Schaf het lumbale gebied van midden op de flank tot aan de bekkengordel, desinfecteer het gebied vervolgens met afwisselende watten isopropylalcohol en povidonjodium, herhaal dit drie keer en laat de plek volledig aan de lucht drogen.

4. Directe intrathecale injectie

  1. Na de narcose en voorbereiding op de operatieplek plaats je de muis naar een schoon injectiegebied en plaats je hem in ventrale ligging op het verwarmingskussen.
  2. Plaats de muis in een positie die de wervelkolom bogen om palpatiën en injectie te vergemakkelijken.
    1. Plaats een gebogen spatel onder de buik op het niveau van de onder- en bovenste lendenwervelkolom om milde spinale flexie te induceren en de lumbale tussenwervelruimtes tussen de vijfde en zesde (L5-L6, bij voorkeur) of vierde en vijfde (L4-L5) laminae te verbreden.
    2. Schuif de naald naar voren tussen de laminae om de lumbale cistern binnen te gaan en toegang te krijgen tot de subarachnoïdale ruimte, terwijl direct contact met bot wordt vermeden om de injectieveiligheid en nauwkeurigheid te verbeteren.
  3. Stabiliseer de bekkengordel door voorzichtig de bekkengordel tussen duim en wijsvinger van één hand vast te pakken en met de andere hand de dorsale middenlijn te palperen om de doelruimte tussen L4-L5 of L5-L6 te lokaliseren.
  4. Lijn een steriele 0,3 mL insulinespuit uit met een 29-G, 1/2-inch naald loodrecht op het dorsale huidoppervlak of onder een hoek van 70-80°, met de schuine kant gericht op de cranial. Schuif de naald naar voren totdat er lichte weerstand wordt gevonden wanneer deze de dura mater binnendringt, en ga dan verder in de intrathecale ruimte.
  5. Plaats het gestaag in totdat de tip de intrathecale ruimte binnenkomt, bevestigd door een staart-flickreflex die een succesvolle intrathecale ingang aangeeft.
  6. Als er aanzienlijke weerstand wordt gevonden of geen staart-zwaaireflex wordt waargenomen, trek dan de naald terug, identificeer de anatomische herkenningspunten opnieuw en pas de naaldplaatsing aan voordat je opnieuw probeert te injecteren. Als de eerste poging werd uitgevoerd in de L5-L6 intervertebrale ruimte, voer dan de volgende poging uit in de L4-L5 intervertebrale ruimte.
  7. Injecteer 10 μL van de ASO-oplossing langzaam (meer dan 10 s) om drukveranderingen te minimaliseren en CSF-reflux te voorkomen. De naald kan nog eens 10 seconden op zijn plaats worden gehouden na de injectie.
  8. Trek de naald voorzichtig verticaal en soepel terug om weefselschade en terugstroming te voorkomen.
  9. Houd de muis continu in de gaten tijdens de herstelperiode, waarbij je ademhaling, motorische functie, houding en eventuele tekenen van pijn of stress observeert.
  10. Zorg ervoor dat de muis weer normaal beweeglijk en gedrag krijgt voordat hij terugkeert naar zijn thuiskooi.
  11. Documenteer alle relevante procedurele details, waaronder de injectieplaats, ASO-dosis, injectievolume en eventuele gedrags- of fysiologische observaties tijdens en na de procedure, in overeenstemming met de IACUC-protocollen.

5. Muizen monitoren en herstel na injectie ondersteunen

  1. Plaats elke muis in een afzonderlijk of goed geplaatst compartiment binnen een voorverwarmde herstelkamer die op 37 °C wordt gehouden.
  2. Houd de temperatuur van de kamer gecontroleerd tijdens het herstel van de anesthetica om onderkoeling te voorkomen.
  3. Houd continu de ademhalingsfrequentie en het patroon, de houding en de responsiviteit op tactiele prikkels in de gaten.
  4. Observeer de muis totdat deze de rechtstaande reflex terugkrijgt en gecoördineerde bewegingen vertoont.
  5. Voorkom overbevolking om goed zicht te garanderen en interferentie te voorkomen.

6. Criteria bepalen voor terugkeer naar de thuiskooi

  1. Controleer of de muis stabiel is met gecoördineerde spontane beweging.
  2. Zorg ervoor dat er geen tekenen van onrust zijn, waaronder zware of onregelmatige ademhaling, vocalisaties en langdurige niet-reageren.
  3. Bied zachte voedingsondersteuning, zoals een voedingsvolledig geldieetsupplement, om hydratatie en calorie-inname met minimale inspanning te behouden.

7. Waarneming na herstel van muizen

  1. Controleer normaal gedrag zoals verkennen, verzorgen en sociale interactie als de muizen in groepen worden gehuisvest.
  2. Houd continu in de gaten op tekenen van abnormaal herstel, zoals een ongebruikelijke houding, zwakte of verlamming, onregelmatige ademhaling of verminderde responsiviteit, en beoordeel snel opnieuw als deze symptomen optreden.
  3. Zoek veterinaire hulp als het herstel vertraagd of belemmerd is.

8. Intracerebroventriculaire injectie in de laterale ventrikel met behulp van stereotaxische chirurgie en postoperatieve zorg

OPMERKING: Neem een vergelijkende arm op die intracerebroventriculaire (ICV) injectie gebruikt om de ruimtelijke verdeling en relatieve effectiviteit te beoordelen, waarbij ASO's worden toegediend in de laterale ventrikels voor CSF-gemedieerde verspreiding en vergelijking met intrathecale toediening. Voer de ICV-injecties uit volgens goed vastgestelde, gestandaardiseerde protocollen voor muizen37.

  1. Verdoof de muis met isofluraan in een concentratie van 2-2,5% zuurstof voor immobiliteit, plaats de muis in ventrale liggeving op het verwarmingskussen en dien vervolgens buprenorfine met verlengde afgifte (1,3 mg/mL buprenorfinehydrochloride) subcutaan toe bij 3,25 mg/kg met een steriele 1 mL spuit met een 25-G naald van 0,05 mL per 20 g lichaamsgewicht vóór de procedure. Schaf de hoofdhuid van de muis met een tondeuse.
  2. Voer alle chirurgische ingrepen onder narcose uit. Houd een steriel aseptisch veld in stand tijdens de ICV-operatie. Gebruik alleen steriele instrumenten en ga voorzichtig met ze om contact met niet-steriele oppervlakken te voorkomen.
  3. Zet de muis vast in een stereotaxisch frame met een digitale displayconsole in de standaard liggende positie. Plaats de voortanden in de tandstaaf van de muisadapter om de kop te immobiliseren, en bevestig de adapter vervolgens met de inhalatie- en uitlaatbuizen die isofluraan afleveren. Steek de oorbeulen in de oren en draai de schroeven aan om het hoofd stevig te stabiliseren.
  4. Desinfecteer het gebied met afwisselende watten isopropylalcohol en povidonjodium, herhaal drie keer, en maak een middenlijnincisie met een steriel scalpel om de schedel bloot te leggen. Gebruik een steriele katoenen tip om zachte weefsels te verwijderen en zorg dat de bregma duidelijk zichtbaar is.
  5. Markeer de bregma op de schedel. Plaats de ASO-bevattende spuit met een naald (26-G, 26s/2"/2, puntstijl) net boven de bregma. Lijn de naald uit op doelcoördinaten: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm vanaf het schedeloppervlak. Markeer de schedel bij de AP- en ML-coördinaten.
  6. Maak een maalgat bij de gemarkeerde coördinaten en gebruik vervolgens een stereotactisch frame om de spuitnaald tot een diepte van -3 mm vanaf het schedeloppervlak te laten zakken. Injecteer de oplossing met een snelheid van 10 μL/min totdat een totaal volume van 10 μL is toegediend. Na het voltooien van de injectie houd je de naald 4 minuten op zijn plaats en trek je hem dan langzaam terug om reflux te minimaliseren.
  7. Hecht de hoofdhuidincisie, plaats de muis in een voorverwarmde herstelkamer van 37 °C tot hij volledig wakker is, en zet hem terug in de thuiskooi na bevestiging van stabiliteit. Geef een voedingsvolledig geldieetsupplement en monitor continu tekenen van abnormaal herstel, zoals een ongebruikelijke houding, zwakte of verlamming, onregelmatige ademhaling of verminderde responsiviteit; Beoordeel snel opnieuw als een van deze symptomen zich voordoet.

9. Elektrofysiologische beoordelingen van samengestelde spieractiepotentialen (CMAP)

  1. Zorg ervoor dat de onderzoekers geblindeerd zijn voor zowel het genotype als de behandelgroep van elke muis om bias tijdens gegevensverzameling en analyse te elimineren.
  2. Verdoof de muis met isoflurane voor immobiliteit en comfort, en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C.
  3. Bevestig voldoende verdoving door te zorgen voor het verlies van de pedaalreflex.
  4. Gebruik wegwerpelektroden van 28 G monopolaire naalden voor zowel stimulatie als opname. Steek de opname-elektrode 1 mm in de voorste spier tibialis.
  5. Stimuleer de ischiaszenuw nabij de ischiasnotch met 0,1 ms monofasische vierkante golfpulsen die elke 2 seconden worden afgegeven, beginnend bij 1,0 mA en opnemend in stappen van 0,5 mA totdat een supramaximale respons (typisch 1,5-3,5 mA) wordt bereikt.
  6. Zodra de supramaximale drempel is bepaald, registreer je CMAP-responsen op 0,5 mA boven dat niveau. Meet de CMAP-amplitude (piek-tot-piek) bij 0,8 ms post-stimulus om latentie uit te sluiten en gemiddeld de amplitudes van de linker- en rechterpoot per muis.

10. Het meten van serum pNFH-waarden

  1. Verzamel 100 μL volbloed door een gezichtsvene-punctie met capillaire bloedverzamelbuisjes met stolselactivator en serum-scheidingsgel op bepaalde tijdstippen.
  2. Centrifugeer bloedmonsters op 2000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het serum te isoleren.
  3. Kwantificeer serum-fosforyleerde neurofilament heavy chain (pNFH)-niveaus met gevalideerde immunoassay-reagentia voor meting van pNFH in biologische monsters op een volledig geautomatiseerde, cartridge-gebaseerde microfluïde immunoassay-analyzer.

11. RNA isoleren en RT-qPCR uitvoeren

  1. Verpulver muizencervicale/thoracale ruggenmergweefsels met een stalen kraal van 6 mm in een cryogene programmeerbare, hoogenergetische oscillerende kraalmolen voor monstervermalening met 1.000-1.200 slagen per minuut gedurende 30-40 seconden.
  2. Homogeniseer het verpulverde weefsel (15 mg) met 2,8 mm keramische kralen in 700 μL fenol-guanidiniumthiocyanaat-gebaseerde lyse en RNA-extractie-reagens met een programmeerbare, hogesnelheidskraal-gebaseerde mechanische homogenisator bij 5,62 m/s gedurende twee 30-s cycli.
  3. Haal het totale RNA uit met de, inclusief on-kolom DNase-behandeling, volgens de instructies van de fabrikant.
  4. CDNA synthetiseren met behulp van een hoogcapaciteit reverse transcription reagenssysteem voor cDNA-synthese.
  5. Voor qPCR-detectie ontwerp je aangepaste primer/probesets om het gen van belang te detecteren dat gericht is op exon 4 van het menselijke SOD1-gen:
    voorste primer (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    Achterste primer (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    Sonde (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Gebruik muis GAPDH (TaqMan Assay ID: Mm99999915_g1) als huishoudelijk gen.
  7. Voer qPCR uit op een high-throughput realtime quantitatieve PCR (qPCR) instrument met 20 ng cDNA per reactie, een snelcyclus-probe-gebaseerde qPCR-mastermix, genspecifieke primers en fluorescentie-gelabelde hydrolyseprobes voor detectie van huishoudelijke (VIC/MGB) en target (FAM/MGB) transcripten.

12. Statistische analyse van de gegevens

  1. Presenteer gegevens van in-life metingen (CMAP), serum pNFH en genexpressie-analyse als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
  2. Beoordeel de statistische significantie tussen groepsgemiddelden met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest, waarbij p < 0,05 statistisch significant is.
  3. Gebruik geschikte statistische analysesoftware om grafieken te genereren en alle analyses uit te voeren, in overeenstemming met die in de studie uitgevoerd.

Resultaten

Om de precisie en efficiëntie van intrathecale (IT) toediening bij volwassen muizen rigoureus te karakteriseren, voerden we eerst fundamentele validatie-experimenten uit waarbij Evans blauwe kleurstof (0,5%) werd gebruikt als visuele tracer van CSF-stroom en weefselpermeatie. Volwassen wildtype C57BL/6J muizen (stam #000664; gewicht 25-30g) werden verdoofd met isoflurane (2-2,5%) in zuurstof om bewegingsartefacten te elimineren, en het lumbale gebied werd voorbereid onder aseptische omstandigheden. IT-injecties werden uitgevoerd door lumbaalpunctie in de subarachnoïdale ruimte bij enkele oplopende doses van 20 μL, 30 μL en 50 μL om dosis/volume en de relatie tussen kleurintensiteit te beoordelen. De juiste plaatsing van de naald werd bevestigd door een staartzwaai of negatieve weerstand tijdens de injectie te observeren.

Binnen 5 minuten na het toedienen van de kleurstof werden muizen transcardiaal geperfuseerd met koud fosfaatgepufferde zoutoplossing (PBS) om de resterende kleurstof uit de bloedvaten te verwijderen. Daarna werden de ruggenmerg voorzichtig verwijderd en onder standaardlicht tegen een neutrale achtergrond gefotografeerd. Visuele inspectie toonde een consistente en uniforme dorsale naar ventrale verdeling van Evans blue bij alle muizen die verf kregen. Hogere injectievolumes correleerden met een versterkte kleurstofverzadiging over de rostrocaudale as, hoewel zelfs de muis die met het 20 μL volume werd geïnjecteerd, ook robuuste kleuring vertoonde. Daarentegen vertoonden muizen die geen Evans blue kleurstof kregen (controlegroep geïnjecteerd met steriel zoutoplossing) geen zichtbare verkleuring of achtergrondkleuring in het ruggenmergweefsel (Figuur 1). Deze bevindingen tonen aan dat IT-injecties bij muizen een snelle, reproduceerbare levering van opgeloste stoffen langs het ruggenmerg mogelijk maken. Beperkingen van deze experimenten zijn onder meer het ontbreken van kwantitatieve evaluatie van de kleurstofverdeling en het ontbreken van een analyse van kleurstofverdeling bij het 10 μL injectievolume dat wordt gebruikt voor ASO-toediening. Kwantificatie werd echter uitgevoerd in latere doelenengagementmetingen op genexpressieniveau bij menselijke SOD1-G93A-muizen met behulp van humane SOD1-specifieke genexpressieanalyse. Het injectievolume van 10 μL dat in latere experimenten voor ASO-toediening werd gebruikt, werd geselecteerd om een veilige en goed verdragen dosering bij muizen te garanderen en wordt verwacht voldoende blootstelling aan het centraal te stellen op basis van eerdere studies38.

Voortbouwend op deze anatomische validatie evalueerden we vervolgens de functionele relevantie van IT-levering met behulp van ASO's gericht op mutant SOD1, een gevalideerde therapeutische strategie in SOD1-ALS-modellen. Hemizygote SOD1-G93A transgene muizen, die het menselijke mutante SOD1-gen bevatten, vertonen voorspelbare motorneurondegeneratie en neuromusculaire achteruitgang, waardoor ze een gevestigd preklinisch model zijn. Op 5 weken leeftijd, vóór het begin van symptomen, kregen muizen een enkele IT-bolus van een SOD1-specifieke ASO in een concentratie van 100 μg in 10 μL. Deze dosis is geselecteerd op basis van eerdere optimalisatiestudies uitgevoerd met ICV-toediening bij muizen, zoals gerapporteerd door McCampbell et al. (2018)36. Om de effectiviteit tussen IT- en ICV-toediening te vergelijken, kreeg een aparte groep ICV-injecties van dezelfde ASO-dosis met behulp van stereotactische toediening. Controls ontvingen Inactive ASO (non-targeting control) via de IT-route.

Vijf weken na de behandeling (op 10 weken leeftijd) ondergingen muizen een compound muscle action potential (CMAP) test onder lichte isoflurane anesthesie. CMAP-opnames van de spieren van de achterpoot, opgewekt door gestandaardiseerde ischiaszenuwstimulatieprotocollen, toonden significant behoud van amplitude aan in zowel IT- als ICV-behandelde groepen vergeleken met inactieve door ASO behandelde controles (p < 0,0001 via eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc-test). Belangrijk is dat amplitudebehoud niet significant verschilde tussen IT- en ICV-toedieningsmethoden (p> 0,05), wat wijst op vergelijkbare neuromusculaire bescherming (Figuur 2A).

Om systemische biomarkers van neuronale integriteit te beoordelen, werden serumniveaus van gefosforyleerde neurofilament heavy chain (pNFH) gemeten met een zeer gevoelige elektrochemiluminescentie-assay. Bloedmonsters die 5 weken na injectie werden genomen, toonden een vermindering van >40% in pNFH-concentratie bij met ASO behandelde muizen ten opzichte van de controlegroepen met het voertuig behandeld (p < 0,0001), zonder significant verschil tussen de IT- en ICV-modaliteiten (Figuur 2B). De uniforme moleculaire biomarkerrespons bevestigt de elektrofysiologische gegevens, wat suggereert dat IT-levering neurodegeneratieve processen in dit ALS-model effectief vermindert.

Om de doelbetrokkenheid van SOD1-ASO op moleculair niveau te beoordelen, voerden we reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) uit op dissecte cervicale en thoracale ruggenmergweefsels. Totaal RNA werd geëxtraheerd met een kolomgebaseerd protocol, wat een hoge zuiverheid (A260/A280>1,8) garandeerde, gevolgd door cDNA-synthese met willekeurige hexamerpriming. Kwantitatieve PCR-amplificatie gericht op menselijke SOD1-transcripten, genormaliseerd naar GAPDH, toonde een gemiddelde knockdown van 60% na IT-levering en 35% na ICV-levering, beide significant ten opzichte van inactieve ASO-controles (p < 0,0001 voor beide). Directe vergelijking tussen afleveringsroutes liet significant een grotere knockdown met IT-levering zien (p< 0,0001), wat wijst op effectievere doelbetrokkenheid in het ruggenmerg via directe wervelkolomtoegang (Figuur 3). Verdere studies zijn nodig om de betrokkenheid van doelwitten in andere CNS-regio's te beoordelen.

Gezamenlijk bieden deze uitgebreide gegevens overtuigende validatie van IT-injecties als een precieze, reproduceerbare en minimaal invasieve techniek om ASO's aan het centrale zenuwstelsel (CZS) toe te dienen in muismodellen. De IT-administratie toonde een therapeutische effectiviteit aan die gelijk is aan ICV-afgifte over een breed spectrum aan uitkomstmaten, waaronder aanhoudend behoud van neurologische functie (CMAP), normalisatie van ziekte-relevante biomarkers (pNFH) en robuuste moleculaire knockdown van menselijke SOD1-transcripten binnen beoogde CNS-regio's. Deze bevindingen benadrukken de veelzijdigheid van IT-levering als klinisch vertaalbare route voor op het CNS gerichte ASO-therapieën, met een effectiviteit gelijk aan ICV, terwijl de procedurele eenvoud en de invasieve invasiviteit behouden blijven. Daarom zijn IT- en ICV-levering even haalbare benaderingen voor op het CNS gerichte interventies, die flexibiliteit bieden in preklinische omgevingen, afhankelijk van anatomische toegankelijkheid, procedurele haalbaarheid en therapeutische context. Dit positioneert IT-levering als een veelbelovend vertaalplatform voor toekomstige therapieën gericht op het CNS. Om translationele inspanningen te ondersteunen, stellen wij voor verdere preklinische studies uit te voeren om de farmacokinetische verdeling binnen de cerebrospinale vloeistof, verschillende CZS-regio's en de opname van doelcellen te beoordelen, met technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie of immunofluorescentie.

figure-results-1
Figuur 1: Visualisatie van de verdeling van Evans blauwe kleurstof na intrathecale injectie bij volwassen muizen. Evans Blue Dye (0,5%) werd toegediend via directe intrathecale (IT) injectie bij volwassen muizen om de verdeling van het ruggenmerg kwalitatief te beoordelen. Drie verschillende kleurstofvolumes: 20 μL, 30 μL en 50 μL werden toegediend in afzonderlijke experimentele groepen (n = 1 muis per volume conditie). Na injectie werden de ruggenmerg geoogst en doorgespoeld om de penetratie van de kleurstof te beoordelen op basis van de kleurintensiteit langs het weefsel. Beelden van het ruggenmerg tonen de mate van kleurstofverspreiding die bij elk injectievolume samenhangt, wat een dosisvolume-afhankelijke toename in dekking en kleuringsintensiteit door het hele ruggenmerg aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: SOD1-gerichte antisense-oligonucleotidetherapie herstelt de motorische functie en verlaagt het pathologische neurofilamentniveau bij muizen. Volwassen SOD1-G93A transgene muizen kregen een enkele dosis van ofwel actieve SOD1-gerichte antisense oligonucleotide (SOD1-ASO) via intrathecal (IT) of intracerebroventriculaire (ICV) injectie op 5 wekenleeftijd, of een inactieve controle-ASO via IT-injectie. Het therapeutische effect werd geëvalueerd op 10 weken leeftijd, overeenkomend met 5 weken na de behandeling. (A) Opnames van het samengestelde spieractiepotentieel (CMAP) werden verkregen om de neuromusculaire functie bij behandelde dieren te beoordelen. Groepen met SOD1 met ASO behandeld (n = 5 - 6 per groep) vertoonden een omkering in de afname van CMAP ten opzichte van de controlegroep, wat wijst op functioneel herstel. (B) Perifere niveaus van gefosforyleerde neurofilament heavy chain (pNFH), een biomarker van neurodegeneratie, werden gekwantificeerd uit serum verzameld in week 10 (n = 5 - 8 per groep). De behandeling van SOD1-ASO leidde tot een significante verlaging van circulerende pNFH-niveaus ten opzichte van de controle, wat wijst op een vermindering van ziektegerelateerde neuronale schade. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. De statistische significantie werd bepaald met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest, waarbij p-waarden ≤ 0,0001 robuuste verschillen tussen behandelgroepen aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: SOD1-ASO-toediening onderdrukt significant de expressie van humane SOD1 mRNA in het transgene SOD1-G93A muisruggenmerg. Om de doelgerichtheidsefficiëntie van SOD1-gerichte antisense-oligonucleotide (SOD1-ASO) te evalueren, toegediend via intrathecal (IT) of intracerebroventriculaire (ICV) injectie, werd cervicale/thoracale sectie van ruggenmergweefsel van SOD1-G93A transgene muizen, geëuthanaseerd op 10 weken oud (5 weken na toediening), geanalyseerd op humane SOD1 mRNA-expressie met behulp van reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). De transcriptniveaus van humaan SOD1 werden gekwantificeerd en genormaliseerd ten opzichte van expressie in de inactieve ASO-behandelde groep. De figuur toont de vouwverandering in het humane SOD1-mRNA (genormaliseerd naar GAPDH) voor elke behandelgroep (n = 5-7 muizen per groep), wat een aanzienlijke downregulatie als reactie op SOD1-ASO-toediening benadrukt. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische verschillen tussen groepen werden bepaald met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest, waarbij p-waarden ≤ 0,0001 robuuste verschillen tussen behandelgroepen aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ComponentFWOptelhoeveelheid (per L of kg)Eenheden
Natriumfosfaat monobase dihidraat0.034g
Natriumfosfaat dibasisch anhydraat1420.111g
Natriumchloride58.448.766g
Kaliumchloride74.560.224g
Calciumchloridedihidraat147.020.206g
Magnesiumchloride hexahydraat0.163g
Water (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabel 1: aCSF-compositie.

Aanvullende Figuur 1: Muispositie voor lumbale intrathecale injectie. Een gebogen spatel of scoopula onder de buik buigt de wervelkolom en verruimt de tussenwervelruimte. De injectie richt zich op het niveau van L4-L5 of L5-L6, met een juiste uitlijning langs de mediale as van de wervelkolom zoals getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend Dossier 1: ASO-sequentie en chemie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De hier gepresenteerde direct intrathecale (IT) injectietechniek is een minimaal invasieve maar zeer effectieve methode om therapeutische middelen in het centrale zenuwstelsel (CZS) toe te dienen, vooral in kleine knaagdiermodellen zoals muizen. Deze blinde-stick procedure is technisch uitdagend, maar is zowel reproduceerbaar als klinisch relevant wanneer uitgevoerd door een getrainde injector. Deze methode maakt gebruik van precieze anatomie en efficiënte technieken om snelle toegang tot het centrale zenuwstelsel te bieden zonder katheterisatie, een belangrijke vereenvoudiging met aanzienlijke voordelen voor het uitbreiden van preklinische studies; de translationele relevantie ervan zal echter profiteren van verdere kwantitatieve beoordeling en gestandaardiseerde methodologische validatie 5,8,10.

Een succesvolle IT-injectie hangt af van verschillende belangrijke stappen. Nauwkeurige voorbereiding van dieren is essentieel: anesthesie wordt eerst geïnduceerd in een kamer en onderhouden met een neuskegel, gevolgd door het scheren van het lendengebied en het toedienen van pijnstillers om het comfort van de dieren te waarborgen. De juiste positie van de muis wordt bereikt door een gebogen spatel onder de buik te plaatsen, waarbij de stekel wordt gebogen om de tussenwervelruimte te verbreden (aanvullende figuur 1). Het doel van de hier beschreven intrathecale injectie is om de afschuining van de naald in de lumbale cisterne te positioneren door deze tussen de laminae op het juiste wervelniveau te plaatsen. Nauwkeurige targeting van de tussenwervelruimte tussen de L4- en L5-laminae, of bij voorkeur, de L5- en L6-laminae is cruciaal voor toegang tot de subarachnoïdale ruimte 5,10. De subarachnoïdale ruimte, ook wel de intrathecale ruimte genoemd, ligt tussen de arachnoïde en pia mater39. Omdat het ruggenmerg korter is dan het wervelkanaal, liggen de caudale ruggenmergsegmenten rostraler ten opzichte van hun overeenkomstige wervelniveaus. Om ambiguïteit te voorkomen, worden injectieplaatsen aangeduid op basis van de intervertebrale ruimte in plaats van het ruggenmergniveau. Opmerkelijk is dat er aanzienlijke variabiliteit bestaat in lumbale wervelsegmentatie bij muizen, zowel binnen als tussen stammen40. De injectie moet langs de middenlijn van de wervelkolom worden uitgevoerd om laterale afwijking te voorkomen, wat kan leiden tot parese van de achterledemaat of, in ernstige gevallen, verlamming door een ruggenmergletsel. Wanneer uitgevoerd op de juiste anatomische locatie, is het risico op direct ruggenmergletsel minimaal. Er blijft echter een klein risico op irritatie of schade aan zenuwwortels, wat het belang onderstreept van voldoende training van de operator en procedurele bekwaamheid om nadelige gevolgen te minimaliseren. De staart-zwaaireflex dient als een nuttige indicator voor succesvolle naaldplaatsing, waardoor de injector de diepte kan inschatten en oppervlakkige of te diepe penetratie kan vermijden. Deze techniek vergt oefening om te beheersen, waarbij een constante controle van diepte, hoek en injectievolume nodig is om terugstroming en lekkage in omliggende weefsels te voorkomen. Hoewel we aanraden het injectievolume ≤10 μL te houden, hebben we tot 20 μL geëvalueerd zonder bijwerkingen. Eerdere studies hebben een intrathecal injectievolume van 10 μL als optimaal geïdentificeerd voor medicijnafgifte38. Hoewel dit 25-30% van het totale CSF-volume bijmuizen 41,42 vertegenwoordigt, is het maximaal tolereerbare intrathecale injectievolume bij volwassen muizen gerapporteerd op 30 μL10. Injectievolumes die de aanbevolen limieten overschrijden, kunnen de dynamiek van hersenvocht (CSF) verstoren, wat leidt tot een veranderde CSF-druk en een verhoogd risico op bijwerkingen. Het totale CSF-volume bij muizen wordt geschat op 35-40 μL en draait 12-13 keer per dag41,42, wat overeenkomt met een volledige vernieuwing ongeveer elke 1,8 uur42,43. Gezien de snelle CSF-omzet en empirische observaties, evenals eerdere studies die het veilige gebruik van intrathecale injectievolumes tot 20-30 μL zonder complicaties aantonen, wordt niet verwacht dat een injectievolume van 10 μL bijwerkingenveroorzaakt.

Schaalbaarheid is een belangrijk voordeel van deze techniek. Eenmaal beheerst kunnen getrainde injectoren 10-12 dieren per uur behandelen, waardoor grotere preklinische studies mogelijk zijn zonder de logistieke lasten van katheterimplantatie of meer invasieve chirurgische benaderingen. De procedure vermijdt complexe instrumentatie, vermindert de stress bij dieren en verkortt de hersteltijd vergeleken met chronische katheterisatie, waardoor het geschikt is voor longitudinale studies die herhaalde dosering vereisen. Om klinische doseringsschema's te simuleren, valideerden we seriële IT-toedieningen bij muizen, waarbij tot vier doses met acht weken tussenpoot werden toegediend. Deze injecties werden goed verdragen, zonder tekenen van stress, gedragsveranderingen of ziekte, wat overeenkomt met eerdere studies die geen significante veranderingen in CSF-dynamiek of ruggenmergarchitectuur rapporteerden na meerdere IT-behandelingen34,45. Onze studies bevestigen dus dat herhaalde IT-dosering haalbaar is met passende intervallen, in lijn met menselijke behandelparadigma's waarbij langdurige doelbetrokkenheid noodzakelijk is voor therapeutisch voordeel. Uit onze ervaring zijn deze herhaalde IT-injecties succesvol uitgevoerd over een brede leeftijdscategorie van 5 tot 29 weken. Hoewel een toename van leeftijd en lichaamsmassa de toegankelijkheid van het ruggenmerg licht kan veranderen door groter onderhuids weefsel, blijft succesvolle toediening mogelijk met een bekwame operator die bedreven is in de techniek en bekend is met het gevoel van naaldplaatsing. We merken echter op dat verschillende factoren naast de injectieplaats en bolusvolume, met name de injectiesnelheid en de fysieke eigenschappen van de geïnjecteerde oplossing, zoals dichtheid ten opzichte van CSF, de verdeling van opgeloste stoffen binnen het CZS aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Hoewel deze parameters in de huidige studie niet direct werden gemeten of gemanipuleerd, toont recent werk van Linninger et al. (2023) via een mechanistisch farmacokinetisch model aan dat dergelijke factoren een significante invloed hebben op intrathecal antisense oligonucleotide (ASO) biodistributie en weefseldoelgroep46. Daarom erkennen we dit als een beperking van ons onderzoek en benadrukken we injectiesnelheid en oplossingseigenschappen als belangrijke variabelen voor toekomstig onderzoek om de levering van het CNS en de relevantie van de translatie te optimaliseren. Samen benadrukken deze resultaten de betrouwbaarheid en haalbaarheid van herhaalde IT-dosering in preklinische paradigma's met meerdere doses, wat het gebruik ervan ondersteunt voor langdurige doelbetrokkenheid en translationele modellering van menselijke therapeutische regimes.

De IT-aanpak biedt ook flexibiliteit bij therapeutisch testen. Het biedt plaats aan een breed scala aan modaliteiten, waaronder ASO's, kleine moleculen, peptiden en virale vectoren, waardoor directe evaluatie van op het CZS gerichte interventies mogelijk is. Het vermogen om precieze, gecontroleerde hoeveelheden therapeutica in de lumbale cistern te leveren, zorgt voor een effectieve blootstelling aan het ruggenmerg en bredere blootstelling aan het centrale zenuwstelsel, terwijl systemische overloop wordt beperkt. De staart-zwaaireflex en andere procedurele aanwijzingen maken realtime verificatie van succesvolle intrathecale levering mogelijk, wat de reproduceerbaarheid verder verbetert en de experimentele faalpercentagesverlaagt 5,6,8,47.

Eerdere studies bij SOD1-G93A-muizen toonden aan dat de ziektepathologie het ruggenmerg, vooral de lumbale regio, prominenter treft dan in de cortex29,48. Daarom is deze techniek vooral relevant in de context van SOD1-ALS, een genetische vorm van ALS veroorzaakt door mutaties in het superoxide-dismutase 1 (SOD1)-gen. Deze mutaties produceren verkeerd gevouwen SOD1-eiwitaggregaten die leiden tot een toxische functiewinst binnen motorneuronen, wat leidt tot een progressieve neuromusculaire achteruitgang49,50. In deze studie gebruikten we SOD1-gerichte ASO's om succesvolle betrokkenheid met doel-mRNA en functioneel herstel aan te tonen. RT-qPCR-analyse toonde significante onderdrukking van menselijke SOD1-transcripten in het ruggenmerg na IT-toediening, terwijl CMAP-opnames een omkering van motorneurondysfunctie aangaven. Bovendien toonde serumanalyse een afname van het niveau van gefosforyleerde neurofilament heavy chain (pNFH), een biomarker van neurodegeneratie, wat de effectiviteit van de therapeutische strategie versterkte.

De klinische relevantie van dit model wordt benadrukt door de recente FDA-goedkeuring van tofersen (QALSODY®), een ASO die is ontworpen om SOD1-mRNA te targeten voor de behandeling van SOD1-ALS35. Tofersen wordt intrathec toegediend bij mensen met SOD1-ALS en heeft duidelijke farmacodynamisch gedrag getoond, inclusief verminderingen van het totale CSF SOD1-eiwitniveau (indirecte marker van doelwitactiviteit) en plasma NfL (marker van axonale schade en neurodegeneratie). In geïntegreerde analyses van de fase 3 VALOR-studie en de OLE werd de vroegere start van behandeling met tofersen geassocieerd met verminderingen van achteruitgang in metingen van klinische functie, sterkte en kwaliteit van leven, evenals een vermindering van het risico op sterfgelijkwaardige gebeurtenissen35. Deze gegevens valideren de intrathecale route als een krachtige weg voor op het CNS gerichte ASO-therapie en geven preklinische studies met vergelijkbare toedieningsstrategieën een sterk translationeel gewicht.

Naast de bruikbaarheid bij ALS heeft de IT-route succes aangetoond bij spinale spieratrofie (SMA)14,51,52, waarbij de door IT toegediende ASO Nusinersen (Spinraza®) de eerste goedgekeurde therapiewas. IT-injecties omzeilen de bloed-hersenbarrière en maken brede biodistributie van het NERVOUS(CNS) mogelijk, wat cruciaal is voor ziekten die worden gekenmerkt door diffuse neuronale pathologie. Hoewel herhaalde dosering logistieke en tolerante uitdagingen met zich meebrengt, blijven ontwikkelingen in formulering en toedieningstechnieken IT-administratie haalbaarder maken voor langdurige behandeling.

IT-administratie biedt een grotere translationele relevantie voor de klinische praktijk van de mens dan ICV-injecties. ICV- en IT-injecties bij volwassen muizen verschillen voornamelijk in hun doellocatie binnen het centrale zenuwstelsel en de resulterende verspreiding en effecten van de toegediende stof. ICV-injecties leveren stoffen direct in het hersenvocht (CSF) binnen de laterale ventrikels van de hersenen, met name gericht op supraspinale plaatsen. Daarentegen leveren IT-injecties stoffen af in het CSF binnen de spinale subarachnoïdale ruimte, waarbij ze zich voornamelijk richten op het ruggenmerg. Hoewel beide methoden de bloed-hersenbarrière omzeilen en directe levering van het zenuwstelsel mogelijk maken, kan IT-toediening leiden tot een langere werkduurvan actie 54 voor sommige verbindingen en resulteert het doorgaans in sterkere transductie in het ruggenmerg, terwijl ICV hoge lokale concentraties kan bereiken in hersengebieden naast de laterale ventrikel54. Het is echter belangrijk op te merken dat stoffen die in het spinale CSF worden toegediend de hersenen kunnen bereiken, hoewel de transportsnelheid zeer langzaam is1. Deze verschillen worden ook weerspiegeld in procedurele risico's. ICV-injecties hebben een groter risico op besmetting als de steriliteit wordt aangetast, terwijl IT-injecties, hoewel niet risicovrij, minder kwetsbaarheden bevatten die aan apparaten gebonden zijn. Na de procedure kunnen IT-injecties tijdelijke ongemakken of reacties op de achterpoot veroorzaken, terwijl ICV-injecties geassocieerd worden met minder direct ongemak, hoewel lokale craniale irritatie mogelijk blijft.

Toekomstige toepassingen van deze techniek reiken verder dan de huidige preklinische studies. IT-levering kan worden ingezet om next-generation op het CNS gerichte therapieën te evalueren, waaronder genbewerkingstools (bijv. CRISPR/Cas-systemen), RNA-interferentiemodaliteiten en op virale vectoren gebaseerde gentherapieën. De aanpak is aanpasbaar voor combinatietherapieën die meerdere CNS-routes aanpakken, waardoor realtime beoordeling van farmacodynamische interactiesmogelijk is 55,56. Bovendien kan IT-administratie worden geïntegreerd met beeldvormingsmodaliteiten om distributie en target-betrokkenheid in vivo te volgen, waardoor translationele pijplijnen worden versneld. De techniek biedt ook een platform voor het bestuderen van precisiegeneeskundestrategieën over genetisch gedefinieerde muismodellen van neurologische ziekten, waardoor biomarkerontdekking, longitudinale functionele beoordelingen en veiligheidsbeoordelingen voorafgaand aan klinische vertaling mogelijk worden.

Samenvattend vertegenwoordigt de directe lumbale IT-injectietechniek met isoflurane anesthesie een minimaal invasieve, snelle en klinisch vertaalbare methode voor het toedienen van therapieën in het muis-CZS. De succesvolle toepassing in SOD1-ALS-modellen en compatibiliteit met seriële dosering vormen een sterke basis voor bredere inzet in translationeel neurowetenschappelijk onderzoek. Naarmate het vakgebied zich ontwikkelt met een groeiende nadruk op CNS-genmodulatie, RNA-gerichte therapieën en precisiegeneeskunde, zal de IT-route een belangrijke geneesmiddelafgiftestrategie blijven, die preklinische modellen verbindt met klinisch succes.

Openbaarmakingen

SM en S-C L zijn huidige werknemers van Biogen, Inc., terwijl TC, DF, YL, JD en MZ voormalige werknemers van het bedrijf zijn. De antisense-oligonucleotiden die in dit artikel worden besproken, zijn aan de auteurs verstrekt door Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) is een gezamenlijk ontwikkeld product van Biogen en Ionis Pharmaceuticals.

Dankbetuigingen

We willen Ionis Pharmaceuticals bedanken voor het leveren van de ASO's die in het artikel worden beschreven. We zijn dankbaar aan Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz en David Koske van Biogen voor hun deskundige bijdragen, die het manuscript aanzienlijk hebben versterkt door hun inhoudelijke revisies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.3 mL 29 G, 1/2 inch insulin syringe voor IT-injectieSmiths Medical4429-3
0.5 mm diameter steriele boorslijpFine Science Tools (FST), of equivalent1900705
5-0 Prolene monofilament hechtdraadEthicon 8870H 
Alcohol wattenstaafjesDynarex1203
Alcohol wattenstaafjesDynarex1203
Analgesicum- Buprenorfine met verlengde afgifteRecept vereist
DierenclipWahl08787-450A
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie KitFisher Scientific43-688-14
Bead Ruptor 24 HomogenisatorOmni International, Inc.19-070
Bloedverzamel- en serumscheidingsbuisjesBeckton Dickinson (BD)365967
Calciumchloride DihydraatJT Baker1335
Digitale spuitpompHarvard Apparatus70-4507
Ella Geautomatiseerd Immuno-assay SysteemR&D Systems600-100
Oogzalf-PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 DroogsterilisatorBraintree Scientific, of equivalentGER 5287-120V
Hamilton spuit met naald (26s/2"/2 (puntstijl)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                                26s: 26 G;                                                                                                                                     2" lengte;                                                                                                                                                                                                                                                             

Referenties

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

SOD1 antisense oligonucleotidenALS muismodeltoediening via cerebrospinale vloeistofinjectie in het ruggenmergintracerebroventriculaire injectieelektrofysiologische beoordelingneurofilament biomarkerkwantitatieve PCR
Lumbale intrathecale injectie van SOD1-ASO's voor precieze CNS-targeting en voorspellende effectiviteit bij menselijke SOD1-G93A ALS-muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.