Cholinerge ligandafhankelijke modulatie van oxidatieve fosforyleringskoppeling in digonine-permeabiliseerde BE(2)-C neuroblastoomcellen

Summary

We presenteren een protocol om plasmamembraan selectief te permeabiliseren, waardoor gerichte toediening van substraten en remmers mogelijk is om mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in gekweekte cellen te beoordelen, waarmee plasmamembraantransportbarrières worden overwonnen die dergelijke analyse doorgaans belemmeren. Met deze techniek hebben we aangetoond hoe de werking van OXPHOS wordt gemoduleerd door muscarinische agonisten en antagonisten.

Abstract

Het doel van deze studie was het beoordelen van de oxidatieve fosforylering (OXPHOS)-functie in gekweekte cellen met behulp van gedefinieerde substraat-inhibitorcombinaties, terwijl de cellulaire structuur en cytosolische context behouden bleven, die verloren gingen in geïsoleerde mitochondriale preparaten. Omdat intacte cellen slecht doorlaatbaar zijn voor verschillende Krebs-cyclus tussenproducten, is directe beoordeling van substraat-ondersteunde ademhaling via specifieke elektronentransportketen (ETC) toegangspunten beperkt. Om dit te overwinnen, pasten we digitonine-gemedieerde selectieve plasmamembraanpermeabilisatie toe en voerden we extracellulaire fluxanalysator-gebaseerde koppelings- en elektronenstroomassays uit in BE(2)-C neuroblastoomcellen. Om celtypeafhankelijkheid te bepalen, werd digitonine empirisch getitreerd in HEK293-cellen en primaire ratten-dorsale wortelganglion (DRG)-neuronen met succinaat + rotenon om de door Complex II–IV aangedreven ademhaling te isoleren.

Succinaat-ondersteunde ademhaling met Complex I-remming toonde een verhoogde zuurstofopname (O₂) in permeabilisatie in vergelijking met niet-permeabiliseerde cellen, wat consistent is met verbeterde toegang van een membraanimperbestemd substraat tot mitochondriën. Daarentegen vertoonde ademhaling, ondersteund door substraten die via endogene transportroutes binnenkomen (bijv. pyruvaat/malaat), kleinere verschillen tussen de omstandigheden. Met dit platform om muscarine-liganden te testen, observeerden we agonist- versus antagonist-geassocieerde verschillen in O₂-verbruik in de koppelingsassay, terwijl de elektronenstroomassay minimale ligand-geassocieerde effecten onder de geteste omstandigheden liet zien. Deze bevindingen geven aan dat detecteerbare ligandeffecten prominenter waren op het niveau van koppel-gedefinieerde ademhalingstoestanden dan de maximale elektronenoverdrachtscapaciteit. Over het algemeen vergroot selectieve permeabilisatie de toegankelijkheid van substraat in gekweekte-cel bio-energetische assays en maakt het analyse mogelijk van farmacologische modulatie van mitochondriale ademhaling.

Introduction

Storing of herprogrammering van het mitochondriale energiemetabolisme staat centraal bij een breed spectrum aan aandoeningen, waaronder neurodegeneratie, kanker, ontstekingsziekten, cardiometabole aandoeningen en diverse genetische aandoeningen. Om de rol van mitochondriale stofwisseling in ziektepathogenese beter te begrijpen, zijn verschillende analytische strategieën ontwikkeld. Deze omvatten metingen van_{O2-consumptiesnelheid} (OCR), extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR), ATP-kwantificatie, substraatgebruik, profilering of Krebscyclus-metabolietanalyse, en isotooptracering¹. Onder deze technieken dient OCR als een belangrijke indicator van mitochondriale ademhaling en kan het worden beoordeeld met instrumenten zoals High-Resolution Respirometrie (HRR; bijv. Oroboros_O2k)², Clark-type elektrode of de extracellulaire fluxanalysator

Het Oroboros_O2k-systeem meet_{O2-concentratie} in een afgesloten kamer met behulp van Clark-type polarografische O2-sensor (POS)^3,4,5 en is geschikt voor monsters zoals geïsoleerde mitochondriën, permeabiliseerde cellen en weefselhomogenaten. Het bestaat uit een goud/platina kathode, een zilveranode en een KCl-elektrolytenreservoir, gescheiden van het monster door een 25 μm_O2 permeabel en chemisch resistent fluorgekleurd ethyleenpropylengembraan (FEP). De Clark-type elektrode³ werkt ook in een gesloten kamer, detecteert veranderingen in_{O2-concentratie} via een_O2-gevoelige elektrode, en wordt vaak gebruikt voor geïsoleerde mitochondriën of celsuspensies. Daarentegen kwantificeert de extracellulaire fluxanalysator OCR en ECAR in levende adherente cellen of geïsoleerde mitochondriën met behulp van fluorescerende sensoren ingebed in microplaten, waardoor hoogdoorvoer-metabole profilering mogelijk is. Een praktisch voordeel van het extracellulaire fluxanalyzerplatform is geautomatiseerde, multiparametrische beoordeling onder meerdere condities parallel, terwijl gesloten-kamersystemen (bijv. HRR- of Clark-type elektroden) doorgaans een lagere doorvoer bieden en meer handmatige behandeling vereisen.

De extracellulaire fluxanalysator is vooral nuttig voor het evalueren van mitochondriale functie in intacte adherente cellen of suspensiecellen die zich onderaan de microplaat vestigen. In assays met intacte adherente cellen kan het mitochondriale energiemetabolisme worden geprofileerd met substraten zoals glucose of pyruvaat⁶. Als alternatief maken assays met kleine hoeveelheden verrijkte mitochondriale fracties sequentiële metingen mogelijk van basale ademhaling, ADP-gestimuleerde ademhaling (Toestand 3), rustademhaling (Toestand 4) en ontkoppelde ademhaling met combinaties van substraten en remmers⁷. In intacte celsystemen kunnen metabolieten van tricarboxylzuur (TCA) die niet celpermeabel zijn echter niet direct worden gebruikt om hun metabolisme te beoordelen. Hoewel geïsoleerde mitochondriën het gebruik van dergelijke metabolieten mogelijk maken vanwege het ontbreken van plasmamembraanbarrières. Analyse van de geïsoleerde verrijkte mitochondriale bio-energetica benadering kent beperkingen: de mitochondriale structuur kan tijdens isolatie worden veranderd, en cytosolische factoren die mitochondriaal metabolisme en metaboliettransport beïnvloeden, zijn verminderd of afwezig. Daarom worden selectieve permeabilisatiebenaderingen vaak gebruikt als een compromis dat aspecten van de cellulaire architectuur kan behouden terwijl gecontroleerde toegang tot mitochondriën mogelijk is. Om de beperkingen van het gebruik van intacte cellen of geïsoleerde mitochondriën voor metabole assays te overwinnen, beschrijft dit protocol een methode voor het permeabiliseren van adherente neuroblastoom (BE(2)-C) cellen met behulp van digitonine. Deze aanpak faciliteert de import van anderszins niet-cel-permemitterende metabolieten over het plasmamembraan, terwijl functionele mitochondriale responsen op gedefinieerde substraten en remmers behouden blijven.

De selectiviteit van digitonine is gebaseerd op verschillen in de samenstelling van membraanlipiden: het plasmamembraan is rijk aan cholesterol, terwijl mitochondriale membranen—met name het binnenste mitochondriale membraan—zeer weinig cholesterol⁸ bevatten. Bij lage concentraties permeabiliseert digitonine (of saponine) selectief en volledig het plasmamembraan vanwege het hoge cholesterolgehalte, terwijl mitochondriale membranen alleen bij hogere concentraties^(9,10) worden aangetast. Digitonine bindt aan cholesterol en vormt poriën in het plasmamembraan, waardoor kleine moleculen zoals TCA-cyclusintermediairen het cytosol kunnen binnendringen zonder de mitochondriale structuur of functie te verstoren wanneer het goed wordt geoptimaliseerd. Deze benadering is het meest geschikt voor gekweekte cellen die reproduceerbaar kunnen worden geplateerd als adherente monolagen in een extracellulaire fluxanalyzer-microplaat en vereist empirische titratie van de digitonineconcentratie voor elk celtype en zaaidichtheid. Operationele indicatoren van de behouden mitochondriale integriteit zijn robuuste, remmergevoelige OCR-responsen (bijv. verwachte afnames met rotenon/antimycine A en intacte Complex IV-gedreven ademhaling met ascorbate/TMPD), samen met de afwezigheid van OCR-collapse die overpermeabilisatie zou signaleren. Daarom moet digitoninenoptimalisatie worden uitgevoerd vóór experimentele vergelijkingen en herhaald worden wanneer de kweekomstandigheden of celdichtheid veranderen. Bovendien varieert de optimale digitonineconcentratie per celtype en moet empirisch worden bepaald om een permeabilisatievenster te creëren dat de toegang tot impergeerde substraten (bijv. succinaat) toestaat, terwijl de mitochondriale functie behouden blijft die voor de remmers gevoelig is. In deze studie illustreren we dit principe door digitonine niet alleen te optimaliseren in BE(2)-C-cellen, maar ook in HEK293-cellen en primaire rattenwortelganglion (DRG) neuronen.

Dit protocol werd aangetoond met behulp van BE(2)-C neuroblastoomcellen, die oorspronkelijk werden geïsoleerd uit de hersenen van een mannelijke patiënt met neuroblastoom. BE(2)-C-cellen expresseren verschillende muscarinereceptoren, met name de cholinerge receptor muscarine type-1 (CHRM1). In onze eerdere studies toonden we aan dat CHRM1 geassocieerd is met mitochondriën in zowel de cellichamen als neurieten van gekweekte rattenwortelganglionneuronen, evenals in CHRM1-getransfecteerde HEK293-cellen¹¹. Bovendien verandert genetische deletie van Chrm1 bij muizen meerdere aspecten van de mitochondriale structuur en functie^12,13. Daarom stellen we de hypothese op dat BE(2)-C-cellen gebruikt kunnen worden om de modulerende effecten van muscarine-liganden op de functie van OXPHOS te onderzoeken. In deze demonstratie onderzochten we de effecten van muscarine-agentia—waaronder agonist acetylcholine, de bevooroordeelde antagonist pirenzepine¹⁴ en de antagonist atropine—op mitochondriale ademhaling in aanwezigheid van succinaat of pyruvat/malaat als substraten en vergeleken hun effect.

Protocol

1. Ontdooien en initiële beplating

OPMERKING: Het basismedium voor BE(2)-C-cellen is een 1:1 mengsel van door ATCC geformuleerde Eagle's Minimum Essential Medium en F12 Medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS).

1. Ontdooi bevroren BE(2)-C-cellen van een cryoviaal in een waterbad van 37 °C. Eenmaal ontdooid, centrifugeer je de cellen 5 minuten met 200 × g om het cryoprotectant te verwijderen.
2. Suspendeer de celpellet opnieuw in een compleet groeimedium en plaats de cellen in een celkweekschaal van 10 cm. Incubeer de kweek bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ in de lucht totdat de cellen subconfluentie bereiken.

2. Subculturing

1. Subcultuur de cellen 2–3 gangen om ervoor te zorgen dat ze een stabiele exponentiële groeifase bereiken.

3. Trypsinisatie en preparatie van single-cell suspension

1. Wanneer de kweek 60–80% confluentie bereikt, trypsiniseer je de cellen. Voer de celsuspensie meerdere keren door fijne tip-overdrachtspipetten met gepolijste punten om klonten te dissociëren en een single-cell suspension te bereiken.
2. Voeg vers medium met FBS toe om de trypsine te neutraliseren. Centrifugeer de cellen op 200 × g gedurende 5 minuten om ze te pelleten.

4. Celzaaiprotocol voor 24-put celcultuur microplaten gebruikt in extracellulaire fluxanalysator

1. Suspendeer de pellet opnieuw in een volledig medium met een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen per 100 μL per put.
2. Zaad de cellen met een geoptimaliseerde dichtheid om ervoor te zorgen dat ze binnen 1–2 dagen volledig samenvloeien. Laat de vier hoekputten of één hoekput leeg, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Deze putten zullen dienen als achtergrondcontrole.
   OPMERKING: Dit kan trial-and-error vereisen, inclusief aanpassingen van het mediavolume en de timing.
3. Houd de kweek in de gaten op veranderingen in de kleur van het medium—vergeling duidt op een daling van de pH en vereist onmiddellijke vervanging door een nieuw medium om de celgezondheid te behouden.

5. Voorbereiding op een extracellulaire fluxanalyzer-gebaseerde assay

OPMERKING: De hier gebruikte koppelings- en elektronenstroomassayformaten volgen gevestigde microplaat-gebaseerde mitochondriale ademhalingsworkflows⁷, met aanpassingen waaronder permeabilisatie van BE(2)-C-cellen met behulp van digitonine-titratie en behandeling van muscarine-liganden.

1. Bereid bouillonoplossingen en 2x mitochondriale assayoplossing (MAS) voor. Bereid van tevoren 2x MAS-mengsels en werkreagens (substraten en inhibitoren) voorraadoplossingen voor (zie Tabel 1, Tabel 2 en Tabel 3).
2. Bewaar alle voorraadoplossingen en MAS op -20 °C voor toekomstig gebruik, wat een efficiënte assay-opstelling mogelijk maakt.
   VEILIGHEID: Rotenon, antimycine A, oligomycine, FCCP, digitonine en TMPD zijn gevaarlijk en moeten worden behandeld volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Alle remmervoorraadoplossingen moeten worden voorbereid en behandeld in een gecertificeerde chemische dampkap, terwijl de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen (labjas, nitrilhandschoenen en oogbescherming). Oplossingen die deze reagentia bevatten, evenals afval met DMSO, moeten worden verzameld en afgevoerd als gevaarlijk chemisch afval volgens institutionele en lokale regelgeving. Werkoppervlakken moeten na gebruik worden ontsmet.
3. Het hydrateren van de sensorcartridge
   1. De avond voor het experiment hydrateer je de extracellulaire fluxanalysator sensorcartridge door 1 ml sensorcartridge-kalibratiebuffer of fosfaatgebufft zoutoplossing (PBS, pH 7,4) aan elke put toe te voegen. Laat de sensorcartridge een nacht (12–18 uur) op kamertemperatuur (20–25 °C) staan.
      OPMERKING: Incubatie in een niet-CO₂ incubator bij 37 °C is niet noodzakelijk, omdat de cartridge tijdens het laadproces tot kamertemperatuur zal balanceren. Eenmaal geplaatst in de extracellulaire fluxanalysator voor kalibratie, bereikt de cartridge binnen ongeveer 15 minuten 37 °C.

6. Dag van het experiment

OPMERKING: Bereid alle oplossingen vers, pas de pH aan indien nodig en laat ze ijs liggen tot gebruik.

1. Ontdooi bevroren substraat en 2x MAS op kamertemperatuur (20–25 °C) gedurende 15–30 minuten of in een waterbad van 37 °C gedurende 5–10 minuten.
2. Bereid alle substraat- en injectieoplossingen voor (zie Tabel 4, Tabel 5, Tabel 6 en Tabel 7) en controleer dat de pH 7,4 is. Pas het aan indien nodig en laat de oplossingen ijs staan tot gebruik. Gebruik Tabel 4 en Tabel 5 voor de koppelingstest. Voor elektronenstroomtest gebruik Tabel 6 en Tabel 7.
3. Laad de inhibitors en substraten in de juiste poorten van de sensorcartridge en bereid de assay voor. Afhankelijk van het type assay—koppelingsassay of elektronenstroomassay ⁷ —raadpleeg respectievelijk Tabel 4 en Tabel 5 of Tabel 6 en Tabel 7, indien nodig.
4. Bereid alle substraat- en inhibitorwerkoplossingen voor op gedefinieerde eindvolumes (bulkmengsels: 15 mL; cartridge-injectiemengsels: 2 mL per poort). Bereken concentraties om de gewenste eindconcentraties in de put na injectie te bereiken (eindvolume van de put: 700 μL na Port D).
5. Voeg 450 μL van de voorbereide assayoplossing toe aan elke put van de 24-put extracellulaire fluxanalyzerplaat met muscarine-liganden (eindconcentratie van liganden: 1 μM; totaal putvolume: 500 μL). Zorg ervoor dat elke put al 50 μL 1x MAS-buffer en ondergedompelde cellen bevat.
   OPMERKING: Voer deze stap uit direct voordat je de plaat in de analyzer laadt.
6. Laad 50 μL van elk voorbereid reagens in de overeenkomstige injectiepoort van de sensorcartridge.

7. Instrumentprogrammering en assay-uitvoering

1. Zet de extracellulaire fluxanalysator minstens 1–2 uur voor het experiment aan om de interne incubator te laten stabiliseren op 37 °C. Houd de kamer tijdens de kalibratie en de testuitvoering op 37 °C.
2. Programmeer de analyzer om de juiste mix-, wacht- en meetcycli uit te voeren volgens Tabel 8.
3. Label putten en experimentele groepen in de software volgens het experimentele ontwerp.
4. Begin de assay-run. Laat het instrument de sensorcartridge kalibreren (~15 min).
5. Bereid de assayplaat voor voor het laden tijdens de kalibratie van de patroon. Vertraag het laden indien nodig; de sensorcartridge blijft stabiel bij 37 °C in het instrument.
6. Voltooi de assay wanneer de laatste meetcyclus na Port D-injectie is afgerond. Ga onmiddellijk over tot post-assay normalisatie en data-analyse.

8. Celplaatvoorbereiding voor extracellulaire fluxanalysator-assay

1. Begin direct na het plaatsen van de sensorcartridge in de analyzer met het voorbereiden van de celplaat voor kalibratie. Voeg 700 μL 1x MAS-buffer toe aan elke put met hechtende cellen. Breng 1 minuut uit bij kamertemperatuur (20–25 °C).
2. Aspireer de buffer voorzichtig zonder de aangesloten cellen te verstoren. Herhaal de wasstap minstens 3 x 1 minuut om het resterende kweekmedium te verwijderen en voltooi alle wasbeurten binnen 10 minuten.
3. Voeg 50 μL van een 1x MAS-buffer toe aan een aangewezen achtergrondput (geen cellen) om een visuele volumereferentie te creëren.
4. Aspiratiebuffer uit experimentele putten, waarbij ongeveer 50 μL restbuffer in elke put overblijft.
5. Incubeer de plaat bij 37 °C in een waterbad, waarbij je de plaat boven het wateroppervlak houdt om verdamping te voorkomen. Houd de temperatuur 10 minuten (maximaal 20 minuten) op 37 °C voordat je laadt.
6. Onmiddellijk voordat je de plaat laadt, voeg je 450 μL 1x MAS-buffer met de juiste substraten toe aan elke put om een uiteindelijk volume van 500 μL te bereiken.
7. Plaats de plaat in de extracellulaire fluxanalysator.

9. Einde van assay en data-analyse

1. Verwijder de celplaat en sensorcartridge van de analyzer na voltooiing van de run.
2. Normaliseer OCR-waarden per put met behulp van totale eiwitkwantificatie of totale celtellingen. Lyseer cellen met een ripa-buffer en kwantificeer het totale eiwit met behulp van de Bradford-assay of een andere spectrofotometrische eiwitassay.
3. Normaliseer OCR-waarden met de analysesoftware en exporteer data indien nodig.
4. Pas de volgende acceptatiecriteria toe: bevestig de basislijn OCR-stabiliteit (≤15% drift over twee opeenvolgende meetcycli) en bevestig ≥60% OCR-reductie na rotenon-, oligomycine- of antimycine A-injectie.
5. Sluit runs uit die niet aan deze criteria voldoen en optimaliseer de permeabilisatorconcentratie of celzaaddichtheid indien nodig.

10. Resultaten exporteren

1. Steek een USB-stick in het instrument.
2. Exporteer de assaygegevens.

11. Gegevensverwerking

1. Analyseer data met behulp van de instrumentsoftware.
2. Exporteer verwerkte data in formaten die compatibel zijn met analysesoftware naar keuze voor verdere analyse en visualisatie.

Results

Optimalisatie van digitoninconcentratie voor BE(2) C-celpermeabilisatie in koppelingsassay
Aan het begin van dit protocol hebben we de optimale digitonineconcentratie gestandaardiseerd die nodig is voor effectieve celpermeabilisatie zonder de mitochondriale ademhaling te beïnvloeden. In dit protocol testten we 5 μM en 10 μM digitonine als startconcentraties en voerden we een koppelingstest uit. Deze assay evalueert de mate van koppeling tussen de ETC en de OXPHOS-mach...

Discussion

Deze studie introduceert een snel en kosteneffectief protocol voor het evalueren van muscarine-ligand-gemedieerde modulatie van OXPHOS in gekweekte neuroblastoomcellen. Door gebruik te maken van het selectieve plasmamembraan permeabilisator digitonine, in combinatie met gedefinieerde substraat-remmerparen, maakten we gerichte levering van metabole substraten zoals succinaat direct aan mitochondriën in situ mogelijk. Deze aanpak overwint de beperkingen van intacte celmembranen, d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine chloride	MilliporeSigma	A6625	Muscarine agonist
ADP	MP Biomedicals, Inc	ICN19014901	Elektronacceptor, substraat voor ATP-synthese.
Antimycin A	AAJ63522MA	Thermo Scientific	Remt mitochondriële complex III
Atropine	MilliporeSigma	1044990	Muscarine antagonist
Be2C cellen	American Type Culture Collection	CRL-2268	Een neuroblastcel die werd geïsoleerd uit de hersenen van een mannelijke patiënt met neuroblastoma, drukt muscarine receptor uit
Digitonine	MilliporeSigma	D141	Zachte detergent, membraanpermeabilisator.
D-Mannitol	Thermo Scientific Chemicals	AA3334236	Een niet-metaboliseerbare suikeralcohol, gebruikt voor osmotische stabilisatie en bescherming van membranen
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Calciumchelatie, voorkomt activering van calciumafhankelijke proteasen en andere enzymen die mitochondriale eiwitten kunnen afbreken.
Vetzuurvrije BSA	MilliporeSigma	126575	Voorkomt ongecontroleerde vetzuureffecten, stabiliseert mitochondriën
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Een protonofoo en ontkoppelingsmiddel van oxidatieve fosforylering in mitochondriën
HEPES	MilliporeSigma	391340	pH-buffering, compatibiliteit met mitochondriale functie
L-Ascorbaat	TCI America	A053925G	TCA-cyclus intermediaire, substraat van OXPHOS
Magnesiumchloride	MilliporeSigma	M8266	Voor ionenbalans, ondersteuning voor enzymatische activiteit
N1,N1,N1,N1-tetramethyl-1,4-fenyleendiamine (TMPD)			Elektronendonor voor Cytochroom c, beoordeling van complex IV-functie door Complex I en II te omzeilen, TMPD/ascorbinezuur maakt directe meting van Complex IV-afhankelijke zuurstofconsumptie mogelijk
Oligomycine	MilliporeSigma	1404-19-9	Remt mitochondriale ATP-synthese, Complex V
Pirenzepine dihydrochloride	MilliporeSigma	P7412	Muscarine vooringenomen agonist
Pyruwzuur	Thermo Scientific Chemicals	AC132155000	TCA-cyclus substraat
Rotenon	MilliporeSigma	557368	Remt mitochondriële complex I
Seahorse XF24 V7 PS Celcultuur Microplates	Agilent	102340-100	Celcultuur Microplates
Seahorse XFe24 Analyzer	Agilent	S7801BR	Agilent Seahorse XFe24 Analyzers meten de zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) en extracellulaire acidificatiesnelheid (ECAR) van levende cellen in een 24-well plate formaat.
Bernsteenzuur	Fisher Chemical	AC158742500	TCA-cyclus intermediaire, substraat van OXPHOS
XFe24 sensor cartridge kalibratie buffer	Agilent	102340100	PBS buffer pH 7.2
XFe24 sensor cartridges	Agilent	102340-100	sensor voor OCR en ECAR meting