Methodenartikel

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

357 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69791

⸱

17 april 2026

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Samenvatting

Chromatine-toegankelijkheid speelt essentiële rollen bij transcriptie, DNA-herstel en chromosoomsegregatie. Hypertoegankelijke gebieden correleren meestal met actieve promotoren en enhancers, wat de binding van transcriptiefactoren en regulatoire activiteit bevordert. De test voor transposase-toegankelijke chromatine met sequencing (ATAC-seq) maakt genoombrede profilering van chromatinetoegankelijkheid mogelijk met zeer weinig cellen. De toepassing ervan bij Caenorhabditis elegans wordt echter beperkt door de rijke collageenkuticula van de nematode, die celdissociatie bemoeilijkt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van ATAC-seq in hele wormen in de L4-fase. De procedure begint met gesynchroniseerde culturen en omvat verstoornis van de nagelriem, enzymatische dissociatie en cel-suspensiebereiding. Permeabiliseerde kernen worden vervolgens onderworpen aan Tn5-transpositie, gevolgd door polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie en zuivering van next-generation sequencing (NGS)-klaar bibliotheken. Dit protocol vereist 30 μL wormpellet, kan in één dag worden voltooid en genereert 5.000–9.000 toegankelijkheidspieken in de Bristol N2-referentiestam. Deze gestroomlijnde workflow kan worden aangepast aan andere ontwikkelingsstadia of FACS-gezuiverde celpopulaties. Door technische barrières voor ATAC-seq in C. elegans te verminderen, vergroot deze methode de mogelijkheden om de toegankelijkheid van genoom-brede chromatine te bestuderen als reactie op genetische en omgevingsverstoringen in een geheel organisme-context.

Inleiding

Eukaryote genomen zijn dicht opeengepakt in de celkern. Om ruimtelijke beperkingen te kunnen aangaan, is DNA strak omwikkeld rond nucleosomen, multiproteïnecomplexen bestaande uit acht histonen die sterk geconserveerd zijn over verschillende phyla1. Chromatine-toegankelijkheidspatronen variëren afhankelijk van de cellulaire toestand in een weefsel, en gen-specifieke patronen 2,3,4. Nucleosoomtoegankelijkheid correleert sterk met actieve transcriptie, vooral bij promotoren en distale regulerende regio's zoals enhancers, die toegankelijk zijn voor transcriptiefactoren5. Open chromatinegebieden spelen ook een belangrijke rol bij DNA-reparatie, replicatie en chromosoomsegregatie3. Daarentegen correleert verminderde toegankelijkheid meestal met gedempte heterochromatine en repetitieve sequenties 6,7.

Het in kaart brengen van chromatinetoegankelijkheid is een krachtige benadering geweest om genregulatie te begrijpen. Verschillende technieken zijn gebruikt om de toegankelijkheid van chromatine te onderzoeken. Onder de vroegste methoden werden micrococcale nuclease (MNase) en DNase I-digestie gebruikt om de positie en toegankelijkheid van het nucleosoom op specifieke loci 8,9 in kaart te brengen. Deze technieken werden later toegepast in genoom-brede studies in combinatie met next-generation sequencing (NGS)10,11. Deze technieken vereisen echter zorgvuldige kalibratie van enzymconcentratie en reactietijd, samen met een aanzienlijk aantal cellen, voor een succesvolle implementatie.

In 2013 richtte het Greenleaf-laboratorium de test op voor transposase-toegankelijke chromatine met sequencing (ATAC-seq) om naadloos de toegankelijkheid van chromatine op genoomniveau in kaart te brengen met een laag aantal cellen12. ATAC-seq maakt gebruik van de commercieel beschikbare Tn5-transposase om bij voorkeur korte DNA-sequenties (d.w.z. barcodes) in open chromatinegebieden in te brengen, doorgaans zonder nucleosomen, en correleert met actieve promotoren en enhancers. Het protocol vereist celpermeabilisatie en kernisolatie, gevolgd door beperkte vertering met Tn5 voor tagmentatie van hypertoegankelijke chromatine. Later worden complementaire indexen opgenomen tijdens PCR, waardoor samplemultiplexing vóór NGS13 mogelijk wordt. ATAC-seq heeft zich bewezen als een robuust protocol dat ook in silico transcriptiefactorvoetafdruk mogelijk maakt en is geïmplementeerd voor single-cell resolutie 14,15,16,17. Naast muizen en menselijke monsters is ATAC-seq geïmplementeerd in verschillende systemen, waaronder zebravissen en ongewervelden zoals Drosophila en de nematode Caenorhabditis elegans 18,19,20.

Decennialang is C. elegans een krachtig modelsysteem geweest op gebieden zoals ontwikkeling, celbiologie en neurowetenschappen, wat heeft geleid tot baanbrekende ontdekkingen waaronder de identificatie van micro-RNA's en de RNA-interferentie (RNAi)21,22. Het heeft een compact genoom van 100 MB met ~20.000 eiwitcoderende genen23. Genregulatie vindt plaats via promotoractiviteit en distale enhancers, die via ATAC-seq zijn in kaart gebracht over verschillende weefsels, ontwikkelingsstadia en verouderingstijden24,18. Chromatine-toegankelijkheidsprofilering is daardoor een waardevol hulpmiddel geworden om genregulatie bij C. elegans te begrijpen. Daarom biedt ATAC-seq bijzondere potentie voor het bestuderen van epigenetische landschappen onder verschillende omgevingsomstandigheden of wilde isolaten om diverse transcriptieresponsen te ontdekken. Daarnaast kan het inzicht geven in de chromatine-architectuur van andere pathogene en niet-pathogene nematoden.

Een van de belangrijkste methodologische uitdagingen bij C. elegans is de aanwezigheid van een collageenrijke cuticula die gedissocieerd moet worden om een homogene celsuspensie uit hele wormente verkrijgen. Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we verschillende protocollen gecompileerd en geoptimaliseerd om de nematoden te desintegreren en vervolgens ATAC-seq uit te voeren in C. elegans18,26. Het gebruik van het L4-larvale stadium heeft de voorkeur, omdat dieren op dit ontwikkelingspunt beschikken over een transcriptioneel actieve kiemlijn, die zich vertaalt in open chromatine en een consistente en informatieve bron van chromatinetoegankelijkheid biedt in somatische cellen. Hier presenteren we een snel en efficiënt protocol voor wormdissociatie en celsuspensiegeneratie, waarmee ATAC-seq in C. elegans mogelijk wordt. Onze methode is geoptimaliseerd voor L4-stadium wormen en vereist slechts 30 μL wormpellet, met de mogelijkheid aangepast te worden voor andere ontwikkelingsstadia of voor kleinere monsters, zoals FACS-gezuiverde cellen. Dit protocol kan worden uitgevoerd onder verschillende C. elegans-stammen en -omstandigheden, waardoor de identificatie van 5.000–9.000 chromatine-toegankelijkheidspieken in de Bristol-N2 referentiestam mogelijk is, wat de basis legt voor latere chromatine-toegankelijkheidsanalyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het wordt aanbevolen om altijd handschoenen te dragen.

OPMERKING: Dag 1: Voorbereiding van de gesynchroniseerde wormpopulatie. Alle wormen werden gekweekt op NGM-platen met zaaien van E. coli OP50. Benodigde zaken voor de start: (per monster of stam), één 90 mm of twee 60 mm volwassen wormplaat(en), één 90 mm of twee 60 mm platen met voedsel, M9 steriele buffer27 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 L. Steriliseren door autoclaven)

1. Verzameling wormen

  1. Neem een plaat van 90 mm (of twee van 30 mm) met de volwassen populatie van de worm.
  2. Haal de wormen terug met een M9-buffer en breng ze over in een 15 mL centrifugebuis.
  3. Herhaal de vorige stap om alle wormen van de plaat(en) te halen.
  4. Laat de wormen een minuut in de 15 mL buis zakken en verwijder voorzichtig de M9-buffer.
  5. Zorg dat je ~1 mL wormen hebt.

2. Bleken

  1. Voeg 5 mL M9-buffer toe + 650 μL NaOH 5M + 1.300 μL huishoudbleekmiddel (5% oplossing van NaClO).
  2. Vortex op maximale snelheid gedurende 1–2 minuten (niet langer dan 2,5 min).
  3. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 1 minuut bij RT (kamertemperatuur).
  4. Verwijder het supernatant en voeg 9 mL M9-buffer toe.
  5. Herhaal secties 2.3 en 2.4 nog vijf keer.
  6. Sussen de embryo's opnieuw in 7 mL M9-buffer.
    OPMERKING: Het bleekprotocol kan in efficiëntie variëren afhankelijk van temperatuur, type commercieel bleekmiddel28.

3. M9 (vloeistof) nachtelijke uitkomst van de eieren

  1. Zorg ervoor dat de verzamelbuis met de gebleekte eieren goed gesloten is.
  2. Zet de buis in slow movement bij 20 °C (bijvoorbeeld in een shaker in een kamer bij 20 °C).
  3. Wormen komen 's nachts uit en stoppen in L1.
    OPMERKING: Laat de buis niet langer dan 12 uur staan.

4. Dag 2: groei van wormen: herstellende L1-wormen .

  1. Haal de buis uit de shaker en bevestig onder de microscoop dat er L1-wormen zijn.
  2. Laat de buis ongeveer 1 uur verticaal zakken bij RT.
  3. Verwijder het supernatant en breng ~300 L1-wormen over op één 90 mm of twee platen van 30 mm met voedsel.
  4. Plaats ze in een incubator van 20 °C en laat ze 26 uur groeien tot ze het L4-stadium bereiken.

5. Dag 3: Bereiding van voorraadoplossingen: De volgende oplossingen moeten voorbereid worden om op dag 4 verse oplossingen te maken

OPMERKING: Dit kan op dag 2 of 3 gebeuren.

  1. 1 mL 10% SDS.
  2. 50 mL 1M HEPES pH 8 (autoclave).
  3. 250 mL van 20% sucrose (autoclave).
  4. 100 mL van 2M NaCl: voorbereiden (autoclave).
  5. 50 mL 2M KCl (autoclave).
  6. 10 mL van 1M CaCl2 (autoclaaf).
  7. 10 mL 1M MgCl2 (autoclaaf).
  8. 100 mL 1M Tris, pH 7,4.
  9. 5 mL 5M NaCl (autoclaaf).
  10. 500 μL van 10% Tween-20.
  11. 500 μL van 10% Nonidet P40/IGEPAL.
  12. 100 μL 5% Digitonine (moet tot 65 °C worden verhit om op te lossen).
  13. 500 μL 10% BSA (filter met 0,22 μm) opgeslagen bij 4 °C.
    Dag 4: L4-stadium wormen voor ATAC
    OPMERKING: Zorg ervoor dat je voor het begin een broedmachine hebt op 25 °C, een centrifuge van 4 °C klaar, verwarm Digitonine tot 65 °C (voor verse buffervoorbereiding), steriele M9-buffer, steriele H2O en 20 μm filters.

6. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid verse oplossingen voor (zie Tabel 1). Behandel L-15 10% FBS en egg buffer altijd onder steriele omstandigheden en houd ze koud.

Tabel 1: Bouillons voor de bereiding van verse oplossingen. Recepten voor de bereiding van de voorraad voor nematode-dissociatie en celsuspensieprotocol (secties 6 en 7). Klik hier om deze tabel te downloaden.

7. Nematode-dissociatie en celsuspensieprotocol

OPMERKING: Er is één 90 mm of twee platen van 30 mm nodig met een L4 gesynchroniseerde wormpopulatie.

  1. Na 26 uur in de 20 °C incubator, bevestig onder de microscoop dat het merendeel van de wormen zich in de L4-fase bevindt.
  2. Haal alle wormen uit de platen met een M9-buffer en plaats ze in een 1,5 mL centrifugebuis.
  3. Was 5 keer met 1 ml steriel H2O door de wormendoor de zwaartekracht te laten neerzetten.
  4. Breng de buis met de wormen over in een incubator van 25 °C voor 30 minuten om de darmresten te verwijderen.
  5. Neem 50 μL van de wormpellet en plaats het in een nieuwe buis.
  6. Voeg 200 μL SDS-DTT fresh buffer toe en meng een tube-rotator in voor precies 5 minuten (niet langer).
  7. Voeg 1 ml koude eierpuffer toe en draai een picofuge om supernatant te verwijderen. Herhaal dit 6 keer.
  8. Voeg 80 μL vers bereide pronase (15 mg/mL) toe.
  9. Met een 200 μL pipet (met gefilterde tips) meng je 70 keer de worms-pronase-mix en incubeer je 15 minuten bij RT.
  10. Voeg 800 μL L-15 10% FBS-medium toe en centrifugeer 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.
  11. Voeg 1 ml L-15 10% FBS-medium toe en herhaal de centrifugatie.
  12. Herhaal de vorige stap nog twee keer.
  13. Verwijder het supernatant en susseer opnieuw in 900 μL L-15 10% FBS-media.
  14. Filter met een 20 μm filter.

8. Kernisolatie en chromatinetagmentatie

OPMERKING: Gebruik pipetgefilterde tips. Voor de start: Haal de Tn5-buffer eruit, laat deze ontdooien, zet een thermoblok op 37 °C, haal de PCR-productzuiveringskit eruit (materiaaltabel), zet de EB-buffer op 37 °C, centrifugatie van de kolommen moet op RT worden uitgevoerd.

  1. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.
  2. Verwijder supernatant, laat ~50 μL over.
  3. Voeg 45 μL Lysis Buffer toe (vers bereid) en suspensie voorzichtig opnieuw.
  4. Voeg voorzichtig 50 μL Wash Buffer toe (niet mengen).
  5. Centrifugeer 5 minuten op 500 x g bij 4 °C. Verwijder supernatant. Houd hem in het ijs.
  6. Tijdens het spinnen bereid je voor elke reactie (Rx) de volgende Tn5-mix per monster voor: 25 μL Tn5 Buffer29, 24,8 μL Nucleasevrije H2O, 0,2 μL Tn5 enzym. Bereid een mastermix voor voor meerdere samples.
  7. Na centrifugatie verwijder je het supernatant. Houd de kernen op ijs. Voeg 50 μL Tn5-mengsel toe aan de kernpellet en pipette langzaam zeven maal. Incubeer 30 minuten op 37 °C op een thermoblok. Zorg ervoor dat je elke 10 minuten kleine tikjes op elke buis geeft.
    OPMERKING: Verwijder de PCR-zuiveringskit en plaats de EB Buffer in een incubator van 37 °C. De volgende 5 stappen gebruiken de buffers van deze kit.
  8. Na de Tn5-incubatie voeg je 300 μL PB-buffer (Geel) uit de kit toe en meng je een vortex op maximale snelheid gedurende 25 seconden.
  9. Haal al het volume uit de buis en doe het over in de spinkolom (paars, opgeslagen bij 4 °C) en centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid bij RT.
    OPMERKING: De kolom bevat het DNA, zodat het supernatant betrouwbaar kan worden weggegooid.
  10. Voeg 750 μL PE-buffer toe aan de spinkolom en centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid bij RT.
  11. Gooi het supernatant weg met de verzamelbuis. Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 mL buis en herhaal de centrifugatie; Gooi de 1,5 mL buis weg.
  12. Plaats de kolom in een nieuwe, gelabelde 1,5 mL buis en voeg 10 μL EB Buffer bij 37 °C toe aan het midden van de kolom. Zorg ervoor dat je de kolom niet aanraakt. Laat het 1 minuut op RT staan.
  13. Centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid bij RT; nooit bij 4 °C.
  14. Herhaal de laatste 2 stappen voor een totaal van 20 μL elusie in de EB-buffer.
    OPMERKING: Optionele pauze: Bij stoppen kunnen monster(s) worden opgeslagen bij -20 °C. Hier bevindt de getaggeerde chromatine zich in een volume van 20 μL.

9. Bibliotheekversterking

  1. Voor ATAC-bibliotheekversterking moet een realtime PCR worden uitgevoerd om het juiste cyclusamplificatiegetal te schatten (zie Tabel 2). Doe dit op een PCR-plaat.
  2. Om de cyclusnummers voor de eindversterking te schatten, moet het cyclusnummer worden genomen dat overeenkomt met het eerste derde deel van de amplificatiecurve. Het is ideaal dat het cyclusgetal niet hoger is dan 15. Het cyclusnummer moet voor elk monster worden geschat.
    OPMERKING: Na qPCR bevindt het getagmenteerde DNA zich in een volume van 18 μL. Optionele pauze: Als je wilt stoppen, kunnen monsters worden opgeslagen bij -20 °C.
  3. Definitieve versterking van ATAC Bibliotheek:
    1. Elk monster moet een andere Rv-primer hebben (maak aantekeningen).
    2. Elke steekproef moet worden versterkt voor het geschatte cyclusgetal (N) voor elk.
    3. Voer deze PCR uit in 200 μL buizen (zie Tabel 3).
    4. Hier zijn er 8 μL getagmenteerd DNA en 50 μL versterkte ATAC-bibliotheken
    5. Optionele pauze: Als je wilt stoppen, kunnen monsters worden opgeslagen bij -20 °C.

Tabel 2: Instructies voor de eerste bibliotheekversterking. Recept en PCR-programma voor eerste bibliotheekversterking (sectie 9). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Instructies voor de eindversterking van de ATAC-bibliotheek. Recept en PCR-programma voor de definitieve bibliotheekversterking (sectie 9). Klik hier om deze tabel te downloaden.

10. Bibliotheekzuivering

OPMERKING: Haal voordat je begint de maat keuzekralen (AMPure, SPRIselect of zelfgemaakte gekalibreerde kralen) uit de koelkast zodat ze kunnen wennen aan kamertemperatuur. Meng de kralen elke keer krachtig met de vortex voordat je ze gebruikt.

  1. Bereid 1 mL 80% ethanol (moleculair gehalte).
  2. Voeg 25 μL (0,5 vol) aan kralen toe aan de monsterbuis (waar 50 μL is) en meng met de pipet.
  3. Incubeer 10 minuten bij RT.
  4. Plaats de buizen 5 minuten in het magnetische rek.
  5. Breng het supernatant (70 μL) over naar een nieuwe, schone 200 μL buis.
    OPMERKING: In deze stap worden de DNA-fragmenten van <200 bp weggegooid.
  6. Voeg 65 μL (1,3 vol) kralen toe en meng 10 keer door.
  7. Incubeer 10 minuten bij RT.
  8. Plaats de buizen 5 minuten in het magnetische rek.
  9. Gooi het supernatant weg (zonder de buis van het magnetische rek te halen).
    OPMERKING: Op dit moment bevatten de kralen de DNA-fragmenten van >200 bp en <1000 bp.
  10. Met de buis nog op het magnetische rek, voeg je 200 μL vers bereide 80% ethanol direct over de kralen toe en pipet je ze meerdere keren op en neer om ze te wassen.
  11. Verwijder ethanol en herhaal de wasbeurt met 200 μL ethanol.
  12. Gooi de ethanol weg en laat de kralen dan met het deksel open ~2–5 minuten drogen (laat ze niet te veel drogen).
  13. Haal het monster(s) uit het magnetische rek. Opnieuw ophangen in 50 μL steriel H2O.Zorg ervoor dat je alle druppels van de wanden van de buis wast.
  14. Tot slot incubeer je de buis(s) 5 minuten in het magnetische rek.
  15. Breng het supernatant over in een nieuwe, schone buis. Hier worden de versterkte en gezuiverde ATAC-bibliotheken opgeslagen.
    OPMERKING: Bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor korte tijd (tot vier weken) of langere periodes bij -80 °C.

11. Fragmentgrootteverdeling

  1. Zodra de definitieve versterking is voltooid, is het raadzaam om een deel van het monster door een capillaire elektroforese te laten lopen om het fragmentgrootteverdelingspatroon te kunnen zien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwaliteitscontrole na tagmentatie zorgt voor nauwkeurige bibliotheekvoorbereiding
Tijdens het protocol is het belangrijk speciale aandacht te besteden aan qPCR die na chromatine-tagmentatie wordt uitgevoerd (sectie 9), aangezien dit een essentiële stap is voor het beoordelen van DNA-kwaliteit en de prestaties van het experiment. Figuur 1A toont twee versterkingscurves; De linker (minder dan 15 cycli) vertegenwoordigt materiaal van goede kwaliteit dat laat zien dat alles t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor het profileren van genoombrede chromatinetoegankelijkheid met ATAC-seq in volledige L4-stadium Caenorhabditis elegans-wormen . Chromatinetoegankelijkheid beïnvloedt direct genexpressie, DNA-reparatie, replicatie en recombinatie, en hoewel ATAC-seq een standaardbenadering is geworden voor cel- en weefselmonsters, brengt de toepassing ervan op intacte organismen unieke technische uitdagingen met zich mee, vooral bij nematoden m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben. Er werd geen generatieve AI gebruikt bij het schrijven, analyseren of voorbereiden van dit manuscript.

Dankbetuigingen

J Hersch-González ontving een doctoraatsbeurs van de Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (nu Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). J Hersch-González werd ondersteund door een CONAHCYT (nu SECIHTI) beurs (788519). Dit project werd ondersteund door de PAPIIT-UNAM-subsidie IN217824 en SECIHTI-subsidie CBF-2025-I-2275 aan VJV. Bij IFC bedanken we de UBM: Laura Ongay-Larios, Guadalupe Códiz Huerta en Minerva Mora Cabrera; de UBMI: Augusto César Poot-Hernández en Carlos Peralta Alvarez; en Unidad de Cómputo, Imagenología, Higher en Biblioteca. Wij danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) voor het leveren van de stammen die in dit werk zijn gebruikt. De CGC wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10GSchadelijk
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

Referenties

  1. Poulet, A., et al. Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom. NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).
  2. Meléndez-Ramírez, C., et al. Dynamic landscape of chromatin accessibility and transcriptomic changes during differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Sci. Rep. 11 (1), 16977(2021).
  3. Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  4. Koyanagi, K. O. Inferring chromatin accessibility during murine hematopoiesis through phylogenetic analysis. BMC Res. Notes. 16 (1), 222(2023).
  5. Gómora-García, J. C., Furlan-Magaril, M. Pioneer factors outline chromatin architecture. Curr. Opin. Cell Biol. 93, 102480(2025).
  6. Boivin, A., Dura, J. M. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila. Genetics. 150 (4), 1539-1549 (1998).
  7. Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front. Cell Dev. Biol. 8, 579137(2020).
  8. Escamilla-Del-Arenal, M., Recillas-Targa, F. G. GATA-1 modulates the chromatin structure and activity of the chicken alpha-globin 3′ enhancer. Mol. Cell. Biol. 28 (2), 575-586 (2008).
  9. Zhong, J., et al. Mapping nucleosome positions using DNase-seq. Genome Res. 26 (3), 351-364 (2016).
  10. Johnson, S. M., et al. Flexibility and constraint in the nucleosome core landscape of Caenorhabditis elegans chromatin. Genome Res. 16 (12), 1505-1516 (2006).
  11. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  12. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Buenrostro, J. D., et al. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).
  14. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), eaav1898(2018).
  15. Shema, E., Bernstein, B. E., Buenrostro, J. D. Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution. Nat. Genet. 51 (1), 19-25 (2019).
  16. Cao, J., et al. A human cell atlas of fetal gene expression. Science. 370 (6518), eaba7721(2020).
  17. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116.e20 (2020).
  18. Jänes, J., et al. Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing. eLife. 7, e37344(2018).
  19. Dhillon-Richardson, R. M., et al. Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq. Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).
  20. Huynh, K., et al. Genetic variation in chromatin state across multiple tissues in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 19 (5), e1010439(2023).
  21. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  22. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  23. Hillier, L. W., et al. Genomics in C. elegans: so many genes, such a little worm. Genome Res. 15 (12), 1651-1660 (2005).
  24. Daugherty, A. C., et al. Chromatin accessibility dynamics reveal novel functional enhancers in C. elegans. Genome Res. 27 (12), 2096-2107 (2017).
  25. Johnstone, I. L. The cuticle of the nematode Caenorhabditis elegans: a complex collagen structure. Bioessays. 16 (3), 171-178 (1994).
  26. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), e19505(2011).
  27. Stiernagle, T. Maintenance of Caenorhabditis elegans. WormBook. , The C. elegans. Research Community. (2006).
  28. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. JoVE. (64), e4019(2012).
  29. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ATAC Seqverstoring van de cuticulaceldissociatieTn5 transpositiepermeabilisering van kernennext generation sequencinggesynchroniseerde culturen

Gerelateerde artikelen