Deep-learning gebaseerde multi-joint synchrone tracking voor objectieve kwantificering van de achterpoot-lokomotorkinematica bij ratten

Summary

Dit protocol stelt een ratten-achterledemaat-kinematische evaluatiepijplijn op met behulp van een markerloze loopbandtest met deep learning-gedreven multi-joint traject auto-labeling, wat reproduceerbare bewegingskwantificatie mogelijk maakt.

Abstract

Nauwkeurige en objectieve beoordeling van rattengang is essentieel voor neurowetenschappelijke en kinesiologische onderzoeksvelden. Conventionele systemen vertrouwen vaak op footprint imaging voor indirecte loopinferentie, wat de kinematica van achterpoot met meerdere gewrichten niet volledig kan vastleggen. Deze studie stelt een markerloos loopsysteem, gebaseerd op loopband voor knaagdieren op, waarbij aangepaste deep learning-algoritmen worden geïntegreerd met een programmeerbare loopband met gewichtondersteuning, zodat meerdere onderledematen in realtime gevolgd kunnen worden en multidimensionale kinematische kwantificering worden toegepast. Het systeem extraheert automatisch gangcyclusparameters, gewrichtstrajecten, krachtverdelingspatronen en soepele bewegingen onder gemoduleerde snelheid (0-300 mm/s), helling (±30° gradiënt) en graded weight support (0-500 g) condities, wat een objectief beoordelingsinstrument biedt voor neuromusculair gedragsonderzoek. Met behulp van ruggenmergletsels (SCI)-modellen tonen de resultaten de gevoeligheid van het systeem aan bij het detecteren van multidimensionale verschillen in gewrichtsbewegingsbereik, trajectcontinuïteit, voortstuwingskracht en soepele beweging tussen gezonde en gewonde knaagdieren, waarmee de ziektediscriminatie en gradatiecapaciteiten worden bevestigd. In vergelijking met traditionele subjectieve scores of footprint-methoden elimineert dit platform persoonlijke bias en beperkingen op laag-dimensionale data, terwijl het een door deep learning gedreven architectuur en voordelen van dataverzameling met hoge doorvoersnelheid combineert. Het is toepasbaar op onderzoek naar centrale of perifere zenuwletsel, neurodegeneratieve ziekten, musculoskeletale aandoeningen en verouderingsprocessen. Door synchroon integreren van de neuro-elektrofysiologiemodules maakt het systeem de temporele koppeling van gang- en neurale signalen verder mogelijk, waardoor een methodologisch kader wordt gecreëerd voor het ontleden van centrale-perifere controlemechanismen en het ontwikkelen van neuromodulerende strategieën.

Introduction

In de hedendaagse neurowetenschap en locomotorisch onderzoek is objectieve kwantificatie van gangpaden nu essentieel om neurale-musculaire functies te ontleden, ziektemechanismen te verduidelijken en revalidatiestrategieën te evalueren¹. De hoge ruimtelijke resolutie maakt het mogelijk subtiele variaties in synergieën tussen neurale commando's, spieractivatieprofielen en skeletmechanica vast te leggen, waarmee een empirische basis wordt gelegd voor het onderzoeken van de coördinatie van supraspinale paden, perifere feedback en mechanische contexten. Reproducerbare kinematische metrieken verbeteren de detectiegevoeligheid voor laesies, degeneratieve veranderingen en therapeutische effecten, waardoor de ontwikkeling van geneesmiddelen en apparaten wordt versneld².

Conventionele beoordelingsplatforms zoals CatWalk, DigiGait of vereenvoudigde footprint-analyses leiden indirect gewrichtskinematica af op basis van plantaire contactpatronen. Deze benaderingen leveren laagresolutie- en inconsistente metrieken op die er niet in slagen om de kinematische complexiteit van achterpoot meerdere gewrichten^te vangen ^3,4. Het algemene doel van onze methode is het opzetten van een hoogprecisie, markerloos en gewicht-ondersteund ganganalysesysteem dat specifiek is ontworpen voor knaagdiermodellen. Daarom stellen we een nieuw kader vast dat: (i) knaagdieren in een rechtopstaande houding houdt onder gecontroleerde axiale belasting (0-100% lichaamsgewicht) tijdens continue multi-joint beeldvorming, (ii) direct anatomische herkenningspunten van het sagittale vlak lokaliseert vanuit laterale aanzichtsanalyse via deep learning om 2D-ruimtelijke trajecten te genereren, (iii) tijdsopgeloste gewrichtshoeken en segmentale kinematica exporteert voor statistische modellering⁵. In de kern is dit raamwerk gebaseerd op de toepassing van deep learning op computer vision-taken, wat robuuste gezamenlijke feature-extractie uit videodata mogelijk maakt.

In vergelijking met bestaande systemen biedt dit platform vier belangrijke voordelen. De markerloze werking elimineert reflecterende of geïmplanteerde tags en vermindert de procedurele complexiteit en bewegingsartefacten^{aanzienlijk 6}. Het geïntegreerde force-feedback ophangingssysteem maakt nauwkeurige, gradueerde lichaamsgewichtsondersteuning mogelijk (0-100%), wat een uitgebreide gangbeoordeling over het volledige belasting-tot-ontlastingscontinuüm mogelijk maakt, wat ontbreekt bij commerciële loopbanden⁷. De deep learning-architectuur maakt snelle hertraining mogelijk voor nieuwe stammen, leeftijden of pathologische omstandigheden, en overtreft handmatig volgen in schaalbaarheid⁸. En hoognauwkeurige ruimtelijke coördinaten met meerdere gewrichten maken fijnmazige analyse van kinematica tussen gewrichten mogelijk, gecombineerd met kwantitatieve profilering van afwijkende gangpatronen.

Dit protocol is breed toepasbaar. Het maakt onderzoek mogelijk naar supraspinale controle, proprioceptieve feedbacklussen en spiersynergieën onder gemoduleerde mechanische eisen⁹. Pathofysiologisch levert het gevoelige locomotorische biomarkers voor ruggenmergletsel (SCI), beroerte, neurodegeneratie, perifere neuropathieën en neuromusculaire aandoeningen ^8,10. Therapeutisch ondersteunt het longitudinale evaluatie van farmacologische of apparaatgebaseerde interventies met een verhoogde statistische kracht van hoogresolutiekinematica¹¹. De modulaire architectuur maakt naadloze integratie mogelijk met complementaire platforms, bijvoorbeeld elektromyogram (EMG) of hersensignalen, waardoor mechanistische decodering van neurale correlaten in beweging van de onderbenen mogelijk wordt.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Commissie voor Institutionele Dierenverzorging en -gebruik van het Beijing Institute for Brain Research en voldeden aan de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Er werden geen proceduregerelateerde bijwerkingen waargenomen.

1. Voorbereiding van apparatuur

1. Zet de voeding van het loopbandsysteem aan en selecteer de Speed Control-knop op het touchscreen.
2. Laat de band 30 seconden op lage snelheid draaien om te observeren of de loopbandband afwijkt.
3. Selecteer de Incline Control-knop , zet de helling op 0°, klik op Nul en bevestig dat de weergegeven waarde overeenkomt met de niveaubel.
4. Voer de ophangingsinterface in, hang een gewicht van 10 g op en controleer of de spanningswaarde dicht bij 0,10 N ligt.
5. Zet de Industrial Personal Computer (IPC) aan en voer de video-opname- en analysesoftware in.
6. Maak een directory aan voor het experiment van de dag, met informatie zoals de naam van het experiment, dieridentificatie, experimentele groep, snelheid, helling en percentage gewichtsverlies.
7. Bevestig de snelle industriële camera (UC70, resolutie: 1280X1024, beeldsnelheid: 60 fps), uitgerust met een handmatige scherpstellens (f = 12 mm), op een aluminium profielbeugel. Plaats de cameralens loodrecht op de lengteas van de loopband om een strikt zijwaarts beeld vast te leggen, waarbij je een horizontale werkafstand van 15 cm tot het vlak van de loopband behoudt.
8. Plaats de lens horizontaal met een waterpas en zorg ervoor dat de romp van de rat de centrale 2/3 van het frame inneemt. Pas de scherpstelling en het diafragma aan totdat de schaallijnen op de achterliniaal (1 cm raster) duidelijk zichtbaar zijn.
9. Klik op Voorbeeldweergave om te bevestigen dat er geen achtervolging is en dat de achtergrondhelderheid uniform is. Als het beeld te donker is, gebruik dan een lichtgevende diode (LED) achtergrondverlichting om de helderheid te verhogen; Als het overbelicht is, verlaag dan de gain en verklein het diafragma passend.
10. Klik op Start Recording om de kwaliteit van de gegevensopname te testen. Klik op Stop Recording en stel het opslagpad in. Na het voltooien van bovenstaande apparatuurtests kunt u beginnen met dierproeven.

2. Diervoorbereiding en test

1. Breng de rat samen met de oorspronkelijke kooi naar de experimentele ruimte en laat hem 10 minuten rusten. In deze periode is gratis toegang tot voedsel en water mogelijk.
2. Noteer het lichaamsgewicht met een elektronische weegschaal (nauwkeurig tot 0,1 g). Neem ratten met een gelijk lichaamsgewicht (±10 g) mee om de verwarrende effecten van lichaamsgrootte te minimaliseren.
3. Als de vachtkleur van de achterpoten niet voldoende contrasteert met de achtergrond, gebruik dan een elektrische scheermachine om voorzichtig een 1 cm brede vacht aan de buitenkant van het dijbeen en de achterkant van het onderbeen te verwijderen om de nauwkeurigheid van gewrichtsherkenning te verbeteren.
4. Gebruik vervolgens een zacht lint om de rechte afstand van de heup tot de enkel (mm) te meten, wat dient als basis voor de daaropvolgende normalisatie van de pas.
5. Doe handschoenen aan, pak de rat vast en sla de elastische borstband om de vooroksel, zodat je hem aan de verstelbare schuifrail bevestigt. Zorg ervoor dat de band los genoeg is om één vinger in te steken zonder de ademhaling van het dier te beïnvloeden.
6. Draai langzaam aan de hendel van de ophangarm, terwijl je de spanningswaarde op het scherm observeert, en verhoog deze geleidelijk tot de beoogde gewichtsreductieverhouding. Controleer of de achterpoten van de rat nog volledig contact maken met de grond.
7. Stel de hoogte van de grip bar aan. Maak de bovenste knop los en plaats de voorste gripstang iets onder de neustip van de rat wanneer je rechtop staat, zodat het dier deze gemakkelijk kan vastpakken zonder zijn kop te veel naar achteren te hoeven kantelen of voorover te buigen.
8. Op het touchscreen stel je de snelheid in op 150 mm/s en de helling op 0°. Voer een acclimatisatiesessie van 10 minuten uit om het dier aan te passen aan het specifieke niveau van lichaamsgewichtondersteuning. Houd de rat in de gaten op stresssignalen, zoals bevriezing, ontlasting.
   1. Als de gang onregelmatig blijft (gedefinieerd als [>3 onderbrekingen/min]), verleng dan de duur met stappen van 2 minuten, tot maximaal 20 minuten.
9. De acclimatie wordt als succesvol beschouwd wanneer de rat minstens 60 seconden een aaneengesloten, gelijkmatig tred aanhoudt zonder poot te slepen, en de staart vanzelf hangt zonder stijfheid. Sluit dieren uit die niet aan deze criteria voldoen na de maximale acclimatisatieperiode.
10. Voer de parameters in die nodig zijn voor het formele experiment. Voer achtereenvolgens de gewenste snelheid (elke waarde tussen 0-300 mm/s) en helling (−30° tot +30°) in op het touchscreen, en selecteer de richting van de loopbandriem.
11. Na het starten van de loopband observeer je de loophouding van de rat. Als het afwijkt van het centrale derde gebied, tik dan zachtjes met de knokkel op de rechter zijwand. De meeste dieren corrigeren hun positie vanzelf. Als twee opeenvolgende correcties niet effectief zijn, plaats je de rat opnieuw en neem je de proef opnieuw op.
12. Na stabilisatie klik je op Start Recording en leg continu minstens vijf volledige gangcycli vast.
13. Aan het einde van elke proef wordt de snelheid onmiddellijk verlaagd naar 0, de borstband losgemaakt en de rat teruggebracht naar de bijbehorende kooi.
14. Geef water tijdens de rusttijd, met minstens 3 minuten tussen de proeven.
15. Neem minstens drie proeven op onder dezelfde omstandigheden. Als een dier meer dan zes proeven continu loopt, voeg dan een extra rust van 2 minuten toe om cumulatieve vermoeidheid te voorkomen.
16. Voer vijf dagen achter elkaar voortraining uit vóór het formele experiment: loop dagelijks 10 minuten met 150 mm/s, 0° helling en geen gewichtsverlies, waarbij je de gang observeert.

3. Ganggegevensextractie

1. Eerst extraheer je segmenten met de doelgang, meestal rond 10 seconden, die minstens 10 analyseerbare stabiele gangcycli moeten bevatten.
2. Importeer het .mov-bestand in de analysesoftware en registreer de individuele informatie van de ratten, inclusief ID-nummer, groep en experimentele omstandigheden.
   OPMERKING: Het systeem maakt gebruik van de YOLO-NAS Pose-architectuur, een ultramodern neuraal netwerk dat geoptimaliseerd is voor schatting van hoge prestaties poseën.
   Datasetconstructie: Het model werd getraind op een robuuste dataset van 6.000 videoframes. Deze frames werden handmatig geannoteerd met de coördinaten van vijf belangrijke achterpootgewrichten (iliacale kam, heup, knie, enkel en teen) met behulp van de grafische gebruikersinterface van DeepLabCut om de nauwkeurigheid op de grond te waarborgen.
   Training: Het netwerk onderging transfer learning op een NVIDIA RTX 3080 GPU om de YOLO-NAS Pose gewichten aan te passen aan de specifieke kenmerken van de achterpoot van de ratten.
   Initialisatie: Selecteer in de software het vooraf getrainde 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1'-model en stel de betrouwbaarheidsdrempel in op 0,8 om sleutelpunten met lage zekerheid uit te sluiten.
   Tijdens de analysefase verwerkt het YOLO-NAS Pose-model de videostroom frame voor frame. In tegenstelling tot traditionele computer vision-methoden die vertrouwen op achtergrondaftrekking, lokaliseert deze deep learning-architectuur direct de rat en voorspelt gezamenlijke coördinaten binnen de begrenzingsbox.
   Nabewerking: Het algoritme haalt x- en y-coördinaten uit de kanskaarten. Om hogefrequente jitter te beperken, wordt een mediaanfilter (venstergrootte: 3 frames) toegepast op de ruwe trajecten.
   Output: Het systeem vergrendelt succesvol op de vijf doelgewrichten binnen het videoframe, waardoor tijdsopgeloste ruimtelijke coördinaten worden gegenereerd voor de gehele gangvolgorde. Deze gegevens worden automatisch geëxporteerd als .csv bestanden voor kinematische berekeningen. Met behulp van de backboardliniaal (1 cm raster) die gelijktijdig wordt vastgelegd, stelt het systeem een conversierelatie op, berekent automatisch de schaalfactor en zet de pixelcoördinaten batch-om in millimeters.
3. Exporteer de ruimtelijke positiecoördinaten van elke verbinding in de loop van de tijd als een .csv bestand voor de volgende indexberekening.
   OPMERKING: De software berekent automatisch de paslengte, stapfrequentie en voethoogte, en exporteert de veranderingen in ruimtelijke positie en hoeken van de vijf ondergewrichten in de loop van de tijd. Op basis van de teenhoogte verdeelt de software elke stap automatisch in swingfase en standfase, en berekent het de verhouding tussen swingfase en standfase binnen elke gangcyclus.

4. Intergroep-kinematische vergelijkingen

1. Normaliseer elke loopcyclus binnen de groep van 0% (voetcontact) tot 100% (weer hetzelfde voetcontact) om de verschillende cycluslengtes te verenigen, wat groepsgemiddelde en vergelijking vergemakkelijkt. De soorten afbeeldingen die kunnen worden gegenereerd om loopdynamiek te illustreren, worden verstrekt in Supplementair Bestand 1.

5. Statistische analyse

1. Voer alle statistische analyses uit met behulp van de GraphPad Prism-software.
2. Controleer de normaliteit van de gegevensverdeling met behulp van de Shapiro-Wilk-test.
3. Voor de vergelijkingen van kinematische validatie en de body mass index (BMI) demonstraties, presenteer de gegevens als gemiddelde ± SEM.
4. Evalueer verschillen tussen de twee experimentele voorwaarden met behulp van een ongepaarde Student's t-test.
5. Definieer statistische significantiedrempels als *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,005. Let op dat in totaal n = 3 ratten werden opgenomen in deze pilotvalidatiestudie.

6. Inbedding van de elektrofysiologische module

1. Na voltooiing van de diermodellering implanteer je het elektrofysiologische opnameapparaat.
2. Voor neurale opnames plaats je elektroden op het schedeloppervlak, de epidurale ruimte of de hersenschors om hersensignalen op te nemen.
3. Voor het opnemen van het ruggenmerg breng je opname-elektroden in de epidurale ruimte van het tussenwervelforamen.
4. Voor EMG-opname begraaf je bipolaire zilveren draden in spieren om de elektrische activiteit van de spieren vast te leggen.
5. Laat het dier na de implantatie 5-7 dagen herstellen, waarbij je dagelijks de wond en gang controleert om geen tekenen van infectie of pijn te hebben voordat je doorgaat met het loopbandexperiment.
6. Maak de apparatuur en de voorbereidingen van de dieren af zoals hierboven beschreven.
7. Synchroniseer de verzameling van elektrofysiologische parameters en bewegingsvideo's, zodat de elektrofysiologische en videodata dezelfde tijdstempel hebben.
8. Na gegevensverzameling wordt de neurale signalen tijdens de analyse uitgelijnd met videoframes om intuïtief de elektrofysiologische patronen in verschillende fasen van de loopcyclus te observeren, wat direct bewijs levert voor het verkennen van het centrale-perifere koppelingsmechanisme.

Results

Het schematische diagram en de daadwerkelijke foto van de structuur van het loopbandsysteem zijn respectievelijk te zien in Figuur 1A,B. Het apparaat is in staat om hoogcontrast laterale beelden te verkrijgen zonder markers. De loopband ondersteunt aanpassingen voor snelheid, helling, richting en gewichtsvermindering, en is uitgerust met een numeriek bedieningspaneel. De bijbehorende software-interface bevat een realtime monitoring- en acqui...

Discussion

Dit protocol definieert een loopanalysesysteem op loopband voor ratten en de bijbehorende operationele procedures, en biedt een multidimensionaal en objectief beoordelingsinstrument voor neuromusculair gedragsonderzoek. Zoals aangetoond in de intergroepvergelijkingen van gangparameters tussen SCI en gezonde ratten binnen de voorbeeldstudie, verkrijgt het systeem ruwe ruimtelijke bewegingscoördinaten van de onderbenen van proefpersonen via continue hoge framerate gangvideografie en een AI...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gait AI Annotation & Acquisition Software	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI is de geïntegreerde analyse software voor de MOVEMETRICS loopband, die video-opname, metadata logging en geautomatiseerde ganganalyse in één workflow verenigt.
Mechanical impact	RWD Life Science, Shenzhen, China
Multi-kanaals elektrofysiologisch opnamesysteem	Kedou (suzhou) brain-computer Technology Co.,	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A is een compact, 128-kanaals in vivo elektrofysiologie-opnamesysteem ontworpen voor hoge resolutie neurale opname bij kleine tot grote laboratoriumdieren. Door het integreren van lichtgewicht, plug-and-play headstages (≤ 1,3 g), 16-bit A/D conversie en programmeerbare versterkers, vangt het EEG, ECoG, LFP, spikes, EMG en ECG signalen van 0,1 Hz tot 30 kHz met ≤ 2,4 µV systeemruis en > 10 GΩ ingangsimpedantie. RHD128A levert robuuste, gebruikersschaalbare neurale gegevens om onderzoeken naar hersen-machine interfaces, neurodegeneratie en revalidatie te versnellen.
Loopband	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMETRICS	MOVEMETRICS is een hoogprecisie instrumentele loopband voor geavanceerde knaagdierganganalyse.