Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Deze studie identificeert een 10-lncRNA oxidatieve stress-gerelateerde signatuur in longplaveiselcelcarcinoom (LUSC) met behulp van gegevens uit The Cancer Genome Atlas. Hoewel validatie beperkte klinische voorspellende prestaties toonde, ondersteunden de kenmerkende gedifferentieerde patronen van de immuunmicro-omgeving en in vitro-assays LINC01615 als een kandidaat gerelateerd aan migratie-invasies voor verder mechanistisch onderzoek.
Langketen niet-coderend RNA (lncRNA) heeft een significante invloed op de prognostische waarde en immuuninfiltratie van longplaveiselcelcarcinoom (LUSC). Deze studie was bedoeld om aan te tonen hoe oxidatieve stressgerelateerde lncRNA's invloed hebben op longplaveiselcelcarcinoom (SCC). De Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset verzamelde transcriptominformatie en gerelateerde klinische gegevens voor LUSC. Om een prognostisch model te bouwen, werden 10 prognostisch gerelateerde genen geïdentificeerd met behulp van een reeks bio-informatische analyses die de abnormale expressie van het OS-gen in tumoren en gezonde weefsels vergeleken, evenals de associatie met kwaadaardigheid. Proefpersonen werden gestratificeerd in hoog- en laagrisicogroepen op basis van de mediane risicoscore afkomstig van de 10-genhandtekening. Hoewel het wiskundige risicomodel beperkte onafhankelijke voorspellende prestaties toonde in de validatiecohort (AUC ~ 0,5), toonden functionele en immunologische evaluaties significante verschillen in de tumormicroomgeving (TME) tussen risicostrata. Specifiek vertoonden hoogrisicopatiënten verschillende immuuninfiltratieprofielen en aangepaste immunologische scores ten opzichte van hun laagrisico-tegenhangers. Daarom biedt deze oxidatieve, stressgerelateerde lncRNA-signatuur, in plaats van als direct klinisch voorspellingsinstrument te dienen, waardevolle biologische inzichten in het immuunlandschap van LUSC en benadrukt potentiële therapeutische doelen voor verder mechanistisch onderzoek.
Longkanker vertoont de hoogste wereldwijde incidentie en mortaliteit onder maligniteiten1. Binnen de niet-kleincellige longkanker (NSCLC) histologische varianten is longplaveiselcelcarcinoom (LUSC) een overheersend subtype, dat vaak correleert met ongunstige klinische uitkomsten en een gebrek aan zeer effectieve gerichte behandelingen in vergelijking met longadenocarcinoom2. Hoewel primaire therapeutische benaderingen chirurgische ingrepen, radiotherapie en chemotherapie omvatten, vertonen patiënten met gevorderde LUSC vaak therapeutische resistentie3. Daarom is er een dringende behoefte om robuuste moleculaire biomarkers te identificeren om de prognostische stratificatie te verbeteren en verkennende therapeutische strategieën voor LUSC4 te sturen.
Oxidatieve stress, gekenmerkt door de pathologische ophoping van reactieve zuurstofsoorten (ROS), speelt een cruciale rol bij tumorinitiatie, groei en metastase. Bij gebrek aan efficiënte ROS-clearancemechanismen veroorzaken verhoogde ROS-niveaus DNA-schade en genotoxiciteit, wat uiteindelijk resulteert in diverse genomische veranderingen die bijdragen aan de ontwikkeling van kanker. Opmerkelijk is dat studies consequent een verhoging van ROS-niveaus en oxidatieve stress hebben aangetoond specifiek binnen de pathogenese van longkanker 5,6. Recent onderzoek heeft verder aangetoond dat clusters van genen die gekoppeld zijn aan oxidatieve stress mogelijk functioneren als prospectieve prognostische biomarkers bij pulmonale maligniteiten7. Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn uitgegroeid tot cruciale regulatoren van genexpressie en vormen veelbelovende prognostische biomarkers bij verschillende maligniteiten. Hoewel een eerdere opmerkelijke studie7 met succes een oxidatief, stressgerelateerd lncRNA-prognostisch model voor longadenocarcinoom (LUAD) heeft vastgesteld, blijven het specifieke prognostische landschap en de immuunimplicaties van dergelijke lncRNA's in LUSC grotendeels ononderzocht.
In dit onderzoek analyseerden de auteurs systematisch TCGA-datasets om een nieuwe oxidatieve, stressgerelateerde lncRNA-handtekening te construeren, specifiek afgestemd op LUSC. Bovendien bevat deze studie, in tegenstelling tot puur bio-informatische analyses, in vitro experimentele validatie om de biologische functionele rol van belangrijke geïdentificeerde lncRNA's (bijv. Linc01615) te bevestigen. In plaats van directe klinische toepasbaarheid voor diagnostische en behandelbeslissingen te claimen, probeert dit onderzoek vooral de mogelijke mechanismen van oxidatieve stress in LUSC en de correlatie ervan met de tumor-immuunmicro-omgeving te onderzoeken. Deze bevindingen zijn bedoeld om waardevolle biologische inzichten te bieden en potentiële therapeutische doelen voor toekomstige mechanistische onderzoeken te belichten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Gegevensverzameling en voorverwerking
Alle gegevens die in deze studie zijn geanalyseerd, zijn verkregen uit de openbaar toegankelijke TCGA-database die in de Materiaaltabel is vermeld. Deze studie hield zich strikt aan het National Institutes of Health (NIH) Genomic Data Sharing Policy en de publicatierichtlijnen van TCGA. Omdat de datasets bestaan uit gedeïdentificeerde, publiek beschikbare klinische en multi-omics gegevens, was deze studie vrijgesteld van verdere goedkeuring door de Institutional Review Board (IRB). Transcriptomgegevens en bijbehorende klinische informatie voor LUSC werden gedownload uit de Cancer Genome Atlas (TCGA) database. Aanvankelijk bestond de cohort uit 551 monsters (502 tumoren en 49 normal). Om de robuustheid van dit prognostische model te waarborgen, werden patiënten zonder volledige algehele overlevingsdata (OS), overlevingsstatus of essentiële klinische kenmerken uitgesloten van de downstream survivalanalyse. Na dit strikte filterproces werd een laatste analytische cohort van 470 LUSC-patiënten opgericht. Deze 470 patiënten werden vervolgens willekeurig verdeeld in een trainingsset (n = 235) en een testset (n = 235) voor de opbouw en validatie van risicomodellen. In totaal werden 792 genen gerelateerd aan oxidatieve stress verzameld via de GeneCards-database, vermeld in de Table of Materials, waarbij een inclusiecriterium van een relevantiescore ≥ 7 werd gebruikt. Het limma-pakket (versie 3.66.0) werd gebruikt om te screenen op differentieel tot expressie gebrachte oxidatieve stressgenen. Vulkaanplots werden gemaakt met het ggplot2-pakket (versie 4.0.2). Tussen de trainingsgroep en de testgroep was er geen noemenswaardige variatie in klinische kenmerken (p > 0,05). De trainingsset werd gebruikt voor modelbouw, en de testset werd gebruikt voor interne validatie.
Constructie en verificatie van het risicomodel
Om lncRNA's te identificeren die geassocieerd zijn met oxidatieve stress, werd een Pearson co-expressieanalyse uitgevoerd. De auteurs evalueerden de correlatie tussen de expressieprofielen van de geïdentificeerde differentieel tot expressie gebrachte oxidatieve stressgerelateerde genen en alle geannoteerde lncRNA's binnen de TCGA-LUSC-dataset. De correlatiecriteria voor het selecteren van co-expressieve lncRNA's werden vastgesteld op een correlatiecoëfficiënt |R| > 0,4 en een p-waarde < 0,001. Op basis van deze drempels werden in totaal 6.088 kandidaat-oxidatieve stressgerelateerde lncRNA's afgeleid en geëxtraheerd. Vervolgens werden deze 6.088 kandidaat-lncRNA's geëvalueerd via LASSO-regressie en complementaire analytische benaderingen om het prognostisch risicomodel te construeren. Met behulp van de verwerkte gegevens werden patiëntendeelnemers gecategoriseerd in hoog- en laagrisicostrata.
Onafhankelijke factoren en ROC-curves
Univariate en multivariate Cox-regressiemodellen werden gebruikt om onafhankelijke prognostische variabelen te identificeren. Specifiek, om het familiegewijze foutpercentage tijdens de meervoudige univariate Cox-regressieanalyses (n = 236 tests) te beheersen, werd de Bonferroni-correctie toegepast, waarbij de streng aangepaste significantiedrempel werd vastgesteld op p < 0,00021 (berekend als 0,05 / 236).
Overlevingsanalyse en hoofdcomponentenanalyse
Het survivalpakket (versie 3.8-6) werd gebruikt om de algehele overlevingspercentages (OS) te berekenen, en principal component analysis (PCA) werd gebruikt om de robuustheid van het risicomodel te beoordelen.
Nomogram
De fit-index werd geëvalueerd met behulp van het rms-pakket in R om de betrouwbaarheid van het nomogram te beoordelen. Tumor mutatielast (TMB) werd geëvalueerd en visualiseerd met het maftools-pakket (versie 2.22.0). Algoritmen, waaronder ssGSEA, werden gebruikt om immuuninfiltratie te detecteren. Daarnaast werd het ggpubr-pakket (versie 0.6.3) gebruikt om immuuncontrolepunten tussen risicogroepen te vergelijken. Het ESTIMATE-algoritme werd gebruikt om het tumormicro-milieu (TME) te karakteriseren.
Functionaalanalyse
Het clusterProfiler-pakket (versie 4.14.6) in R werd gebruikt voor verrijkingsanalyse. Om functionele paden verder te onderzoeken, werd GSEA-analyse uitgevoerd. Met behulp van Cytoscape werd een co-expressienetwerk gecreëerd voor observatie.
Experimentele methoden
Cellenkweekcondities en groepering
De NCI-H520 cellijn van menselijke longplaveiselcelcarcinoom (RRID: CVCL_1566; vermeld in de Materiaaltabel) werd gekweekt in RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% (v/v) foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine. Logfasecellen werden gezaaid in 6-put kweekplaten. Na succesvolle naleving werden de cellen willekeurig verdeeld over drie verschillende experimentele groepen: een blanke controlegroep die onder standaard kweekomstandigheden werd onderhouden, een negatieve controlegroep (si-NC) getransfecteerd met niet-doelgericht siRNA, en een experimentele knockdowngroep (si-LINC01615) getransfecteerd met LINC01615-specifiek siRNA.
Celtransfectie
De si-LINC01615 en si-NC reagentia werden ontdooid op ijs. Voor de transfectiecomplexpreparaat werd 95 μL serumvrij RPMI-1640 medium gepipetteerd in steriele centrifugebuizen, gevolgd door de sequentiële toevoeging van 3 μg van het respectievelijke siRNA en 5 μL van het Lipo3000 transfectiereagentia. Dezelfde procedure werd toegepast voor zowel de siLINC01615 - als siNC-groepen. De oplossingen werden voorzichtig gemengd en 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd om complexvorming te vergemakkelijken, wat resulteerde in een totaal volume van ongeveer 200 μL per buis. Vervolgens werd dit mengsel gelijkmatig verdeeld in de aangewezen kweekputten met 800 μL RPMI-1640 basaal medium. Na een incubatieperiode van 6 uur bij 37 °C werd het transfectiemedium zorgvuldig geaspireerd en vervangen door een vers volledig kweekmedium.
Wondgenezing (scratch) assay
Voor de wondgenezingstest werden logaritmisch groeiende NCI-H520-cellen (RRID: CVCL_1566) in 6-put kweekplaten geplaatst met een dichtheid van 5,6 × 10 5-cellen per put. Bij het bereiken van 95–100% confluentie werd kunstmatig een lineaire wond gecreëerd door de celmonolaag verticaal over het midden van de put te krassen met een steriele pipettip van 200 μL. De putten werden vervolgens drie keer gewassen met PBS om losgekomen cellen en cellulair afval te verwijderen, en vervolgens geïncubeerd in serumvrij RPMI-1640 medium. Beelden van identieke gewonde gebieden werden gemaakt op 0, 24 en 48 uur met behulp van een omgekeerde microscoop. Het wondgenezingsgebied werd gekwantificeerd door de afstand te meten met ImageJ (RRID: SCR_003070; vermeld in de Materiaaltabel), en de migratiesnelheid werd berekend ten opzichte van het initiële wondoppervlak op 0 uur.
Transwell-migratie en invasie-assays
Cellulaire migratie- en invasiecapaciteiten werden geëvalueerd met behulp van 24-put Transwell-kamers uitgerust met polycarbonaatmembraaninserts van 8,0 μm poriegrootte zoals vermeld in de Table of Materials. Voor de invasietest werden de apicale kamers vooraf bedekt met 50 μL Matrigel (verdund 1:8 in serumvrij medium; vermeld in de Materiaaltabel) en 2 uur geïncubeerd bij 37 °C om te polymeriseren, terwijl de migratietest gebruikmaakte van ongecoate inzetstukken. Na celtransfectie en een serum-uithongeringsperiode van 24 uur werden NCI-H520-cellen geoogst, opnieuw opgehangen in serumvrij RPMI-1640-medium en in de apicale kamers gezaaid met een dichtheid van 1,8 × 105-cellen per put in 200 μL. De basale kamers werden gevuld met 600 μL RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% FBS als chemoattractant. Na een incubatie van 48 uur bij 37 °C met 5% CO₂ werden de inserts verwijderd en drie keer gewassen met PBS. Cellen die op het apicale oppervlak van het membraan achterbleven werden voorzichtig weggeveegd met een natte wattenstaafje. De cellen die het basolaterale oppervlak waren gemigreerd of binnengedrongen, werden 20 minuten vastgezet met 4% paraformaldehyde en 30 minuten bij kamertemperatuur gekleurd met Giemsa-oplossing zoals vermeld in de Table of Materials . De gemigrerde en geïnvaderde cellen werden gevisualiseerd en opgesomd over drie willekeurig geselecteerde optische velden per insert met een omgekeerde microscoop met 40x vergroting.
Statistische analyse
Alle statistische analyses en datavisualisaties werden uitgevoerd met R-software (versie 4.1.2; RRID: SCR_001905; vermeld in de Materiaallijst). De specifieke versienummers voor alle R-pakketten die in deze studie zijn gebruikt, zijn expliciet gedetailleerd in hun respectievelijke methodologische subsecties. Een significante waarde werd conventioneel gedefinieerd als p < 0,05, tenzij anders vermeld. Waar meerdere vergelijkingen werden uitgevoerd (bijvoorbeeld de meervoudige univariate Cox-regressies), werd de Bonferroni-methode streng toegepast om het familiegewijze foutpercentage (FWER) te handhaven, waarbij de exacte aangepaste drempel (bijv. p < 0,00021) werd beschreven in de betreffende methodologische subsectie. Kwantitatieve in vitro gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en geanalyseerd met behulp van Student's t-test of eenrichtings-ANOVA indien passend.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Identificatie van differentieel tot expressie gebrachte genen voor oxidatieve stress
De workflow is weergegeven in Figuur 1. De klinische kenmerken van de uiteindelijke analytische cohort, bestaande uit 470 LUSC-patiënten, zijn beschreven in Tabel 1. Op basis van de gedefinieerde drempel van een relevantiescore ≥ 7 haalden de auteurs in totaal 792 genen gerelateerd aan oxidatieve stress uit de Gen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Longplaveiselcelcarcinoom (LUSC) is een overheersend en zeer agressief histologisch subtype van niet-kleincellige longkanker, vaak gekenmerkt door slechte overlevingskansen en weerstand tegen conventionele therapeutische modaliteiten 8,9. Opkomend bewijs wijst op oxidatieve stress als een cruciale factor in de pathogenese en progressie van verschillende maligniteiten. De pathologische ophoping van reactieve zuurstofsoorten (ROS) ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. Er werden geen kunstmatige intelligentie (AI)-tools of AI-ondersteunde technologieën gebruikt tijdens de manuscriptvoorbereiding; Alle wetenschappelijke inhoud, analyses, ruwe data en conclusies zijn onafhankelijk gegenereerd, beoordeeld en goedgekeurd door de auteurs.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Subsidie nr. 8200430). Wij danken de bijdragers en betrokken instellingen, waaronder de Hunan University of Traditional Chinese Medicine en het Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, van harte voor hun middelen en ondersteuning. We spreken ook onze dank uit aan alle onderzoekers en deelnemers die aan deze studie hebben bijgedragen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | Gebruikt voor het fixeren van cellen |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Gebruikt voor het maken van co-expressienetwerken |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Eindconcentratie 10% (v/v) |
| GeneCards database | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | Screening van genen gerelateerd aan oxidatieve stress |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | Gebruikt voor het kleuren van gemigreerde/invasieve cellen |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Gebruikt voor kwantificering van wondopeningen |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | Gebruikt voor siRNA-transfectie |
| Matrigel | Corning | 356234 | Verdund 1:8 in serumvrij medium |
| NCI-H520 humane longkwaadaardige gezwellen | ATCC | HTB-182 | Gebruikt voor in vitro validatie-assays |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | Gebruikt voor celwassing |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | Antibioticumsupplement voor celcultuur |
| R software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Statistische analyse en visualisatie |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | Celcultuurmedium |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Bron voor transcriptoom & klinische gegevens |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | Gebruikt voor migratie- en invasie-assays |