Methodenartikel

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

DOI:

10.3791/69814

⸱

17 april 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser capture microdissectie (LCM) biedt ruimtelijke toegang tot specifieke celpopulaties binnen complexe weefsels via in situ visualisatie en isolatie. Om transcriptomische analyse van histologisch gedefinieerde gebieden in gefixeerd weefsel mogelijk te maken, wordt een gedetailleerd LCM-protocol gepresenteerd voor RNA-extractie uit paraformaldehyde (PFA)-gefixeerde, Optimal Cutting Temperature (OCT) compound-ingebedde muizenleversecties. Het protocol beschrijft de identificatie en het verzamelen van microschaalmonsters (ongeveer 1.000 cellen) via een workflow die weefselfixatie, sucrosedehydratie, OCT-inbedding, cryosectie, hematoxyline-kleuring en laser-opname van gerichte histologische gebieden omvat. Met deze methode werd een hoogzuiver RNA (A260/A280: 1,9-2,1) verkregen. Het RNA-integriteitsgetal (RIN) was 6,7 ± 0,9, wat de verwachte fragmentatie weerspiegelt die gepaard gaat met PFA-fixatie. Echter, kwantitatieve PCR voor β-actine leverde CT-waarden van 17-19 op, en RNA-sequencing uitgevoerd met fragmentatie-geoptimaliseerde bibliotheekvoorbereiding leverde hoogwaardige reads op, waarbij >90% van de basen de Q20- en Q30-drempels bereikte, wat bevestigde dat het RNA geschikt is voor gevoelige downstream-analyses. Daarom maakt dit protocol ruimtelijk opgeloste, gerichte genexpressie-analyse mogelijk door RNA van gedefinieerde zuiverheid en integriteit te leveren uit specifieke histologische gebieden van PFA-gefixeerd leverweefsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauwkeurige acquisitie van ruimtelijk opgeloste genexpressieprofielen is cruciaal voor het begrijpen van weefselheterogeniteit in gezondheid en ziekte. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) biedt een hoge cellulaire resolutie 1,2, maar verliest de oorspronkelijke ruimtelijke context en kan transcriptieprofielen veranderen tijdens weefseldissociatie 3,4. Voor celtypen zonder publiek geïdentificeerde specifieke markers blijft het verkrijgen van zuivere populaties met behulp van immunofluorescentie-gebaseerde sortering of immunomagnetische isolatie moeilijk 5,6. Ruimtelijke transcriptomicatechnologieën zoals Visium en GeoMx maken het mogelijk om in situ te vangen van high-throughput genexpressiegegevens, maar hun ruimtelijke resolutie is beperkt op het single-cel- of subcellulaire niveau 7,8. Omgekeerd kan beeldvormingsgebaseerde ruimtelijke transcriptomiek een resolutie op nanometerniveau bereiken, maar heeft een beperkte gendetectiedoorvoersnelheidvan 9. Dit benadrukt een aanhoudende kloof in hypothese-gedreven analyse van specifieke morfologische regio's.

Laser capture microdissectie (LCM) maakt microscoopgeleide selectie en isolatie van specifieke cellen uit weefselsecties of levende celculturen mogelijk op basis van waarneembaar fenotype. Deze benadering behoudt de celstructuur en ruimtelijke informatie10. Deze techniek is uitgebreid toegepast in leverziekteonderzoek voor downstream analyses. Zo is LCM gebruikt om galiaire epitheelcellen uit leverbiopten te verzamelen om hun immunoregulerende rol bij primaire galiaire cholangitis11 te verduidelijken. Daarnaast is het gebruikt om γ-glutamyltransferase (GGT)-positief weefsel uit experimentele modellen te isoleren om site-specifieke Ggt1-genexpressie 12 te bevestigen. Maar deze studies hebben zich vooral gericht op vers, ingevroren weefsels, die vaak geen klinische annotaties of langdurige follow-uphebben 13. Daarentegen bieden chemisch gefixeerde weefsels voordelen voor histopathologische diagnose14. Hoewel LCM-gebaseerde RNA-sequencing (RNA-Seq) met succes is toegepast op gearchiveerde, grootschalige formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde (FFPE) levermonsters15. Echter, er ontbreekt een robuust LCM-gebaseerd genexpressieprofielprotocol specifiek voor microschaalmonsters van paraformaldehyde (PFA)-gefixeerde en Optimal Cutting Temperature (OCT) compound-embedded leverweefsels.

Om aan deze onvervulde behoefte te voldoen, werd een uitgebreid protocol geoptimaliseerd met PFA-gefixeerde, OCT-ingebedde cryosecties. Dit protocol pakt de beperkingen van FFPE-workflows aan (bijv. langdurige verwerking en agressieve chemicaliën) voor gevoelige LCM-RNA-toepassingen16. Daarentegen is het fixatie- en inbeddingproces voor PFA-gefixeerde, OCT-ingebedde monsters relatief eenvoudiger en flexibeler, waardoor snelle voorbereiding van hoogwaardige secties mogelijk is die zowel de integriteit van RNA als de weefselmorfologie behouden. Bovendien wordt dit protocol uitgevoerd met een ultraviolet (UV) laser-gebaseerd LCM-systeem. In vergelijking met infraroodsystemen biedt UV-LCM een fijnere snijresolutie en maakt het directe, contactloze monsterafname mogelijk, waardoor besmetting wordt geminimaliseerd en geschikt is voor de precieze isolatie van microschaalgebieden uit complexe weefselarchitecturen17,18. Daarom ligt de operationele waarde van dit protocol in het vermogen om morfologiebehoudende opname van microschaalgebieden (~1.000 cellen) uit PFA-gefixeerde leversecties uit te voeren. Het levert RNA op dat geschikt is voor gerichte genexpressieanalyse, waardoor directe correlatie mogelijk is tussen histopathologische kenmerken en lokale transcriptomische profielen.

Hier beschrijven we een protocol voor lasercapture-microdissectie van microschaalweefsel (~1.000 cellen) uit PFA-gefixeerde, OCT-ingebedde muizenleversecties, gevolgd door RNA-extractie en downstream analyse met kwantitatieve reverse transcription PCR en RNA-sequencing. Deze procedures kunnen binnen vijf dagen worden afgerond.

Om lezers te begeleiden bij het beoordelen van de toepasbaarheid van dit protocol, worden hieronder de belangrijkste reikwijdte en beperkingen samengevat. Dit protocol is specifiek geoptimaliseerd voor hypothese-gestuurde, morfologiegeleide bemonstering van specifieke histologische regio's uit PFA-gefixeerde, OCT-ingebedde weefsels, met als primaire toepassing in muizenlever. Het is geschikt voor onderzoekers die ruimtelijk opgeloste transcriptomische gegevens moeten correleren met precieze histopathologische kenmerken die bewaard zijn gebleven in gefixeerde exemplaren. De workflow is vooral waardevol bij het werken met gearchiveerde of klinisch geannoteerde vaste weefsels waarbij versbevroren monsters niet beschikbaar zijn. Dit protocol is echter niet ideaal voor studies die hoog-integriteit, niet-gefragmenteerd RNA vereisen (bijv. RNA-integriteitsgetal (RIN) > 8), omdat de inherente fragmentatie door chemische fixatie het gebruik ervan beperkt in toepassingen die afhankelijk zijn van volledige transcripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures voor het omgaan en de verzorging van dieren werden uitgevoerd volgens ethische richtlijnen en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Southern Medical University. De beschreven methode gebruikte volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen en werd gehandhaafd op een vetrijk, suikerrijk, choline-deficiënt dieet om metabolisch-geassocieerde steatohepatitis (MASH) te modelleren. Voordat leverweefsel werd geoogst, werden de dieren geëuthanaseerd door onthoofding.

1. Voorbereiding van PFA-gefixeerd monster

  1. Bevestig verse leverweefselmonsters (individuele lobben, 5 mm dik of minder) in 30 mL koude 4% PFA (vers bereid) bij 4 °C gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen de lever te perfuseren met fosfaatgevulde zoutoplossing (PBS, 1×, doorgaans bestaande uit 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ en 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) oplossing bij concentratie 1× gedurende 5 minuten, gevolgd door perfusiefixatie met 4% PFA gedurende 5 minuten. Als alternatief kan het weefsel ook worden vastgezet in 10% formalineoplossing.
    VOORZICHTIG: PFA-fixatief is giftig. Al het PFA-afval moet worden verzameld in een aangewezen, correct gelabelde container voor chemisch afval, in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.
  2. Was de gefixeerde weefselmonsters 3× keer gedurende 5 minuten met RNase-vrije 1× PBS-oplossing.
  3. Plaats het gefixeerde leverweefsel in een buisje van 50 ml gevuld met 50 ml 30% sucrose (vers bereid in steriel 1× PBS). Houd de monsters 10-12 uur op 4 °C.
  4. Verwijder de weefselmonsters uit de sucroseoplossing. Knip de monsters om gemakkelijk te hanteren blokken te verkrijgen (ongeveer 5 mm × 3 mm × 5 mm), en voeg de monsters vervolgens in een cryomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) met OCT-verbinding.
    OPMERKING: Pas de weefselrichting aan met een tang indien nodig.
  5. Voeg de OCT-verbinding erbovenop toe om de weefselmonsters volledig te bedekken, en plaats vervolgens onmiddellijk het OCT-ingebedde weefselblok op vloeibare stikstof of droogijs om de OCT-verbinding snel in te vriezen en een solide blok te vormen. Dit snelle bevriezen is essentieel voor het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties.
    VOORZICHTIG: Draag cryogen-bestendige handschoenen om handen te beschermen bij het hanteren van cryogene materialen.
  6. Plaats de OCT-ingebedde blokken op -80 °C tot cryosectie.

2. Cryosectie voor laservangstmicrodissectie

  1. Blootstel de membraan van de polyethyleen-naftaat (PEN) 30 minuten aan UV-licht, bedek de glaasjes vervolgens met 0,1 mg/mL poly-L-lysine, gevolgd door luchtdrogen. Daarna sluit je de randen van de PEN-membraanschuif af met een neutrale montagemedium.
    OPMERKING: UV-bestraling en poly-L-lysinebehandeling van PEN-membraanglaasjes kunnen de hechting van weefselmonsters aan de PEN-membraanglaasjes verbeteren. Het afdichten van de omtrek met een neutraal montagemedium voorkomt waterinfiltratie of bellenvorming onder het membraan, wat cruciaal is voor het behouden van de LCM-efficiëntie.
    VOORZICHTIG: Bescherm de huid en ogen tegen UV-licht. Draag een UV-blokkerende veiligheidsbril of een gezichtsscherm (geschikt voor UV-bescherming), evenals een labjas, nitrilhandschoenen en lange mouwen om de blootgestelde huid te bedekken.
  2. Veeg alle toegankelijke oppervlakken van de cryostaat en alle gereedschappen af met een RNase-decontaminatiemiddel en maak de borstel schoon met 75% ethanol.
    VOORZICHTIG: Verwijder gebruikte ethanoldoekjes en -oplossingen volgens lokale institutionele milieuprotocollen voor gezondheid en veiligheid.
  3. Laat het instrument bereiken en stabiliseren bij −20 °C.
  4. Haal de levermonsters van -80 °C en plaats ze minimaal 15 minuten in de cryostaat.
  5. Breng een dunne laag (2-3 mm) OCT-verbinding aan op het oppervlak van het monsterstadium. Plaats het monsterstadium op een snel vriesplank (of in de cryostatkamer) om de OCT-laag vooraf te verharden.
  6. Breng een kleine hoeveelheid OCT aan op de voorgestolde OCT-laag in de monsterfase. Haal het evenwichtige weefselblok (uit stap 2.4) en plaats het blok onmiddellijk horizontaal op deze OCT, houd het 10-15 seconden op zijn plaats om gedeeltelijke bevriezing en adhesie mogelijk te maken. Zodra het is vastgezet, monteer je het monsterstadium (met het bevestigde weefselblok) op de kop van het cryostatmonster.
  7. Breng het lemmet voorzichtig tussen de klemplaten en de achterplaten aan één kant van de cryostaat en klem vervolgens de klemhendel vast.
  8. Stel de dikte-instelling van de cryostaat in op 10 μm.
    OPMERKING: Pas de sneedikte aan zoals nodig voor het weefsel, maar houd de dikte tussen 5-15 μm19.
  9. Snijd de secties en monteer ze direct op de voorbehandelde PEN-membraandia's in de cryostatkamer, gehandhaafd op -20 °C.
    OPMERKING: Elke PEN-membraandiabaan kan 6-8 weefselsecties bevatten. Het wordt aanbevolen dat het gehele snijproces binnen 1 uur wordt afgerond. Het beperken van de doorsnedingstijd minimaliseert de blootstelling van weefsel aan omgevingsomstandigheden, waardoor de risico's op RNA-afbraak, weefseldehydratie en morfologische artefacten worden verminderd, die cruciaal zijn voor het behouden van RNA-kwaliteit en histologische integriteit voor LCM en downstream-analyse.

3. Hematoxyline-kleuring voor lasercapture-microdissectie

  1. Ontdooi de slides 20 minuten op kamertemperatuur (RT) voor gebruik.
  2. Was de dia's met RNase-vrije 1× PBS (3 keer, 10 s. per stuk).
  3. Dompel de weefselglaasjes 5-10 seconden onder in gefilterde Mayer's hematoxylineoplossing (bestaande uit 1,0 g/L hematoxyline, 0,2 g/L natriumiodat, 50 g/L aluminiumammoniumsulfaatdodecahydraat, 50 g/L chloralhydraat en 1,0 g/L citroenzuur) gedurende 5-10 seconden.
    OPMERKING: Haal de hematoxyline-werkoplossing door een 0,22 μm spuitfiltermembraan voordat je kleurt.
  4. Was de glaasapjes met RNase-vrij water (3 keer, 10 seconden per stuk) om de resterende hematoxyline-oplossing te verwijderen.
  5. Beoordeel de kleur onder een microscoop.
    OPMERKING: Optimaal gekleurde kernen moeten helder blauw-paars zijn tegen een heldere achtergrond. Onvoldoende kleuring levert vage kernen op, terwijl overkleuring cellulaire details verbergt. Alleen preparaten die aan deze optimale kleuringscriteria voldoen, mogen doorgaan naar de volgende stap.
  6. Dep de glaasjes droog met absorberend papier en laat ze daarna volledig aan de lucht drogen (10-15 minuten).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de glaasjes volledig gedroogd zijn voordat je doorgaat met LCM. Plaats vervolgens de slides in de 50 mL centrifugebuizen en bewaar ze tijdelijk op ijs totdat LCM is uitgevoerd.

4. Laservangstmicrodissectie

OPMERKING: De duur van het LCM-experiment voor elke dia moet tussen de 30 minuten en 1 uur worden gehouden. Het wordt aanbevolen dat het gehele LCM-experiment binnen 4 uur wordt afgerond. Deze limiet is ingesteld om RNA-degradatie bij RT te minimaliseren en om verdamping van de verzamelbuffer in de buiskap te voorkomen, wat cruciaal is voor efficiënte monsteropvang. In de praktijk kan de streefopbrengst van ongeveer 1.000 cellen uit morfologisch gedefinieerde gebieden betrouwbaar binnen 4 uur worden geoogst.

  1. Veeg de oppervlakken van de laboratoriumbank af met het RNase-decontaminatiemiddel.
  2. Zet de controller aan en laat de microscoop zijn initialisatieproces voltooien.
  3. Draai de toets met de klok mee van de uit-positie naar de aan-positie om het lasersysteem te starten.
    OPMERKING: Het lasersysteem heeft ongeveer 10 minuten nodig om op te warmen.
  4. Zet de computer aan en open de LCM-software, wacht dan tot het initialisatieproces is voltooid.
  5. Plaats een steriel 0,2 mL PCR-buisje (verzamelbuis) in het verzamelapparaat.
  6. Voeg 10 μL van een proteïnase K-digestiebuffer toe (zie de Materiaaltabel) aan de kap van de PCR-buis.
    OPMERKING: Het totale volume van de proteïnase K-verteringsbuffer zal in een volgende stap (zie Stap 5.4.1) tot 150 μL worden gebracht als onderdeel van de volledige lysisprocedure.
  7. Laad het verzamelapparaat in de houder van het monster van de microscoop.
  8. Selecteer in het venster Change Collector Device eerst de knop Move to Reference Point . Pas vervolgens de camerafocus aan om een duidelijk zicht op het referentiepunt te garanderen. Gebruik indien nodig de pijlen in het raam om het referentiepunt in het gezichtsveld te centreren.
  9. Laad een weefselsectie in de monsterhouder, zorg dat de weefselsectie met de voorkant naar beneden is georiënteerd en het label rechts staat.
  10. Selecteer de 10×objectieflens, identificeer en schets regio's van interesse die specifieke pathologische kenmerken vertonen, zoals microvesiculaire steatose (gekenmerkt door hepatocyten met talrijke kleine, heldere cytoplasmatische vacuolen en centraal gelegen kernen). Ga vervolgens naar het Laser-menu en klik op de Calibrate-knop . Bevestig het bericht op het scherm door Ja te selecteren en ga verder met de calibratie.
    OPMERKING: De 10× objectieflen is niet exclusief voor microdissectie; Andere vergrotingslenzen (bijv. 20×) kunnen worden geselecteerd op basis van de scherpte van het monster en de gewenste resolutie.
  11. Stel in het laserbedieningspaneel de snijparameters in als: Laservermogen = 50, Apertuur (laserstraaldiameter) = 5, en Snelheid = 9.
    OPMERKING: De hierboven genoemde parameterwaarden dienen als referentie voor het UV-LCM-systeem met de weefselmonsters die in dit protocol worden gebruikt. Gebruikers van andere UV-LCM-systemen moeten deze als uitgangspunt beschouwen en zullen waarschijnlijk de instellingen empirisch moeten aanpassen. Optimale instellingen kunnen variëren afhankelijk van weefseltype, sectiedikte en andere LCM-systemen.
  12. Teken een cirkel rond het doelgebied met behulp van de grafische werkbalk. Selecteer de Single Shape, klik op de Start Cut-knop om LCM uit te voeren, en positioneer vervolgens het verzamelapparaat om het gedissectiede weefsel te verzamelen.
    OPMERKING: Succesvolle loskoppeling wordt aangegeven door een scheiding van het geselecteerde gebied, vaak met een zichtbare opening of fragmentbeweging. Voor consistentie verzamel je uit een vooraf bepaald aantal regio's van vergelijkbare grootte per steekproef. Als het doelgebied niet automatisch loskomt, klik dan op de knop Bewegen en Snijden om het monster handmatig met de muis te snijden. Voor een nauwkeurigere schatting van het celnummer kan LCM-software automatisch het totale snijoppervlak registreren. Deze waarde kan worden gedeeld door de gemiddelde dwarsdoorsnede van een doelcel om het totale aantal gevangen cellen te benaderen.
    VOORZICHTIG: Staar tijdens het LCM-proces niet direct naar de laserstraal om blootstelling aan laserstraling te vermijden.
  13. Optioneel kun je een voor- en na-afbeelding van de dissectielocatie maken door het commando 'Afbeelding opslaan als' te selecteren in het Bestandsmenu . Kies in het dialoogvenster een locatie, bestandsnaam en sla op in een voorkeursformaat (bijvoorbeeld .tif).
  14. Na het verzamelen van het gewenste aantal cellen, klik je op de Unload-knop om de collector uit het level te verwijderen. Controleer voordat je de PCR-buis afsluit of het buffervolume van de eiwitase K-verteringsbuffer in de kap 10 μL blijft; vul de buffer aan als er verdamping plaatsvond tijdens LCM (zie Stap 4.6).
    OPMERKING: Door 10 μL van de buffer toe te voegen, wordt het kapoppervlak volledig bevochtigd, wat de efficiënte overdracht van de micro-dissectie weefselpellet tijdens centrifugatie in stap 4.16 vergemakkelijkt.
  15. Draai de verzamelbuizen grondig in vortex.
  16. Draai de verzamelbuizen kort en bewaar de monsterbuisjes bij -80 °C tot RNA-extractie.
    OPMERKING: Herhaal stappen 4.5 tot 4.16 voor het volgende monster. Het protocol kan worden gepauzeerd tot RNA-extractie.

5. Totale RNA-extractie van micro-dissectie monsters

  1. Veeg de oppervlakken van de laboratoriumbank af met het RNase-decontaminatiemiddel.
  2. Breng de LCM-monsters over van de -80 °C vriezer naar een ijsbad. Indien gewenst, verzamel verschillende batches van dezelfde gevangen monsters.
  3. Incubeer de micro-dissectie monsterbuisjes ondersteboven bij 42 °C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Deze inversie zorgt ervoor dat elk weefsel dat na korte centrifugatie aan de kap blijft kleeft (Stap 4.16) in de verteringsbuffer wordt vrijgegeven. Dit zorgt voor maximale monsteroverdracht in de buffer vóór de volumeaanpassing en hogesnelheidscentrifugatie in stap 5.4.1.
  4. Isoleer totaal RNA uit LCM-monsters met een standaard RNA-extractiekit geoptimaliseerd voor vaste weefsels (zie de Materiaaltabel).
    1. Pas het volume in elke monsterbuis aan op een uiteindelijke 150 μL met de protenase K-digestiebuffer (zie de Materiaaltabel). Draai de buizen op 11.000 × g (1 min) en breng de monsters vervolgens over in een steriele buis van 1,5 mL.
    2. Voeg 10 μL proteïnase K (20 mg/mL) per buis toe en meng de monsters vervolgens voorzichtig door herhaald pipetteren. Dit resulteert in een eindvolume van 160 μL en een uiteindelijke concentratie van proteïnase K van ongeveer 1,25 mg/mL in de verteringsreactie per monster.
    3. Voer een tweestaps-incubatie uit bij monsters: eerst bij 56 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 15 minuten bij 80 °C. Tijdens elke incubatie laat je de buizen elke 5 minuten kort vortexen.
      OPMERKING: Voor een optimale workflow gebruik je twee voorverwarmde waterbaden. Als je een enkel bad gebruikt, pauzeer dan na de 56 °C incubatie: houd de monsters op RT terwijl het bad opwarmt tot 80 °C, en ga dan verder.
    4. Leg de monsters 3 minuten op ijs, gevolgd door centrifugatie op 20.000 × g (15 min).
    5. Aspiraat het geklaarde supernatant naar een nieuwe 1,5 mL buis, waarbij je voorzichtig de pellet vermijdt.
    6. Voeg 16 μL DNase-incubatiebuffer en 10 μL DNase I-enzym (2,73 eenheden/μL, zie de Materiaaltabel) toe aan elk monster. Meng de inhoud vervolgens grondig door de buizen voorzichtig om te draaien. Dit resulteert in een eindvolume van 186 μL en een eindconcentratie van DNase I van ongeveer 0,15 eenheden/μL in de verteringsreactie per monster.
    7. Voer een snelle draai uit om restvloeistof van de buiswanden op te vangen.
    8. Incubeer de monsterbuisjes 15 minuten bij RT.
    9. Breng 320 μL hoogzout washbuffer over (zie de Materiaaltabel) naar elk monster en meng de monsters grondig. Dit resulteert in een eindvolume van 506 μL per monster.
    10. Breng 720 μL absolute ethanol over naar elke buis, meng de monsters door te pipetteren (geen centrifugatie) en ga direct verder. Dit resulteert in een eindvolume van 1.226 μL per monster.
      VOORZICHTIG: Absolute ethanol is zeer brandbaar. Verzamel afvalethanol in een aangewezen niet-halogeneerde organische oplosmiddelcontainer voor correcte verwijdering.
    11. Breng 700 μL van het monstermengsel over in een zuiveringskolom (geplaatst in een 2 mL verzamelbuis, zie de Materiaaltabel). Sluit voorzichtig het deksel en centrifugeer op 8.000 × g (15 s).
    12. Verwijder de doorstroming van de verzamelbuis. Behou de kolom zuivering.
    13. Herhaal stappen 5.4.11 tot 5.4.12.
    14. Voeg 500 μL ethanol-gebaseerde wasbuffer toe (zie de Tabel van Materiaal) aan elke monsterbuis. Sluit voorzichtig de deksels en centrifugeer op 8.000 × g (15 s). Vervolgens gooi je de doorstroming van de verzamelbuis weg.
    15. Herhaal stap 5.4.14 in zijn geheel, met als enige wijziging om de centrifugatietijd te verlengen tot 2 minuten bij 8.000 × g.
    16. Breng elke zuiveringskolom over naar een nieuwe 2,0 mL buis. Centrifugeer op 14.000 × g (5 min) met de dop open, en gooi daarna de buis en de resterende vloeistof weg.
    17. Breng elke zuiveringskolom over naar een nieuwe 1,5 mL buis. Pipetteer 16 μL RNase-vrij water op het membraan, sluit de kap en centrifugeer op 14.000 × g (5 min) om de eluatie van het totale RNA te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Houd alle geëlueerde RNA-monsters op ijs voor stappen 5.5 en 5.6 om degradatie te voorkomen.
  5. Kwantificeer de RNA-monsters en controleer de zuiverheid (A260/A 280-verhouding ) met spectrofotometrie.
    OPMERKING: De meting van concentratie en zuiverheid (A260/A 280-ratio ) in deze stap, samen met de integriteitsbeoordeling in stap 5.6, dient als het definitieve kwantitatieve controlepunt voor succesvol RNA-herstel. Een duidelijk RNA-eluaat wordt verwacht.
  6. Voer agarosegelelektroforese uit met een gelconcentratie van 1% en bepaal het RNA-integriteitsgetal (RIN) met behulp van een Bioanalyzer-systeem om de RNA-kwaliteit te evalueren.
  7. Bewaar de RNA-monsters bij -80 °C totdat qRT-PCR of RNA-Seq wordt uitgevoerd.

6. RNA-analyse

OPMERKING: qRT-PCR wordt beschreven in stappen 6.1 en 6.2, en RNA-Seq wordt beschreven in stap 6.3.

  1. Bereid het omgekeerde transcriptie-reactiemengsel voor en voeg 50 ng totaal RNA toe per reactie op ijs. Ga verder met de omgekeerde transcriptiereactie met een thermische cycler volgens de verstrekte instructies (zie de Materiaaltabel).
  2. Bereid op het ijs een kwantitatieve PCR-mastermix voor β-actine volgens de instructies van de fabrikant (zie de Materiaaltabel voor primersequenties). Voer realtime PCR-amplificatie uit op een kwantitatieve PCR-methode met het door de fabrikant aanbevolen cyclusprotocol en 10 ng cDNA per reactie.
  3. Met behulp van een laag-input strengkit (zie de Materiaaltabel) construeren RNA-Seq bibliotheken uit 50 ng totaal RNA. Bepaal de bibliotheekgrootte en concentratie met een bioanalyzersysteem (zie de Table of Materials) en voer vervolgens paired-end sequencing uit op een high-throughput platform (zie de Table of Materials).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De experimentele workflow, die PFA-fixatie, 30% sucrose-dehydratie, OCT-inbedding en cryosectie omvat, hematoxyline-kleuring, identificatie en nauwkeurige verzameling van het doelgebied (~1.000 cellen) door LCM, cellyse, RNA-isolatie, RNA-kwaliteitscontrolemetrics en de twee belangrijkste analytische toepassingen, wordt beschreven in Figuur 1. De met hematoxyline gekleurde leversectie op de PEN-glaasje wordt onder de microscoop getoond vóór (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kracht van LCM ligt in de precieze, in situ vangst van geselecteerde cellen of weefselgebieden, wat het bestuderen van specifieke gebieden binnen een heterogeen weefsel vergemakkelijkt. Maar de lage monsteropbrengst, het tijdrovende proces, de hoge kosten en de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur beperken de brede toepassing van deze techniek in laboratoria23. In deze studie werd het LCM-RNA-protocol vastgesteld om belangrijke historische beperkin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82070589), de Guangdong Natural Science Foundation (2022A1515010218) en het Guangzhou Science and Technology Plan Project (206077078001) aan prof. Yan Wang. We zijn het Biomedical Research Center van de Southern Medical University dankbaar voor technische ondersteuning en toegang tot het laservangstmicrodissectiesysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
0.2 ml dunne buisjesAxygenPCR-02-CBuisjes voor LCM-collectie
1.5 mL centrifugebuisAxygen339653
4% paraformaldehydeLeageneDF0135
50 mL centrifugebuisThermoFisher Scientific339653
DEPC (diethylpyrocarbonaat)SigmaD-5758
DNase I-verteringssetQiagen73504Onderdeel van het RNeasy FFPE Kit, inclusief DNase I-stockoplossing en DNase Booster Buffer
Ethanol (100%)Thermo Fisher ScientificBP2818Gezuiverd voor moleculaire biologie
Ethanol-gebaseerde wasbufferQiagen73504Buffer RPE (onderdeel van RNeasy FFPE Kit)
Hoge zoutwasbufferQiagen73504Buffer RBC (onderdeel van RNeasy FFPE Kit)
Microtoommessen met laag profielLeica Biosystems819
Mayer’s hematoxylinenLeageneDH0001
OCT-compoundSakura4583
PEN-membraan gecoate schuifLeica11505188
Fosfaat gebufferde zoutoplossingLeageneCC0010Vrij van DNase/RNase
Poly-L-lysineMacklinP875131S
Proteïnase K-verteringsbufferQiagen73504Buffer PKD (onderdeel van RNeasy FFPE Kit)
ZuiveringskolomQiagen73504RNeasy MinElute spinkolom (onderdeel van RNeasy FFPE Kit)
Kwantitatieve PCR mastermixTakara BioRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Omgekeerde transcriptie kitQiagen205411QuantiNova Reverse Transcriptie Kit
RNA-extractie kitQiagen73504RNeasy FFPE Kit
RNA Sequencing Kit (Low-input, Stranded)Takara Bio634412SMARTer stranded total RNA-seq kit - pico input mammalian v2
RNase ontsmettingsmiddelSolarbioSR0040Reiniging
SucroseMacklinS818049
Dieren en dieet
Muis: C57BL/6JLaboratory Animal Center of Guangdong Province03
Speciaal dieet & drinkwater
Hoogvet, choline-deficiënt dieet (basisdieet)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMacronutriënten: eiwit, 14 kcal%; koolhydraten, 26 kcal%; vet, 60 kcal%)
Suiker aangevuld drinkwaterMacklinN/A (zelf bereid)Een mengsel van D-glucose (Macklin, Cat# F87500) en D-fructose (Macklin, Cat# S818049) werd toegevoegd aan geautoclaveerd drinkwater met een uiteindelijke concentratie van 42 g/L, met een glucose-tot-fructose verhouding van 55:45 (w/w)
Muis Primers
β-actine (Voorwaarts: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )BGI SequencingAangepastHPLC gezuiverd
β-actine (Omgekeerd: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)BGI SequencingAangepastHPLC gezuiverd
Apparatuur
Cryostat microtoomLeica BiosystemsCM3050 S
Bioanalyzer systeemAgilentG2939BA
Hoge doorvoer sequencing platformIllumina; Inc.NovaSeq 6000 systeem
Laser Capture Microdissectie systeemLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Kwantitatieve PCR systeemApplied BiosystemsQuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem
SpectrofotometerThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Thermische CyclerBioRadT100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (versie 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (versie 8.3.0)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Gerelateerde artikelen