$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
De experimentele workflow voor het evalueren van de effectiviteit van microbiële inoculanten bij het verbeteren van waterstressbestendigheid in Romaine sla (Lactuca sativa L. var. Paspartu) wordt samengevat in Figuur 1. Het protocol integreerde continue monitoring van precieze irrigatieregimes met periodieke verzameling van fysiologische en thermische gegevens. Twee verschillende microbiële producten werden gebruikt: (I) microbieel consortium, een complex consortium van 67 stammen bestaande uit PGPR, actinomyceten en nuttige schimmels, ontworpen om als fysiologische buffer te fungeren via wortelkolonisatie en exopolysaccharide (EPS) secretie; en (II) Trichoderma harzianum, een enkelstammige inoculant van Trichoderma harzianum , gericht op het induceren van systemische resistentie en het modificeren van wortelarchitectuur. De gebruikte reagentia, apparatuur en software staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Microbiële inoculatie
Voor beide microbiële behandelingen werd een gestandaardiseerd inoculatieregime geïmplementeerd, bestaande uit zes bodemdoordrenkte toepassingen gericht op de rhizosfeer met behulp van hoogprecisiemicropipetten om doseringen op veldschaal te simuleren. De eerste fase vond plaats tijdens de zaailingfase 5 en 15 dagen na het zaaien (DAS). Bij 30 DAS werden zaailingen verplant in grotere holtebakken, waarbij de tweede fase van de inoculaties 1 dag na het transplanteren (DAT) werd uitgevoerd, gevolgd door opeenvolgende toepassingen bij 7, 15 en 20 DAT.
Voor het microbiële consortium werden de doseringen aangepast volgens plantenfenologie: de eerste twee toepassingen werden toegediend bij 500 g/ha (3 mL/plant), gevolgd door een hoge concentratie dosis van 2 kg/ha bij het transplanteren, en afgesloten met drie onderhoudsdoses van 300 g/ha. Evenzo werd T. harzianum aangebracht met 1 L/ha tijdens de eerste twee fasen, 3 L/ha bij het transplanteren en 1 L/ha voor de laatste drie toepassingen. Deze gefaseerde aanpak was ontworpen om robuuste wortelkolonisatie te waarborgen en de rol van de microbiële populatie als fysiologische buffer te behouden gedurende de kritieke groei- en stress-inductieperiodes.
2. Gewasvoorbereiding
Gecertificeerde Romaine slazaden (Lactuca sativa L. var. Paspartu) werden gekiemd in 311-holtes polystyreen trays (11 mL per holte) met een professioneel bodem op basis van veenmos op een diepte van 1 cm. De kieming vond plaats in een gecontroleerde bioklimatologische kamer, gehouden op een temperatuurbereik van 15 °C tot 22 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 60%–70%. Bij het bereiken van 90% kieming (ongeveer 3–5 dagen na het zaaien) werden zaailingen verplant in grotere trays met een wortelkluitcapaciteit van 55 mL om onbeperkte wortelontwikkeling mogelijk te maken (Figuur 2 en Figuur 3). De proef was georganiseerd in een volledig gerandomiseerd ontwerp (CRD), met 9 experimentele eenheden (trays) en 20 zaailingen per tray. Deze opstelling was zo gestructureerd dat het een 3 × 3 fakultiale opstelling mogelijk maakt (3 microbiële behandelingen × 3 irrigatieregimes). Gedetailleerde fysisch-chemische eigenschappen van het substraat en specifieke bioklimatologische kamerprogrammering14zijn weergegeven in Figuur 3, Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2 en Aanvullende Tabel 3.
Experimentele trays werden verdeeld met een volledig willekeurige indeling binnen de bioklimatologische kamer om randeffecten te elimineren en uniforme belichting te garanderen. De kamer was geprogrammeerd om dynamische veldachtige omstandigheden te simuleren, waarbij een hogetemperatuurregime werd gebruikt om openveld-thermische spanning na te bootsen. Tijdens de vegetatieve fase werden omgevingsparameters binnen een variabel bereik van relatieve luchtvochtigheid gehandhaafd, en een 9-uur durende fotoperiode werd geleverd door hoogintensiteit LED-verlichting (ingesteld boven 50% van de maximale capaciteit om voldoende fotosynthetisch actieve straling te garanderen)15. Na de vestigingsfase werd het milieuprogramma aangepast om de intensiverende eisen van de watertekortbehandelingen te weerspiegelen, zoals geïllustreerd in de stapsgewijze atmosferische overgangen15 (Figuur 4 en Figuur 5). Specifieke dag-/nachtelijke setpoints voor temperatuur, vochtigheid en lichtintensiteit worden beschreven in Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Tabel 2 om het hoofdprotocol te stroomlijnen.
De bemestingsstrategie was ontworpen om te voldoen aan de specifieke fenologische eisen van Romaine-sla, waardoor een gebalanceerde voedingsflux gedurende de vegetatieve cyclus behouden blijft. Tijdens de zaailingfase (12 tot 24 DAS) werden voedingsstoffen geleverd via gerichte toepassingen van kaliumnitraat (KNO3), monokaliumfosfaat (KH2PO4) en calciumnitraat (Ca(NO3)2). Om de vroege vestiging te bevorderen, werd er in de eerste 24 dagenvan 16 een commerciële biostimulant aangevuld.
Van 26 DAS tot en met de laatste evaluatie bij 76 DAS schakelde het fertigatieprogramma over op een onderhoudsregime waarbij het biostimulant werd geëlimineerd om de specifieke effecten van de microbiële inoculanten te isoleren. Alle toepassingen werden gekalibreerd om optimale elektrische geleidbaarheid (EC) en pH binnen de rhizosfeer te behouden. Het volledige chronologische schema van mineraalconcentraties en specifieke doseringsvolumes16is beschreven in Aanvullende Tabel 3.
3. Behandeling met micro-organismen
Om de effectiviteit van biologische interventies tegen hydrische stress te evalueren, werden drie verschillende behandelingen opgezet: (I) microbieel consortium, een hoogdiversiteitsmicrobieel consortium bestaande uit 67 nuttige stammen, waaronder Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR), Actinomyceten en schimmels; (II) T. harzianum, een gespecialiseerde enkelstammige formulering van Trichoderma harzianum; en (III) een niet-gevaccineerde controle. Deze behandelingen werden geselecteerd op basis van hun potentieel voor geïnduceerde systemische tolerantie (IST), voornamelijk via mechanismen zoals aanpassing van de wortelarchitectuur, productie van ACC-deaminase en exopolysaccharide (EPS) secretie.
De inenting volgde een gefaseerde strategische aanpak. De eerste toepassing (3 mL per plant) werd uitgevoerd via een hoogprecisie-micropipet direct in de rhizosfeer in de tweede echte bladfase om vroege wortelkolonisatie te waarborgen. Latere toepassingen werden gekalibreerd naar veldschaalequivalenten (waarbij een dichtheid van 75.000 planten/hectare werd gesimuleerd). Voor T. harzianum werd een concentratie van 2 L/ha toegepast, terwijl het microbiële consortium werd toegediend bij 1 kg/ha. Deze formuleringen werden opgelost in het irrigatiewater en elke 15 dagen aangebracht om een stabiele microbiële populatie te behouden als fysiologische buffer gedurende de vegetatieve cyclus17.
4. Verschillende irrigatiebehandelingen
Om de fysiologische en agronomische plasticiteit van L. sativa onder verschillende hydrische omstandigheden te evalueren, werden drie irrigatieregimes geïmplementeerd op basis van de vervanging van gewasverdamping (ETc). Het volumetrische watergehalte werd gekalibreerd tegen de veldcapaciteit (FC) van het substraat om precieze spanningsinductie te garanderen. De regimes werden als volgt gedefinieerd: (I) Control/Well-watered (CC-100% ETc), waarbij volledige evapotranspiratie werd aangevuld; (II) Matig watertekort (75% ETc), ontworpen om tussenliggende hydraulische beperking te induceren; en (III) Ernstig Watertekort (50% ETc), gericht op het veroorzaken van kritieke waterstress. Irrigatie werd dagelijks uitgevoerd na het maken van thermische beelden met gegradueerde pipetten om een nauwkeurige vervanging van het waterverlies door evapotranspiratie18 te waarborgen.
5. Data- en beeldopname
Om de thermische verdeling en waterstatus van de installaties te evalueren, werden gedurende de experimentele periode dagelijks van maandag tot en met vrijdag infrarood thermische beelden gemaakt. Alle fotografische opnames werden uitgevoerd tussen 12:00 en 14:00 uur om metingen te standaardiseren tijdens de periode van maximale transpiratie en zonne-intensiteit. Het is cruciaal om deze beelden direct vóór de dagelijkse irrigatiebehandelingen te maken om de cumulatieve waterstress vast te leggen die de planten gedurende de afgelopen 24-uurscyclus hebben ervaren. Voor beeldverwerving werd de infrarood thermische camera aangesloten op een mobiel apparaat en hield een loodrechte oriëntatie ten opzichte van de achterkant van de slaplanten op een constante afstand van 60–70 cm. De software was geconfigureerd met een meerkleurig thermisch palet waarin temperatuurgradiënten van laag naar hoog worden weergegeven: beginnend met paars (koudst), overgaand naar koningsblauw, turquoise, groen (middenpunt), geel, oranje en tenslotte rood (heetste). Binnen de software-interface werd het specifieke traygebied met het plantenkap handmatig geselecteerd om de thermische gegevens vast te leggen. Deze kleurschaal dient als fysiologische indicator: goed gehydrateerde planten vertonen koelere bladerdaktemperaturen (paars/blauw) door actieve transpiratie, terwijl gedehydrateerde planten hogere bladerdaktemperaturen (oranje/rood) vertonen door het sluiten van de huidmondjes en verminderde verdampingskoeling. Vervolgens werden deze hoogresolutiebeelden verwerkt met behulp van de driepuntsmeetfunctie over specifieke interessegebieden (ROI) om precieze waarden van de bladerdaktemperatuur (Tc) te verkrijgen voor de berekening van de Crop Water Stress Index (CWSI).
Als CWSI het volgende is:
0, dan staat het gewas niet onder waterstress
1 dan staat het gewas onder ernstige waterstress
Waar:
Tc is de temperatuur van het gewasdak, gemeten met infraroodbeeldvorming. Tw is de temperatuur van het bladerdak onder omstandigheden zonder waterspanning. Td is de temperatuur van het bladerdak onder maximale waterstresscondities19.
Indicatoren van plantengroei, ontwikkeling en fysiologische conditie, zoals hoogte, bladaantal en bladtemperatuur, beoordeeld met infraroodthermografie, worden weergegeven in Aanvullende Tabel 4 , samen met de studievariabelen en conceptuele en operationele definities die in het experiment zijn gebruikt. De combinatie van deze variabelen maakte een uitgebreide beoordeling mogelijk van de impact van de experimentele behandelingen op de fysiologische prestaties en ontwikkeling van elke plant.
6. Data-analyse
Fysiologische en morfologische gegevens werden geanalyseerd met behulp van een One-Way ANOVA voor elk irrigatieregime om het effect van de verschillende microbiële behandelingen te bepalen. Alle statistische procedures werden uitgevoerd met behulp van statistische software. Voordat de inferentieanalyse werd uitgevoerd, werden de fundamentele vereisten voor parametrische statistiek geverifieerd om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. De normaliteit van de residuen werd bevestigd met de Anderson-Darling-test (p > 0,100), wat op normaliteit wijst. Daarnaast werd de homogeniteit van varianties gevalideerd met behulp van de Levene-test (p = 0,989), waarmee een hoge homoscedasticiteit tussen groepen werd bevestigd. Omdat aan beide aannames werd voldaan, werd de Tukey HSD (Honestly Significant Difference) post-hoc test gebruikt om significante verschillen (p < 0,05) tussen de behandelgemiddelden te identificeren. De individuele installatie werd gedefinieerd als de experimentele eenheid voor alle statistische evaluaties.
