Methodenartikel

Single-cell RNA-sequencing voor het profileren van ganglionaire en aganglionaire colonsegmenten van patiënten met de ziekte van Hirschsprung

DOI:

10.3791/69825

⸱

22 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een single-cell RNA-sequencingworkflow om immune-celinfiltratie en celtype-specifieke transcriptieverschillen tussen ganglionaire en aganglionaire colonsegmenten te analyseren bij de ziekte van Hirschsprung.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirschsprung-ziekte (HSCR) is een aangeboren darmmotiliteitsstoornis die wordt gekenmerkt door het ontbreken van enterische neuronen in de distale darm. In vergelijking met bulk RNA-sequencing maakt single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) genexpressieprofilering op single-celniveau mogelijk, waarbij cellulaire heterogeniteit wordt opgelost die in populatiegemiddelde analyses wordt gemaskeerd. Er werd een gestandaardiseerde scRNA-seq-workflow vastgesteld om het transcriptielandschap van ganglionaire en aganglionaire segmenten van patiënten met HSCR te karakteriseren. Darmweefsels werden verzameld en er werd hematoxyline- en eosine kleuring uitgevoerd om ganglionaire en aganglionaire regio's te identificeren. Weefsels werden enzymatisch en mechanisch gedissocieerd in single-cell suspenties, gevolgd door filtratie, levensvatbaarheidsbeoordeling en de constructie van single-cell transcriptome libraries. Bibliotheken die de kwaliteitscontrole doorstonden, werden gesequenced en ruwe data werden verwerkt voor celkwantificatie en kwaliteitsfiltering om laagwaardige cellen en technische artefacten te verwijderen. Na normalisatie en dimensionaliteitsreductie werden cellen geclusterd en geannoteerd op basis van gevestigde markergenen. Downstream-analyses vergeleken celtypesamenstelling tussen ganglionaire en aganglionaire weefsels en identificeerden verschillend tot expressie gebrachte genen binnen belangrijke immuuncelsubsets. De resultaten tonen aanzienlijke verschillen in de immuunmicro-omgeving tussen ganglionaire en aganglionaire segmenten in HSCR.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Hirschsprung (HSCR) is een van de meest voorkomende aangeboren darmmotiliteitsstoornissen, met een incidentie van ongeveer 1 op de 5.000 levendgeborenen wereldwijd1. De ziekte ontstaat doordat enterische neurale crestcellen (ENCC's) tijdens de embryonale weken 5–12 niet migreren naar de distale darm, wat resulteert in het ontbreken van enterische ganglia in de getroffen segmenten2. Het aganglionaire segment vertoont daardoor aanhoudende spastische contractie en verstoorde peristaltie, wat leidt tot proximale darmdilatatie. Klinisch gezien uit dit zich als functionele obstructie, wat constipatie, buikspanning en braken veroorzaakt, en in ernstige gevallen levensbedreigend kan zijn. Chirurgische resectie van het aganglionaire segment blijft de primaire behandeling voor HSCR; Echter, een aanzienlijk deel van de patiënten ervaart postoperatieve complicaties, waaronder constipatie, enterocolitis en fecale vervuiling, wat de kwaliteit van leven aanzienlijk aantast3. Daarnaast kan het kortdarmsyndroom (SBS) optreden na een uitgebreide darmresectie, wat leidt tot een verminderde opname van voedingsstoffen en grotere klinische beheersuitdagingen. Daarom blijven het ophelderen van de onderliggende mechanismen van HSCR en het identificeren van nieuwe therapeutische doelwitten cruciale klinische behoeften.

In de afgelopen jaren is single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) op grote schaal toegepast om ziekte-geassocieerde moleculaire mechanismen te onderzoeken. In tegenstelling tot conventionele bulk RNA-sequencing maakt scRNA-seq genexpressie-analyse mogelijk met enkelcelresolutie, waardoor cellulaire heterogeniteit en zeldzame subpopulaties die in bulkanalyses worden gemaskeerd, kunnen worden geïdentificeerd4. Daardoor is scRNA-seq uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel om cellulaire heterogeniteit en intercellulaire communicatie te ontleden, waarmee het onderzoek in biologieen geneeskunde vooruit heeft geholpen. Deze aanpak heeft nieuwe pathogene mechanismen en therapeutische doelwitten onthuld bij complexe ziekten, waaronder de ziektevan Alzheimer 6, reumatoïde artritis7, longkanker8 en type 2 diabetes9.

In deze studie werd scRNA-seq toegepast om het transcriptielandschap van immuuncellen en infiltratiepatronen in ganglionaire en aganglionaire colonweefsels van patiënten met HSCR te karakteriseren. De workflow bestond uit drie hoofdstappen: voorbereiding en kwaliteitsbeoordeling van single-cell suspensies, de bouw van 3′ single-cell RNA-seq bibliotheken, en downstream bio-informatische analyse. Weefselmonsters werden direct na resectie bewaard in een speciale enkelcelconserveringsoplossing en werden enzymatisch gedissocieerd in eencelsuspensies binnen 48 uur. De cellevensvatbaarheid overschreed 80%, en de uiteindelijke celconcentratie werd aangepast naar 700–1.500 cellen/μL vóór de bibliotheekvoorbereiding. Infiltratie van immuuncellen tussen ganglionaire en aganglionaire segmenten werd vergeleken en immuuncelsubpopulaties met uitgesproken transcriptieverschillen werden geïdentificeerd. Deze analyses beschrijven immuuncelveranderingen die geassocieerd worden met colonische pathologie bij HSCR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van het Affiliated Hospital van de Zunyi Medical University (Goedkeuringsnummer: KYLL-2024-030). De studie voldoet aan de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming (mondeling en schriftelijk) werd verkregen van alle deelnemers en hun voogden. Tabel 1 presenteert de informatie over HSCR-patiënten.

Verzamel colonisch weefsel, waaronder ganglionaire en aganglionaire segmenten, van HSCR-patiënten die zijn gediagnosticeerd en geopereerd worden in de afdeling Kinderchirurgie van het Affiliated Hospital van Zunyi Medical University. Includeer ganglionaire en aganglionaire segmenten van twee mannelijke HSCR-patiënten. Gedetailleerde klinische informatie is te vinden in Tabel 1. Alle reagentia, chemicaliën, apparatuur en software staan vermeld in de Tabel van Materiaal.

1. Hematoxyline- en eosine kleuring

  1. Weefselverzameling en fixatie
    1. Fixeer darmweefselmonsters in 4% paraformaldehydefixatieoplossing gedurende minstens 24 uur.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en geeft formaldehydedampen af. Voer alle procedures uit in een chemische dampkap en gebruik passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Knip de weefsels af tot ongeveer 5 × 5 × 2 mm3 met een scalpel. Plaats tissues in inbeddingcassettes en spoel 24 uur onder stromend kraanwater.
      OPMERKING: Verwijder weefselranden en bereid blokken voor met minstens één vlak oppervlak. Als het ongelijk is, leg dan na het afspoelen een tissue tussen filterpapieren.
  2. Gegradueerde ethanoldehydratie
    1. Dompel weefsels achtereenvolgens onder in ethanoloplossingen: 70% ethanol 's nachts, 80% ethanol voor 3 uur, 90% ethanol voor 2 uur, 95% ethanol I voor 2 uur, 95% ethanol II voor 1 uur, 100% ethanol I voor 1 uur en 100% ethanol II voor 30 minuten.
      OPMERKING: Verdun ethanol (≥99,7%) met ultrazuiver water tot de aangegeven concentraties.
      VOORZICHTIG: Voer ethanolbehandeling uit in een chemische afzuigkap.
    2. Verwijder het droogmandje en giet grondig af tussen de stappen door.
  3. Vrijmaken
    1. Breng de weefsels 30 seconden over op xyleen om transparantie te bereiken.
  4. Paraffine-infiltratie en inbedding
    1. Smelt paraffinewas één dag van tevoren op 60 °C. Onderwerp verse was aan drie vries-dooicycli om bellen te verwijderen. Filter de gesmolten paraffine door filterpapier na de derde cyclus.
    2. Infiltreer weefsels in pure paraffinewas (Paraffinewas I) gedurende 1 uur.
    3. Infiltreer weefsels in paraffinemengsel (Paraffinewas II; pure paraffinewas: bijenwas = 8:1) gedurende 2 uur.
      OPMERKING: Smelt de bijenwas en filter volledig voor gebruik.
    4. Giet paraffinewas II in inbeddingsmallen. Plaats weefselblokken rechtop en vlak, plaats labels en laat het uitharden.
  5. Sectie
    1. Trim paraffineblokken om gladde oppervlakken te krijgen zonder in het weefsel te snijden.
    2. Bevestig blokken op een microtoom. Pas de oriëntatie aan en verwijder overtollige paraffine. Snijd seriële secties met een dikte van 4 μm. Dodrijf delen op een 50 °C waterbad en zet ze over op glazen glijbanen.
    3. Droge schuilen in een oven van 60 °C om het resterende vocht te verwijderen.
      OPMERKING: Droge secties gedurende 12–48 uur.
  6. Deparaffinisatie
    1. Voer sequentiële incubatie uit: xyleen I (15 min), xyleen II (15 min), 100% ethanol I (5 min), 100% ethanol II (5 min), 90% ethanol (5 min), 80% ethanol (5 min), 70% ethanol (5 min) en gedestilleerd water (5 min).
  7. Hematoxyline-kleuring
    1. Beet secties met hematoxyline gedurende 50 seconden.
    2. Spoel 10 minuten onder stromend kraanwater.
  8. Eosine kleuring
    1. Beits secties met eosine gedurende 40 seconden.
  9. Uitdroging
    1. Dompel secties achtereenvolgens onder in 95% ethanol I (30 s), 95% ethanol II (30 s), 100% ethanol I (30 s) en 100% ethanol II (30 s).
  10. Vrijmaken
    1. Zet secties over in xyleen I voor 10 minuten en xyleen II voor 10 minuten.
  11. Montage en observatie
    1. Voeg montagemedium toe. Bedek met een glazen deksel en verwijder luchtbellen.
    2. Laat het montagemedium verharden. Bekijk secties onder een lichtmicroscoop.

2. Single-cell RNA-sequencing

  1. Bereiding van single-cell suspension
    1. Maal darmweefsels in ~1 mm3 fragmenten met een schaar.
    2. Incubeer weefselfragmenten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 1 mg/mL collagenase II en 0,1 mg/mL DNase I bij 37 °C gedurende 30 minuten met zachte beweging op een wiegplatform (60 rpm).
    3. Beëindig de spijsvertering door een gelijke hoeveelheid koud DMEM toe te voegen dat 10% foetaal rundereserum (FBS) bevat.
    4. Filter de suspensie door een 70 μm celfilter. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Gooi het supernatant weg en houd de celpellet vast. Was één keer met fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS) met 0,04% rundereserumalbumine (BSA).
    6. Loskoppel celklonten door zacht te pipetteren om een single-cel suspensie te verkrijgen.
    7. Filter de suspensatie door een 40 μm celfilter.
    8. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en verzamel het pelletje.
    9. Resuspendeercellen in DMEM die 10% FBS en 1% penicilline–streptomycine (P/S) bevatten.
    10. Bepaal de levensvatbaarheid en dichtheid van cellen met trypan blue exclusion. Gebruik monsters met levensvatbaarheid >80% en pas de concentratie aan op 700–1.500 cellen/μL.
      OPMERKING: Meng celsuspensie met trypan blue (1:1) en tel levensvatbare cellen met een hemocytometer.
  2. Bibliotheekvoorbereiding
    1. Laad ongeveer 15.000 cellen per run voor de voorbereiding van de bibliotheek.
      OPMERKING: In gel-bead-in-emulsie (GEM) microdruppels hybridiseert mRNA tot poly(dT) oligonucleotiden op Gelkralen.
    2. Voer reverse transcriptie uit en amplifiseer cDNA met PCR (95 °C gedurende 10 minuten; 40 cycli van 95 °C voor 15 s, 60 °C voor 35 s, 72 °C voor 25 s; laatste extensie bij 72 °C voor 25 s). Gebruik amplified cDNA voor de constructie van 3′ scRNA-seq librarys.
      OPMERKING: Tijdens de cDNA-synthese wordt een CCC-overhang toegevoegd en wordt gecombineerd met de template switching oligonucleotide (TSO) sequentie.
    3. Breek emulsies en haal cDNA terug van GEMs.
  3. Bibliotheekkwaliteitscontrole en sequencing
    1. Kwantificeer genexpressie en beoordeel de fragmentgrootteverdeling.
    2. Voer nauwkeurige kwantificatie uit met een fluorescerend qPCR-instrument.
      OPMERKING: Zorg voor een concentratie van de bibliotheek ≥10 nM.
    3. Sequentiebibliotheken met behulp van een sequencing-instrument.
      OPMERKING: Leesstructuur: Lees 1 (26 basispunten), Lees 2 (91 basispunten), i7-index (8 basispunten); Doeldiepte ~50.000 lezingen per cel.
  4. Data QC
    1. Lijn ruwe reads uit op de referentiedatabase. Voer UMI-telling uit en genereer een cel-voor-gen-matrix.
    2. Importresultaten in AnnData (Annotated Data) formaat voor downstream analyse.
    3. Voer QC-filtering uit op basis van UMI's, gentellingen en mitochondriale lezingen.
      OPMERKING: Verwijder dubbels (Scrublet); Sluit cellen met <200 of >5.000 genen uit, total_counts >40.000, of mt_ratio >20%.
  5. Dimensionaliteitsreductie en annotatie
    1. Normaliseer de Unique Molecular Identifier (UMI) tellingen tot 10.000 per cel.
    2. Identificeer zeer variabele genen.
    3. Voer principal component analysis (PCA) uit.
    4. Bouw een k-dichtstbijzijnde naburen-graaf.
    5. Voer UMAP embedding uit.
    6. Clustercellen met het Leiden-algoritme in Scanpy (v1.9.3).
      OPMERKING: Gebruik sc.pp.neighbors en sc.tl.leiden (resolutie = 0,5).
    7. Annoteer celtypen met een tool die is ontworpen voor de geautomatiseerde, hoognauwkeurige annotatie van celtypen in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data.
  6. Differentiaalanalyse
    1. Voer differentiële genexpressieanalyse uit in R (v4.2.2) met Seurat (v4.3.0).
      OPMERKING: Gebruik de FindMarkers-functie met de Wilcoxon rangsomtest.
    2. Voer GO-verrijkingsanalyse uit met clusterProfiler (v4.8.1) met enrichGO.
      OPMERKING: Inclusief CC-, MF- en BP-categorieën.
    3. Voer KEGG-padverrijkingsanalyse uit met clusterProfiler (v4.8.1) met enrichKEGG10.

3. Afvalverwerking

  1. Verzamel afval dat paraformaldehyde en xyleen bevat apart.
  2. Neutraliseer zure oplossingen wanneer dat nodig is of voer het weg als gevaarlijk afval.
  3. Volg de institutionele milieu-, gezondheids- en veiligheidsvoorschriften (EHS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematoxylin- en eosinekleuring (HE) (Figuur 1) toonde duidelijke histologische verschillen tussen ganglionaire en aganglionaire segmenten. In vergelijking met ganglionaire segmenten vertoonden aganglionaire segmenten een verhoogde mucosale exfoliatie, een duidelijke vermindering van gobletcellen en submucosale neuronen, en vervagde grenzen tussen de mucosale en spierlaag. In een subset van secties was weefselbehoud suboptimaal, met partiële epitheelloslating...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-cell RNA-sequencing werd toegepast op het profileren van transcriptiekenmerken van chirurgisch geremde colonweefsels (ganglionaire en aganglionaire segmenten) van patiënten met Hirschsprung-ziekten 4,5. Bijzondere aandacht werd besteed aan de weefseldissociatiestrategie, aangezien dissociatieparameters invloed hebben op celherstel, celtyperepresentatie en RNA-integriteit. Enzymatische verteringscondities werden geoptimalis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Guizhou Science and Technology Project (Guizhou Science and Technology Cooperation - Foundation - ZK - [2024] General 344) (aan X.F. Yang) en het Zunyi Science and Technology Project Contract (Science and Technology Cooperation) (Zunyi Science and Technology Cooperation HZ (2023) Nr.) (aan Y. Qu).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BeeswaxSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
BeeswaxSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Bovine serum albuminThermofisher30066575 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575?SID=srch-srp-30066575
Bovine serum albuminThermofisher30066575 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575?SID=srch-srp-30066575
CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
Cluster profiler packageBioconductorv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Cluster profiler packageBioconductorv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Collagenase IIThermofisher17101015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015?SID=srch-srp-17101015
Collagenase IIThermofisher17101015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015?SID=srch-srp-17101015
Cover glassCITOTEST80340-0130 https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Cover glassCITOTEST80340-0130 https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Disposable microtome bladeFeatherS-35 https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Disposable microtome bladeFeatherS-35 https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase IThermofisher18047019 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019?SID=srch-srp-18047019
DNase IThermofisher18047019 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019?SID=srch-srp-18047019
Drying ovenBORUKDHG-9140A http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Drying ovenBORUKDHG-9140A http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermofisher12491015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermofisher12491015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Ethyl alcoholSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Ethyl alcoholSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Fetal bovine serumThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Fetal bovine serumThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Hematoxylin and eosin staining kitBeyotimeC0105S https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&code=C0105S
Hematoxylin and eosin staining kitBeyotimeC0105S https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&code=C0105S
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Microscope slideCITOTEST80302-3111 https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Microscope slideCITOTEST80302-3111 https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Mounting mediumBeyotimeC0173-100ml https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&code=C0173-100ml
Mounting mediumBeyotimeC0173-100ml https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&code=C0173-100ml
Optical microscopeNikonECLIPSE SI https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Optical microscopeNikonECLIPSE SI https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Paraffin wax Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Paraffin wax Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Paraformaldehyde Fix SolutionBeyotimeP0099-3L https://m.beyotime.com/mobilegoods.do

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single Cell RNA SequencingHirschsprung DiseaseGanglionic ColonAganglionic ColonGene Expression ProfilingEnteric NeuronsCell Type CompositionImmune MicroenvironmentTissue DissociationDifferential Gene Expression

Gerelateerde artikelen