Visualisatie van blad- en braktjeelnectaria van katoen met behulp van digitale microscopie om de nauwkeurigheid van de scores en gegevensbehoud te verbeteren

Summary

Hier illustreren we stapsgewijze processen voor het fenotyperen van blad- en bracteale nectaria in katoenplanten met behulp van beelden die digitaal zijn gegenereerd. Dit is een effectieve methode om de nectaria van zowel bladeren als schutbladen van katoen te scoren, omdat de informatie kan worden verzameld en bewaard in de vorm van digitale afbeeldingen.

Abstract

Nectaria zijn afwijkende nectarproducerende klieren die in veel plantensoorten voorkomen. Nectaria vertonen diverse structuren en functies. Bij katoen is de traditionele beoordeling van nectaire eigenschap foutgevoelig, onbetrouwbaar en heeft beperkingen omdat fenotypes van deze eigenschap vaak niet met het blote oog zichtbaar zijn. De expressie van nectaire eigenschappen wordt bepaald door genen Ne1 en/of Ne2. Daarnaast kan de expressie van eigenschappen worden beïnvloed door de omgeving en groeistadia, wat de noodzaak van nauwkeurige beoordelingsmethoden benadrukt. Met name leidt fenotypische scoreing door digitale beelden tot een nauwkeurigere methode van nectaria. Deze methode overwint de beperkingen van de traditionele scoreing door beelden met hoge resolutie te genereren. Verder faciliteert het de identificatie en differentiatie van fijne verschillen in expressie van nectaire eigenschappen, terwijl deze digitale beelden worden bewaard voor toekomstige referentie. Deze fenotyperingsmethode die hier wordt beschreven, kan eenvoudig worden aangepast om andere plantkenmerken zoals klieren, haren en kleur te beoordelen. Deze beoordelingsmethoden kunnen worden aangepast aan andere plantensoorten. In dit artikel leggen we stapsgewijze procedure uit om monsters uit het veld of de kas te verzamelen, ze te dissecten om ze te observeren met digitale microscopie, en deze beelden te bewaren voor toekomstige beoordelingsanalyse. Voor deze methode gebruiken we bijvoorbeeld het scoren van blad- en bracteale monsters van katoenplanten om de aanwezigheid van nectaria (volledig ontwikkeld, gereduceerd en rudimentair) en de afwezigheid van nectaria te onderscheiden.

Introduction

Planten hebben gespecialiseerde klieren genaamd nectaria die in de meeste angiospermen, sommige varens en sommige gymnospermen 1,2,3,4 synthetiseren en nectar produceren. Nectaria worden ingedeeld in drie typen, namelijk mesofylaire, trichomatische en epitheliale types, gebaseerd op de oorsprong van cellen die nectar⁵ produceren. Nectaria in katoen zijn gemodificeerde huidmondjes die bestaan uit kliervormige trichomes, bekend als papillen, en worden gerangschikt als trichomatisch type ^5,6. De meeste Gossypium-soorten hebben nectaria; Het aantal nectaria in dit geslacht verschilt echter per soort⁷. Bloemnectaria (FN's) komen vaker voor dan extraflorale nectarieën (EFN's) bij planten⁸. Deze nectaria kunnen overal op de plant voorkomen, behalve wortels ^1,2. Zo toont Gossypium hirsutum zowel bloemige als extraflorale nectaria⁹. Huiskatoenplanten tonen drie extra bloemige en één bloemige nectarium¹⁰. De drie extra bloemnectaria zijn blad-, bracteale en circumbracteale nectaria¹¹. De bladnectarie is vegetatief en bevindt zich meestal op bladeren aan de onderkant van de middennerf, terwijl bracteale en circumbracteale nectaria voortplantingsmateriaal zijn en zich ontwikkelen aan de basis van het schutblad en het abaxiale kelkoppervlak. Bloemnectarium is geassocieerd met een bloem die zich ontwikkelt op het adaxiale (bovenste) oppervlak van de kelk. Deze nectaire eigenschap wordt gecontroleerd door één genlocus¹². Studies van twee onafhankelijke onderzoeksgroepen identificeerden dat de nectaire eigenschap wordt gecontroleerd door één gen, Ne1 van het A-genoom of Ne2 van het D-genoom, gemapt op chromosomen 12 en 26, respectievelijk^12,13. Deze eigenschap komt alleen tot uiting in een dubbel recessieve conditie, wat betekent dat alleen een homozygote recessieve conditie de nectariose eigenschap zal uitdrukken.

Naast deze genen spelen omgevingscondities en groeistadia een rol bij het reguleren van de mate van expressie. Daarom moet er een nauwkeurige methode zijn om deze eigenschap te scoren. De huidige studie richt zich op de fenotypering van blad- en bracteale nectaria in katoen. Planten met zichtbare nectarproducerende nectaria worden als nectaried beoordeeld, terwijl planten die deze eigenschap missen als nectariless worden beoordeeld^als 1,2,3,4. Het hoofddoel van dit artikel is het presenteren van nauwkeurige beoordelingsmethoden voor de nectaire eigenschap met behulp van digitale microscopietechnologie. Traditionele scoring door directe visuele observatie kan niet gemakkelijk verschillen in de expressievariatie van de nectaire eigenschap in situ met het blote oog detecteren. Deze subtiele verschillen in expressies van nectaire eigenschappen kunnen worden gevisualiseerd met digitale microscopie. Ter illustratie: in katoenbladnectarium volgt de beoordelingsrubriek een standaardschaal van 1-4, waarbij 1 geen nektarium aangeeft, 2 een uitstulping op het venotype, 3 onderontwikkelde kussens of ribbels zonder nectar, en 4 volledig gevormde/volledige nectaria met heldere kussens en richels¹³. Deze fenotype-score werd gemaakt met behulp van digitale beelden van de bladnectaria [met digitale beelden van de abaxiale (onderzijde) van de bladmiddennerf]. In het algemeen wordt de afwezigheid van nectaria als 0 beoordeeld, maar voor statistische significantie kan de waarde 0 niet worden gebruikt en vervangen door de waarde 1. Daarom werd het fenotyperingsbereik aangepast naar 1-4 van de gestandaardiseerde classificatie 0-4¹³. De beoordelingsrubriek voor bloemen volgt een vergelijkbaar scorepatroon van 1-4, waarbij 1 nectariless vertegenwoordigt, geen opvallende klieren zonder kussentjes of ribbels, 2 voor verduisterde klieren waarbij nectaria slechts subtiele padmarkeringen hebben en geen nectar, 3 voor slecht gevormde klieren met vage of afwezige ribbels en/of kussentjes, en 4 voor volledig gevormde nectaria met nectar. Dit scoresysteem toont 4 voor nectarie-fenotypes (homozygoot/heterozygoot dominant voor één van de genen), 3, 2 voor differentiële expressie van nectaire eigenschap zoals bij heterozygoot, en 1 voor nectariose (homozygoot recessief voor beide genen).

Evenzo worden bloemen verzameld en ontleed zoals stap voor stap beschreven in dit artikel om digitale afbeeldingen te verzamelen voor het scoren van bracteale nectaria's. Dit fenotype kan met de microscoop worden gevisualiseerd voor nauwkeurige scores, die kunnen worden opgeslagen in de vorm van digitale beelden. Bij katoen trekken nectaire eigenschappen niet alleen bestuivers aan, maar trekken ze ook plagen aan die opbrengstverlies veroorzaken¹⁴. Om dit probleem op te lossen, selecteerden veredelaars planten zonder nectarie-eigenschappen (nectariose) als alternatief om plagen op natuurlijke wijze te bestrijden zonder gebruik van chemische pesticiden^9,15. De nectariose eigenschap werd oorspronkelijk geïntroduceerd uit Gossypium tomentosum aan Gossypium hirsutum (gecultiveerde Upland-katoen)⁸. Deze beoordelingsmethode is vooral nuttig om de segregatie van nectariless trait in populaties te identificeren die ontstaan door het kruisen van nectarieloze ouders met nectariose ouders. Als gevolg van deze kruisingen van diverse ouders, F₂ (Tweede Filiale Generatie) vertoont verschillende genotypen van homozygoot nectaried, heterozygoot nectaried en homozygoot nectariose. Slechts één dominant gen is nodig voor de expressie van nectaire eigenschappen, wat volgt op de segregatieverhouding van 15:1 (9:3:3:1). Daarom zal 1 op de 16 het nectariloze kenmerk uitdrukken in homozygote recessieve conditie met genotype ne1ne1ne2ne2. Onderzoekers in fokprogramma's observeerden echter meer nectariless lijnen dan de verwachte verhouding van 1 op 16. Dit betekent dat de nectaire eigenschap tot expressie komt wanneer de genen worden uitgedrukt als Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Het diverse patroon van expressie van nectaire eigenschappen in dergelijke populaties van homozygote nectaried (Ne1Ne1Ne2Ne2), heterozygoot nectaried (Ne1ne1Ne2ne2), en homozygoot nectariless (ne1ne1ne2ne2) planten perfect worden beoordeeld door de veranderingen te detecteren die in de digitale beelden worden gezien.^12,13. Omdat heterozygote planten met verminderde nectarie mogelijk geen nectaire eigenschap visueel vertonen en kunnen lijken op de nectariose eigenschap zonder nectarium, vormt de visuele fenotypering uitdagingen bij de betrouwbare selectie van deze eigenschap. Deze problemen verergeren in het late groeiseizoen, wanneer nectaria niet aanwezig zijn in bepaalde katoenrassen. Verschillen tussen heterozygote planten en homozygote nectariose planten zijn gemakkelijk te detecteren met digitale beeldvorming, aangezien heterozygote planten kleine of gereduceerde nectaria kunnen vertonen, terwijl homozygote planten dit kenmerk volledig missen. Fenotypisch wordt de aanwezigheid van nectaria geclassificeerd als nectaried (homozygoot/heterozygoot met ten minste één dominant gen), de aanwezigheid van kleine of rudimentaire nectaria als heterozygoot, en de afwezigheid van nectaria als homozygoot nectariose planten. Digitale beeldscores verminderden de onnauwkeurige beoordeling van heterozygote planten als nectariose planten. Evenzo wordt de middenbloeifase geprefereerd wanneer er maximale expressie van de eigenschap is. Daarom werden in deze fase blad- en bloemmonsters verzameld om deze fenotyperings-scoringsexperimenten uit te voeren voor een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van nectaire eigenschappen. Bovendien voorkomt of vermindert visualisatie van nectaire eigenschappen met digitale microscopie vals-positieven van populaties zonder nectaire eigenschappen. Deze fenotypische scoring van de nectarie-eigenschap wordt ook gebruikt in kaartstudies om DNA-markers te identificeren die geassocieerd zijn met nectariless eigenschap, die fokkers kunnen gebruiken voor marker-assisted selection (MAS) van de nectariless eigenschap¹³. Deze puntentellingstechniek kan worden uitgebreid naar andere plantensoorten, naast het bestuderen van andere eigenschappen zoals klieren, haren en kleur. Over het algemeen lost digitale beeldscore niet alleen het probleem van onnauwkeurige nectaire eigenschappen op door beelden met hoge resolutie te leveren, maar identificeert ook subtiele veranderingen in expressie en slaat de digitale beelden op voor toekomstig gebruik. Katoen met nectariless eigenschap kan worden gebruikt voor biologische bestrijding van plagen, naast het beantwoorden van onderzoeksvragen over hoe deze eigenschap gunstige interacties tussen insecten bevordert.

Protocol

1. Kassen-/veldbemonstering van bladeren (Figuur 1)

1. Maak voorbeeldzakjes met ziplock-posjes klaar met voorbeeldidentificaties. Bewaar monsterzakken op kamertemperatuur tot gebruik.
2. Zet de koelbox een dag voor het monsterafnemen in de koelkast. Leg een ijspak uit de vriezer onderin de koelbox. Leg een plastic bakje op het koelpak in de koelbox.
   OPMERKING: Elke draagbare koeler kan hiervoor worden gebruikt. Plaats het ijspak in de koelbox en daarna een plastic bakje (deze scheiding voorkomt bevriezingsschade, die ontstaat door direct contact van het monster met ijs) voordat je de koeler naar de verzamelplaats vervoert.
3. Vervoer koelbox en gelabelde ziplockzakken naar de kas/veld voor het verzamelen van monsters. Er werden regelmatig gesproeid voor veldplanten om plaagvrije monsters te verzamelen. Evenzo werden voor kasplanten regelmatige sproei- en mestschema's gevolgd voor gezonde planten.
4. Verzamel jong bladweefsel uit een individuele kas van 8 tot 12 weken oud of uit het veld gekweekte katoenplanten in de gelabelde monsterzakken.
   1. Kies de middenbloeifase voor monsterselectie vanwege de hoogste expressie van de nectaire eigenschap in dit stadium. Selecteer jonge bladeren van alle planten in deze ontwikkelingsfase. Naast genetische en omgevingsfactoren wordt de nectaire eigenschap ook beïnvloed door de ontwikkelingsfase.
   2. Om het ontwikkelingsstadium constant te houden voor vergelijking van verschillende genotypen binnen de_F2-populatie , verzamel je bladmonsters uniform in één stadium om de vergelijking tot dit stadium te beperken. Gebruik de bladgrootte van 5 tot 7 cm als maatstaf, maar jonge bladeren van dezelfde grootte kunnen uit alle monsters worden verzameld. Oude bladeren tonen expressie van nectaire eigenschap, maar in sommige lijnen zal deze eigenschap niet meer tot uiting komen in latere ontwikkelingsstadia. Om deze variatie te voorkomen en de consistentie van gegevensverzameling te verbeteren, volg deze instructies bij het verzamelen van monsters.
5. Verzamel het bladweefsel en plaats het in de betreffende monsterzak. Verzamel minstens 2 bladeren per plantmonster.
6. Voor bladweefsel kies je gezonde bladeren van 5 tot 7 cm over het bladblad vanaf de bovenste tak van de plant.
   OPMERKING: Jonge bladeren die op de bovenste takken aanwezig zijn, hebben de voorkeur voor alle monsters. Dit type monsterafname beperkt de bemonstering niet alleen tot een specifieke ontwikkelingsfase, maar vermindert ook fouten in fenotypering door het type monster constant te houden. Andere parameters zijn gemakkelijke toegang en gezonde bladeren. Consistente gegevensvergelijking zal worden gemaakt wanneer meerdere bladeren van planten uit dezelfde ontwikkelingsfase worden verzameld om genotype-gebaseerde fenotypische verschillen in de populatie te identificeren.
7. Plaats elke afgesloten monsterzak bij het bladweefsel in de koelbox. Breng de koelbox naar het lab.
8. Breng individuele monsters over naar de koelkast om koelomstandigheden van 4 °C te behouden. Bewaar monsters in de koelkast tot digitale beeldvorming van de nectarium. Bladeren kunnen tot 2 dagen worden bewaard voor digitale beeldvorming, maar het is de voorkeur om foto's dezelfde dag of de volgende dag te maken.
9. Voor het screenen van een groot aantal bladmonsters verzamel je monsters in batches om de beeldvorming af te ronden binnen een tijdslot van 1 dag na het oogsten. Verzamel monsters in batches van 10-20 of gebruik meerdere koelers om weefselbeschadiging of het vouwen van het weefsel te voorkomen. Er moet voorzichtig worden geacht met het verzamelen van monsters voor goede digitale beelden.

2. Kassen/veldmonsters van bloemen (Figuur 1)

1. Volg stappen 1.1 tot 1.6. Verzamel bloemen uit een kas van 8 tot 12 weken oud of uit een veldgekweekte katoenplant. Verzamel minstens 2 bloemen per plantmonster.
   1. Verzamel bloemen, meestal van de bovenste takken wanneer de planten midden in de bloeifase zitten. De nectaire eigenschap vertoont de hoogste expressie in het midden van de bloeiperiode.
2. Kies gezonde bloemen. Plaats elke afgesloten monsterzak met minstens twee bloemen in de koelbox. Breng de koelbox naar het lab.
3. Breng individuele monsters over naar de koelkast om koelomstandigheden van 4 °C te behouden. Bewaar monsters in de koelkast totdat de bracteale nectaria digitaal worden afgebeeld.
   1. Verwerk monsters op dezelfde dag of de dag erna na het afnemen. Verzamel bloemmonsters, bewaar ze op 4 °C en verwerk bracteale nectaria op dezelfde dag. Verzamel bloemen die later de volgende dag of later in de week worden geproduceerd en verwerk diezelfde dag voor digitale beeldvorming van bracteale nectarieën.

3. Digitale microscoop initiële opstelling (Aanvullende Figuur 1)

OPMERKING: Andere vergelijkbare microscopen kunnen worden gebruikt voor het digitaal vastleggen en opslaan van beelden.

1. Zet de microscoop (VHX 600) aan en voltooi de eerste stappen. Leg een half gevouwen A4-wit vel dat overeenkomt met de grootte van het microscooppodium.
2. Stel het licht op het microscoopplatform/podium af met de kleine lichtknoppen op de console controller.
3. Draai de lichtschakelaar (kleine knop op de console) op maximaal voor maximaal licht en de helderheidsschakelaar (grote knop op de console) op medium hoog door de knop van de console driekwart van de weg te draaien.
4. De ingebouwde VHX 600-software toont opties om de lens aan te passen op het computerscherm. Stel de lens in op 10x vergroting door op het scherm de optie 10x lens te selecteren. Zet de aan/uit-schakelaar van de monitor op het voorscherm van de computer aan en het hoofdmenu verschijnt, dat opties toont voor lens- en opnamebeeldopties.
5. Neem een klein aantal monsters (3 tot 5) uit de koelkast mee in de koelbox voor digitale beeldvorming. Plaats de koelbox met monsters naast de microscoop.
6. Houd de snijplank en het steriele mes op de bank dicht bij de microscoop. Pak een monster uit de koelbox en haal het weefsel eruit om digitale beeldvorming te kunnen doen (Figuur 1).

4. Bladnectarium digitale beeldvorming en scores (Figuur 2)

1. Volg stap 1 en 3. Open de ritssluitzak van het monster en leg het bladmonster op de snijplank. Snijd de bladsteel van het blad door met een steriel mesje.
   OPMERKING: Voor veilig gebruik van de mesjes, draag handschoenen en houd de scherpe randen van het mes van je vingers af, waarbij het weefsel tussen de vingers wordt geplaatst tijdens het maken van incisies.
2. Breng het bladweefsel over op het voorgesneden witte vel dat op het podium is geplaatst. Draai het bladweefsel in het midden van de microscoopfase om met de abaxiale zijde naar boven.
3. Focus op de middennerf van het blad door de grove en fijne afstellingen van de microscoopknoppen zachtjes te draaien. Blijf aanpassen totdat er geen wazigheid meer in het beeld is.
4. Omdat de nectarium zich aan het onderste uiteinde van de middennerf bevindt, houd deze gecentreerd waar de middennerf en de latere aders uit elkaar lopen. Houd het blad gecentreerd en gefocust op het podium.
   OPMERKING: Er wordt slechts één bladnektariër waargenomen in gedomesticeerde katoen, terwijl wilde types drie nectaria tonen, één op de middennerf en één op elke laterale ader aan weerszijden van de middennerf (totaal aantal nectaria :3).
5. Stel de grove en fijne afstellingen van de microscoop aan om de helderheid van het digitale beeld te verbeteren. Maak alle beeldaanpassingen om de nectarieafbeelding van het blad vast te leggen en op te slaan.
   1. Om lichtreflectie op het digitale beeld te voorkomen, doe je alle lampen uit en neem je de afbeelding op op het computerscherm. Doe alle lichten in de kamer uit en gebruik een tafellamp om elk monster te verwerken. Nadat alle stappen zijn uitgevoerd, doe je de lamp uit en laat je alleen het microscooplicht aan en neem je het beeld op.
6. Sla de afbeelding op zodra het programma een venster toont met verschillende opties om op te slaan. Sla de afbeelding op (door elke afbeelding te labelen) met het ID-nummer van het monster. Beoordeel het digitale beeld van het blad van de nectarium als 1, 2, 3 en 4 op basis van het fenotype van de nectarium. Werk je scoresheet bij voor elke voorbeeld-ID.

5. Digitale beeldvorming en scoren van de bracteale nectarium (Figuur 3)

1. Volg stap 2 en 3. Een klein aantal bloemmonsters (2-3) overbrengen voor beeldvorming. Haal het bloemmonster uit de ziplockzak.
2. Verwijder schutbladeren van de bloem met pincetten of handmatig met de hand. Leg de bloem op de schone snijplank. Gebruik een steriel mes om de steel van de bloem af te snijden. Gebruik een steriel mes om een rechte incisie te maken langs de rand van de verwijderde schutbladen.
3. Plaats het weefsel ondersteboven (met de bladsteel naar boven) op het voorgesneden witte vel dat op het microscooppodium ligt.
4. Gebruik grove en fijne aanpassingen om de helderheid van het beeld op het scherm te verbeteren. Maak alle beeldaanpassingen en klik op de opnameknop op de consolecontroller om het beeld van het blad vast te leggen.
   1. Maak beeldaanpassingen door de kleine knop/lichtschakelaar op maximaal te zetten en de grote knop/helderheidsschakelaar op medium hoog (door de knop op 3/4 te^draaien). Verbeter vervolgens de resolutie van het beeld door de grove en fijne afstellingen van de microscoop te draaien. Houd deze aanpassingen constant en wissel van samples totdat beelden zijn opgenomen voor de volledige set samples. Om lichtreflectie op het digitale beeld te voorkomen, schakel je alle lichten uit en neem je het beeld op op de computer.
5. Vervolgens verschijnt er een venster met alle computerlocaties om de afbeelding op te slaan. Sla de digitale afbeelding op in de computer met het ID-nummer van het monster.
6. Geef de bracteale nectaria (Aanvullende Figuur 2) een score van 1, 2, 3 en 4 op basis van het fenotype dat in de verworven digitale beelden is waargenomen. Werk het scoreblad bij met voorbeeld-ID en de bijbehorende score voor toekomstige analyse

Results

Katoenplanten die 8 tot 12 weken in het veld zijn gekweekt, werden geselecteerd voor deze studie. Er werden per weefseltype minstens twee technische replicaten verzameld. Gezonde jonge bladmonsters worden verzameld van de bovenste takken met bladbladen van 5 tot 7 cm lang. Gezonde bloemmonsters worden verzameld van open bloemen of bloemknoppen die op dezelfde dag opengaan. Blad- en bloemmonsters werden uit het veld verzameld van verschillende plantenlijnen, en digitale beelden werden in het laboratorium voor beide weefseltypen gemaakt met behulp van een microscoop (Figuur 1). Alle stappen werden gevolgd zoals hierboven beschreven in de procedure van monsterafname tot beeldvorming (zoals uitgelegd in Figuur 2 en Figuur 3). De representatieve resultaten voor zowel blad- als bracteale nectaria tonen doorgaans de afwezigheid van nectarium (1), de aanwezigheid van nectaria met intermediaire fenotypes (2, 3), en een volledig ontwikkelde nectaria die nectar produceert (4). De gegevens die in Figuur 4 worden gegenereerd, zijn de digitale beelden die zijn verkregen van twee verschillende katoenplanten (nectaried en nectariless). Resultaten van de digitale beeldscores van het abaxiale blad (aan de onderkant van de middennerf) toonden twee fenotypen met scores: 1 (zonder nectaria op de middennerf) en 4 (met volledig ontwikkelde nectarium met nectar); Figuur 4A,B). Evenzo toonden bloemmonsters die werden geanalyseerd op bracteale nectaria's, twee fenotypen: 1 (zonder nectarium) en 4 (volledig gevormde nectaria die nectar produceert; Figuur 4C,D). Idealiter volgen zowel bladeren als bloemen die van dezelfde plant worden verzameld hetzelfde patroon, wat betekent dat het nectariose blad en de nectariose bloem tot één plant behoren, terwijl het nectarieloze blad en de nectarieloze bloem tot dezelfde plant behoren. Figuur 5 is gemaakt door digitale beelden te verzamelen van zowel blad- als bracteale nectaria van nectarie-gevoede planten op 10x, 20x en 40x om nectariekenmerken duidelijk te visualiseren. Verder werden bladweefsels verzameld uit een van deze populaties en digitale afbeeldingen voor elk bladnectariummonster om te begrijpen hoe deze score wordt gegeven bij het segregeren_van F2-populaties van nectarie- en nectarieloze ouders. Geselecteerde digitale bladafbeeldingen die overeenkomen met de standaardscores van 1, 2, 3 en 4 zijn gemarkeerd in Figuur 6¹³. Het veelvoorkomende en gemakkelijk te identificeren patroon is het ontbreken van nektarisch en de aanwezigheid van nectarium. De afwezigheid van nektariër krijgt de laagste score, terwijl een volledig ontwikkelde nektariër de hoogste score van 4 krijgt. Het bereik van scores tussen 1 en 4, namelijk 2 en 3, is onderontwikkeld en kleiner dan gewone nectaria's. Dit patroon is waarneembaar bij homozygote nectarilesse, wat 1 (afwezige), heterozygote toestand is, zoals bij 2 en 3 scores (gereduceerde nectaria) en 4 (volledig ontwikkelde) nectaria. Daarnaast kunnen nectarie- en nectarieloze ouderlijnen samen met populaties worden gekweekt om deze verschillen te vergelijken en te begrijpen.

Figuur 1: Overzicht van visualisatiestappen voor blad- en bracteale nectaria's, beginnend bij bemonstering tot digitale microscopie. (A) Selecteer katoenplanten in het middenbloeistadium voor zowel blad- als bloemmonsterverzameling. (B) Verzamel bladmonsters uit het veld om nectaire eigenschappen op het blad te observeren. (C) Draai het blad zodat de abaxiale zijde van het blad naar boven wijst en observeer de nectaire eigenschap in het gemarkeerde zwarte doosgebied. (D) Plaats het blad op het microscooppodium en houd de focus in het gemarkeerde zwarte doosgebied voor het vastleggen van digitale beelden van het bladnectarium. (E) Verzamel bloemen in de middenbloeifase van het veld (A). (F) Maak een incisie door de bloem op een snijplank te plaatsen en in een rechte lijn in het witte doosgebied in de richting van de pijl te snijden, waarbij de basis van de bloem wordt gescheiden. (G) Plaats het ingesneden gedeelte op het microscooppodium voor digitale beeldvorming van de bracteale nectaria. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stapsgewijze procedure voor digitale beeldvorming en het scoren van de bladnectaria in katoen. 1. Verzamel bladmateriaal uit het veld in gelabelde monsterzakken en plaats het in een koelbox 2. Breng de koelbox met monsters naar lab 3. Haal losse monsters uit de koelbox 4. Open het individuele monsterzakje en haal blad 5 eruit. Snijd de bladsteel van het blad handmatig of gebruik een mes. 6. Plaats het blad op het vooraf ingestelde microscooppodium met de abaxiale (onderste) zijde naar boven gericht 7. Stel de zoom in het computerscherm VHX 600-programma in op 10x. Stel grove en fijne aanpassingen van de microscoop aan voor de beste resolutie van het beeld. 8. Kijk naar het computerscherm voor eventuele aanpassingen van het beeld dat op het computerscherm wordt waargenomen (stel licht en helderheid aan met kleine en grote knoppen door deze knoppen te draaien, gebruik fijne en grove knoppen op de microscoop voor de beste beeldresolutie, en schakel andere lampen uit om reflectie te verwijderen, enz.) in de bladnectarium 9. Bewaar de digitale afbeelding voor de score. Streepcirkel rond het nektarium in het blad benadrukt het gebied van bladnektarium in afbeeldingen 8 en 9. Bekijk bladnektarien onder de microscoop met een vergroting van 10x (100 μm). Er wordt slechts één bladnectarie waargenomen in huiskatoen (zoals te zien is op deze afbeelding). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Stapsgewijze procedure voor digitale beeldvorming en het scoren van de bracteale nectaria in katoen. 1. Verzamel bloemmonsters uit het veld in de gelabelde monsterzakken en bewaar ze in de koelbox 2. Haal één monster uit de koelbox 3. Haal één bloem eruit 4. Verwijder schutbladen handmatig door ze weg van de bloem af te knippen 5. Maak een incisie met een steriel mes door langs de rand van het bracteale blad in een rechte lijn te snijden (witte doos in Figuur 1 voordat digitale beeldvorming van bracteale nectaries wordt uitgevoerd) 6. Draai de ingegraveerde sectie 7 om. Plaats het ingesneden gedeelte met de bladsteelzijde naar boven op het podium van de microscoop fase 8. Maak lichtaanpassingen met de licht- en helderheidsschakelaars op de console die aan de microscoop is bevestigd. Gebruik grove en fijne afstellingen op de microscoop om beelden met goede resolutie te maken. Alle beelden worden waargenomen onder een microscoop met 10x (100 μm) vergroting. Verzamel digitale afbeeldingen om de bracteale nectaria te scoren. Cirkels in de digitale afbeeldingen van brakeale nectarium benadrukken de aanwezigheid van nectaria, en er zijn 3 bracteale nectaria in huishoudelijk katoen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Digitale afbeeldingen van katoenbladnectarium en bracteale nectaria. (A) Blad met nektarium; (B) Blad zonder nektarium; (C) Bloem met 3 bracteale nectaria's, en (D) Bloem zonder bracteale nectaria. Bekijk zowel blad- als bloemennektarien onder een microscoop met 10x (100 μm) vergroting. Streepcirkels tonen de aanwezigheid en afwezigheid van nectarium in bladnectaria en bracteale nectaria. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Blad- en bracteale nectaria werden 10x, 20x en 40x ingezoomd voor duidelijke identificatie van nectaria in digitale beelden. (A) Verzamel bladmonsters om het nectariumtrekk op de middennerf te observeren. (B) Observeer de bladnectarium op de middennerf onder de microscoop bij 10x vergroting. (C) Observeer de bladnectarium op de middennerf onder de microscoop bij 20x vergroting. (D) Observeer de bladnektariër op de middennerf onder de microscoop bij 40x vergroting. (E) Incise-bloemsectie voor bracteale nectaria. (F) Observeer bracteale nectaria onder een microscoop met 10x vergroting. (G) Observeer bracteale nectarieën onder microscoop bij 20x vergroting. (H) Observeer bracteale nectaria onder een microscoop met 40x vergroting. Schaalbalken op elke afbeelding geven de vergroting weer waarmee de bladnectarium of bracteale nectariumafbeeldingen zijn genomen (zoals hier weergegeven als 10x, 20x en 40x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Standaard scorepatroon van bladnektarijn volgens patronen van 1, 2, 3 en 4. (A) Bladmonster zonder nektarijn zoals gemarkeerd in de gestippelde cirkels (Score 1 voor afwezigheid van nektarijn). (B) De waargenomen kleine bladnektariër toont een patroon van een van de heterozygote aandoeningen (gestreepte cirkelafbeelding van nektariër met een score van 2). (C) Bladnektaris met score 3, een ander patroon van de heterozygoot. (D) Volledig gevormde nectaria met een score van 4. Schaal 10x geeft de vergroting aan waarmee de beelden zijn genomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bladnektariërs en brakacteale nectaria zonder gebruik van een microscoop. De afbeelding toont hoe nectaria eruitzien met traditionele inslag. Deze figuur is aangepast van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Mogelijke genotypen van de populatie De figuur toont genotypen van de F 2-populaties die voortkomen uit een kruising van diverse ouders, nectaried en nectariless. Deze tabel is aangepast van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Opstelling van digitale microscoop. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Verschillend aantal waargenomen bracteale nectaria's. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Nectaria zijn gespecialiseerde kliervormige trichomen die nectar produceren in planten voor succesvolle kruisbestuiving. Zowel vegetatieve als reproductieve nectaria zijn aanwezig in planten. Het geslacht Gossypium (katoen) kent meer dan 50 soorten, waarvan de meerderheid¹⁶ bladnectarieën bevat. Deze eigenschap in katoen trekt echter ook plagen aan, wat leidt tot extra opbrengstverliezen¹⁷. Fokkers selecteerden natuurlijk bestaande nectariless eigenschappen (afwezigheid van nectaria's) die voor het eerst bij G. tomentosum werden ontdekt om dit probleem op te lossen. Om deze reden introduceerden ze deze nectariloze eigenschap in gecultiveerde hooglandkatoen^. Uiteindelijk werden verschillende populaties gegenereerd door het selecteren van nectaried- en nectarilesse lijnen als ouders. Aangezien homozygote nectariless en heterozygote nectariless populaties geen verschillen vertonen wanneer ze met het blote oog worden waargenomen, is er een speciaal hulpmiddel nodig om deze planten te onderscheiden. Daarom visualiseert deze beoordelingsmethode met digitale microscopie, in tegenstelling tot traditionele scoring (zoals weergegeven in Figuur 7), niet alleen verminderde nectari's, maar voorkomt ook onnauwkeurige beoordeling van heterozygote nectariless planten als homozygote nectariless planten.

De fenotypische scoring met behulp van digitale beelden is afhankelijk van verschillende belangrijke factoren, zoals het specifieke tijdstip van monsterafname, selectie van het monster, het gebruik van een standaard score-schaal voor blad- en bracteale nectaria, mogelijk genotype en hoe de scoregegevens kunnen worden geïnterpreteerd voor latere toepassingen. Allereerst is het belangrijk om bladeren en bloemen te verzamelen tijdens het groeiseizoen, wanneer de nectariaafscheiding het hoogst is, meestal halverwege de bloeiperiode in juli. Ten tweede speelt de selectie van bladeren of bloemen op de juiste grootte en stadium een cruciale rol bij het scoren van het fenotype. Voor bladeren werden bovenste takken met bladbladen van 5 tot 7 cm lang geprefereerd voor het scoren van bladnectaris. Evenzo werden voor het scoren van bracteale nectaria gezonde bloemen van de bovenste takken gekozen. Steekproefselectie in specifieke ontwikkelingsstadia zal helpen, zelfs bij het vergelijken van alle planten binnen een populatie door ontwikkelingsfase-afhankelijke eigenschappen uit te sluiten (zoals weergegeven in Figuur 8). Om te controleren of de scoreing herhaalbaar is, werden digitale beelden gemaakt voor ten minste twee monsters per weefsel per plant. Het verzamelen van meerdere replicaties van dezelfde plant helpt bij consistente gegevensverzameling.

De mogelijke beperking van de methode is het behouden van ongediertevrije planten tot het verzamelen van monsters. Ongediertebesmettingsgebieden kunnen worden geïdentificeerd aan plekken met weefsels of eieren die in het weefsel zijn gelegd of aan schade aan de nectariumgebieden met zwarte gebieden zonder zichtbaar zicht op nectarie vanwege hun consumptie door bladluizen of andere insecten. Dit werd waargenomen tijdens het screenen van honderden monsters. In zulke gevallen werden gezonde bladeren en bloemen opnieuw verzameld en geanalyseerd voor consistente gegevens uit die monsters. Dit kan worden opgelost door regelmatige ongediertebestrijdingsschema's aan te houden en meststof aan te vullen om gezonde planten te krijgen. Het volgen van alle kritieke stappen zoals beschreven helpt bij het oplossen van problemen met fenotypescore.

Deze techniek heeft verschillende toepassingen, zoals mapping om DNA-markers te identificeren die fokkers helpen genotypen te identificeren voor marker-ondersteunde selectie. Deze fenotype-score vereist bevestiging via DNA-markers vanwege de invloeden van het milieu en de ontwikkelingsfase, naast de genen die deze eigenschap aansturen. Daarom zal het fenotyperen van deze eigenschap met digitale microscopie een startpunt zijn om een groot aantal planten van verschillende populaties te beperken tot een klein aantal vermoedelijke nectariloze lijnen. Met behulp van DNA-markers worden deze lijnen verder gevalideerd voor gebruik in veredelingsprogramma's om nectariose, door eigenschappen gemedieerde ziekteresistentie te ontwikkelen in nieuw ontwikkelde variëteiten. Deze methode kan onderzoekers ook helpen de rol van de nectaire eigenschap bij planten en gunstige interacties met insecten te begrijpen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Microscope	Keyence VHX	VHX 600	Other Microscopes can be used
Farberware cutting board	Farberware	Model no. 78892-10	14''L X 11''W X 0.5''Th, Any brand can be used, this one is available at amazon.com
Igloos Laguna small 9 QT cooler	Igloo	Part number 00043567	Any brand/ Any size based on the project need can be used
Plastic bags (400 pcs), 3 X 4 inch	Aubeco brand	NA	4''L X 3''W X 0.01''H, Any brand can be used, preferred plastic clear colored ones
Single  Edge Razor Blades, 100 pack	Weupe	NA	Any brand can be used, this one is available at amazon.com