Biologische standaardisatie van menselijke ASC-gebaseerde biofabricage voor reproduceerbare macroschaalweefselconstructies

Samenvatting

Deze studie presenteert een reproduceerbare biofabricageworkflow met behulp van vet-afgeleide stamcelsferoïden en 3D-geprinte GelMA-steigers. Het toont ruimtelijke controle, fusiecapaciteit en kwaliteitscontrole, wat resulteert in transplanteerbare macroschaal weefselconstructies met potentiële toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.

Samenvatting

Het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen tussen laboratoria vormt een aanzienlijke belemmering voor de vergelijkbaarheid van experimentele uitkomsten en de efficiënte overdracht van biofabricagetechnologieën. Rigoureuze biologische standaardisatie verbetert niet alleen de reproduceerbaarheid, maar faciliteert ook de afstemming met nationale en internationale regelgevende kaders, die essentieel zijn voor de klinische vertaling van weefseltechnologiestrategieën. Deze studie introduceert een gestandaardiseerde biofabricageworkflow bestaande uit monolaagcultuur van hADSC's, sferoidvorming, 3D-printen van Gelatin Methacryloyl (GelMA) steigers en sferoide bioassemblage. Kwaliteitscontrole-indicatoren werden geïntegreerd om reproduceerbaarheid te waarborgen. De 3D-geprinte GelMA-steiger was ontworpen met twee centrale poriën, elk geschikt voor honderden sferoïden. De printkwaliteit werd bevestigd door de afmetingen van de steigers te vergelijken met het CAD-model, met kleine niet-significante afwijkingen. hADSC's vormden uniforme sferoïden binnen 24 uur in agarose-micromallen. Wanneer ze in scaffoldporiën werden gezaaid, ondergingen sferoïden een continue fusie gedurende 72 uur, waarbij macroschaalconstructies ontstonden die bevestigd zijn door confocale beeldvorming. Steigerontwerp en druknauwkeurigheid zorgden voor structurele ondersteuning, terwijl de uniformiteit van de sferoiden een voorspelbare vorming van de constructie mogelijk maakte. De fusie van sferoïden binnen de scaffoldporiën leverde weefselconstructies op die geschikt waren voor transplantatie, met of zonder de steiger, wat de veelzijdigheid van deze bioassemblage-benadering benadrukt. De bevindingen benadrukken de cruciale rol van biologische standaardisatie bij het bevorderen van reproduceerbare methodologieën voor de biofabricage van levende weefselconstructies, met veelbelovende implicaties voor toekomstige klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

Bioassemblage en bioprinting zijn complementaire biofabricagemethoden in weefseltechnologie die zich richten op het construeren van complexe weefsels en organen op macroschaal met behulp van geautomatiseerde technologieën 1,2,3,4.

Sferoïden werden in biofabricage geïntegreerd als bouwstenen, voornamelijk voor bioassemblagebenaderingen⁵. Sferoïden worden beschouwd als microweefsels die interacties tussen cellen en de omliggende micro-omgeving in vivo reproduceren. Onder de celbronnen die worden gebruikt voor de vorming van de sferoiden, vallen adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's) op door hun gemakkelijke isolatie, langdurige kweekbehoud en differentiatiepotentieel ^6,7,8.

Door hun intrinsieke vermogen om grotere aggregaten te vormen, kunnen sferoïden complexere weefselconstructies genereren wanneer ze worden blootgesteld aan bioassemblage-methoden. Deze fusiegedreven organisatie vergroot het regeneratieve en differentiatiepotentieel van stamcelsferoïden ^9,10.

Spheroïde bioassemblage kan worden ondersteund of zelfs geleid worden door biomaterialen¹¹, waardoor deze strategie geschikt is voor schaalbare en geautomatiseerde biofabricage^12,13.

Bestaande biofabricagestrategieën kunnen globaal worden onderverdeeld in scaffold-vrije sferoidassemblagemethoden en hydrogel-ingebedde bioprintsystemen ^2,5,14. Scaffold-vrije methoden zijn uitsluitend afhankelijk van spontane cellulaire zelfassemblage en inter-sferoïde fusie, waarbij intrinsieke cel-cel interacties worden benut. Omdat ze echter voorkomen zonder externe architectonische leiding of geometrische afsluiting, vertonen deze benaderingen minder ruimtelijke controle en een lagere structurele voorspelbaarheid ^5,15. Daarentegen benadert hydrogel-gebaseerde encapsulatie het inbedden van cellen in bulkmatrices om structurele ondersteuning en vooraf gedefinieerde architectuur^{te bieden 16,17}, wat direct cel-celcontact tijdens vroege fusiestadia gedeeltelijk kan beperken en de celmigratiedynamiek kan beïnvloeden¹⁸. In dit kader presenteren afdrukbare biomaterialen zoals Gelatinemethacryloyl (GelMA) celadhesiemotieven en kunnen ze fungeren als steigers om de bioassemblage van sferoïden¹⁹ te vergemakkelijken. Er wordt verondersteld dat een 3D-geprinte GelMA-steiger geometrische opsluiting en ruimtelijke leiding biedt voor sferoïden, waardoor gecontroleerde weefselvorming door fusie in grotere, structureel gedefinieerde constructies wordt bevorderd. Deze benadering heeft als doel ruimtelijke controle en structurele reproduceerbaarheid tijdens sferoïde bioassemblage te verbeteren door scaffold-geleide organisatie te combineren met sferoïde fusie binnen een gedefinieerde hydrogelarchitectuur. De huidige workflow richt zich echter op processtandaardisatie en structurele biofabricageparameters en richt zich niet op langdurige weefselrijping, functionele differentiatie of grootschalige geautomatiseerde productie.

Biologische standaardisatie is niet alleen essentieel om reproduceerbaarheid en schaalbaarheid te waarborgen, maar ook om de functionele integriteit van biofabriceerde weefsels te behouden^19,20. Daarom is nauwkeurige controle van technische, geometrische en structurele parameters cruciaal, aangezien deze factoren direct invloed hebben op de biologische prestaties, waaronder weefselfunctie en rijping ^5,21. Er wordt een gestandaardiseerde en reproduceerbare biofabricageworkflow gepresenteerd, bestaande uit de volgende belangrijke stappen: (1) ASC-monolaagcultuur; (2) ASC-sferoïde formatie; (3) 3D-printen van de GelMA-steiger; en (4) sferoide bioassemblage (Figuur 1). Binnen deze workflow werden objectieve kwaliteitscontrolemetrics vastgesteld, waaronder sferoiduniformiteit en -sfericiteit, printkwaliteit en integriteit van de steigervorm.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van agarose-micromallen en fabricage van GelMA 3D-geprinte steigers

1. Productie van de 2% agarose microschimmel in 0,9% natriumchloride (NaCl) oplossing (zie Figuur 2A)
   OPMERKING: Al het chemisch afval moet worden behandeld en afgevoerd in overeenstemming met institutionele chemische veiligheidsvoorschriften en richtlijnen voor gevaarlijk afval.
   1. Bereid een 0,9% NaCl-oplossing voor in ultrazuiver water en autoclave gedurende 30 minuten bij 121 °C. Houd het onder steriele omstandigheden tot gebruik.
   2. Verdun 1 g steriele ultrapure agarose in 50 mL 0,9% NaCl-oplossing. Homogeniseer en depolymeriseer de agarose in een microgolf met intervallen van 10 seconden gedurende 3–5 cycli, totdat deze volledig is opgelost.
   3. In een biologische veiligheidskast plaats je een commercieel verkrijgbare siliconenmal met 81 ronde uitsparingen op steriel gaas.
   4. Plaats voorzichtig 600 μL agarose in het midden van de siliconenmal en laat het 40 minuten rusten om volledige polymerisatie te garanderen.
   5. Demold voorzichtig de volledig gepolymeriseerde agarose-micromal en breng deze over in een put van een 12-put microtiterplaat.
   6. Pas de positie van de agarose-micromal aan en bevestig deze op de bodem van de put door te vullen met 600 μL agarose.
   7. Pre-incubeer de microschimmel door 15 minuten te incuberen met Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 mL/put). Herhaal deze procedure twee keer en vervang deze bij de derde incubatie door het driedimensionale (3D) kweekmedium, bestaande uit DMEM aangevuld met ascorbinezuur (50 μg/mL), humaan serumalbumine (1,25 μg/mL), penicilline-streptomycine (PS, 1×, uit een 100× voorraadoplossing) en ITS-supplement (1×, uit een 100× voorraadoplossing).
      OPMERKING: Het 3D-kweekmedium verschilt van het monolaag-expansiemedium door het ontbreken van Fetaal Bovine Serum (FBS) en de opname van gedefinieerde supplementen die cel-celinteractie en ondersteuning van de extracellulaire matrix bevorderen, wat een goede sferoide zelfassemblage en stabilisatie bevordert. Als schimmelproductie en celplatering op verschillende dagen worden uitgevoerd, kan de procedure worden gepauzeerd na de tweede DMEM-incubatie, en moeten de schimmels tot 5 dagen onder steriele omstandigheden worden bewaard in een bevochtigde incubator bij 37 °C. De derde incubatie met 3D-kweekmedium mag alleen op de dag van het opmaken worden uitgevoerd. Verwijder het medium volledig uit zowel de put als de microschimmel voordat je de cellen plant.
2. Bereiding van Gelatine Methacryloyl (GelMA) hydrogel
   OPMERKING: De hele procedure moet in het donker worden uitgevoerd, omdat de reagentia fotosensitief zijn. In deze studie werden GelMA (gelsterkte 300 g Bloom, substitutiegraad 60%) en de fotoinitiator lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) gebruikt. Om 10 mL van een 10% w/v GelMA-oplossing te bereiden, die 0,5% w/v LAP bevat:
   1. Los 50 mg LAP-poeder op in 1 mL DMEM, en meng voorzichtig met een pipet totdat er een heldere, homogene oplossing is verkregen.
   2. Breng de LAP-oplossing over in een centrifugebuis met 9 mL DMEM en meng grondig.
   3. In een biologische veiligheidskast steriliseer je de resulterende oplossing door te filteren via een 0,22 μm filter.
   4. Voeg 1 g GelMA toe aan de oplossing en homogeniseer met magnetisch roeren bij 50 °C gedurende ongeveer 3 uur, of totdat een heldere en homogene oplossing is verkregen. Houd de kolf tegen het licht om te zorgen dat de oplossing vrij is van zichtbare deeltjes en troebelheid.
   5. Laad de resulterende hydrogel in een 10 mL spuit voor vervolg printen of, als je het niet direct gebruikt, bewaar het op 2–8 °C, beschermd tegen licht, tot gebruik.
      OPMERKING: De GelMA- en LAP-oplossingen werden ongeveer 24 uur na voorbereiding gebruikt. Langdurig opbergen van deze oplossing wordt niet aanbevolen. Zowel GelMA- als LAP-poeders moeten volgens de instructies van de fabrikant worden bewaard bij 2–8 °C. De LAP-fotoinitiator is geclassificeerd als niet-gevaarlijk volgens normen zoals ABNT NBR 14725 en Verordening (EG) nr. 1272/2008. De fabrikant raadt echter aan om persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen om ademhalings-, huid- en oogirritatie te voorkomen. Het gebruik van veiligheidsbrillen die getest en goedgekeurd zijn volgens relevante overheidsnormen, zoals NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health - US) of EN 166 (EU), evenals nitrilrubberen handschoenen met een minimale dikte van 0,11 mm, wordt aanbevolen. Ademhalingsbescherming is alleen nodig wanneer er stof ontstaat. De aanbevelingen van de fabrikant met betrekking tot ademhalingsbescherming met een filter zijn gebaseerd op normen zoals DIN EN 143, DIN EN 14387 en andere aanvullende normen met betrekking tot het specifieke ademhalingsbeschermingssysteem dat in gebruik is. De fabrikant raadt aan een P1-type filter te gebruiken.
3. 3D-modelontwerp, slicing en generatie van het G-codebestand
   OPMERKING: Het 3D-steigermodel is ontworpen met behulp van de online 3D-computerondersteunde ontwerpsoftware (CAD) Tinkercad. Voor dit protocol werd een cilindrische steiger gegenereerd met een diameter van 15 mm, een bodemdikte van 1 mm en twee ronde poriën, elk met een diameter van 5,50 mm en een diepte van 2 mm.
   1. Zodra het 3D-modelontwerp is voltooid, exporteer je het als een *.stl-bestand (Supplementair Bestand 1).
   2. Open de Repetier-Host versie 2.3.2 software, die gebruikt zal worden om het ontworpen model te slicen.
   3. Selecteer in het tabblad "Slicer" de gewenste slicer-optie. In deze studie werd de CuraEngine gebruikt.
   4. Configureer het juiste parameterprofiel. In dit werk was Snelheid 10 mm/s; Laaghoogte 0,2 mm; Infillpatroon: Raster; Nozzlediameter 0,41 mm werd gebruikt.
   5. Laad het *.stl-bestand van het 3D-model dat geprint moet worden.
   6. Selecteer in het tabblad "Slicer" de eerder aangemaakte configuratie.
   7. Klik op "Slice with CuraEngine". Het gesneden 3D-model wordt vervolgens gevisualiseerd in de softwareinterface.
   8. Klik op "Opslaan in bestand" om het G-codebestand op de gewenste locatie op te slaan.
4. 3D-printen van Gelatinemethacryloyl (GelMA) hydrogel-steigers voor sferoid-bioassemblage
   OPMERKING: 3D-printen moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Controleer daarom voordat je met het printproces start of de biologische veiligheidskast waarin de printer is geplaatst is ingeschakeld en dat de luchtstroom goed functioneert. Controleer of de hoogte van het kastbeschermingsglas op dezelfde hoogte is als de sensormarkering van de apparatuur.
   1. Verwijder de veiligheidssloten van de bioprinter.
   2. Verwijder de glazen plaat van het drukbed door de metalen clips los te maken.
   3. Bevestig een passend gevormde acrylgeleider om de fixatie van de kweekplaat op het drukplatform te ondersteunen, met behulp van metalen clips.
   4. Sluit de printer aan op de stroombron. Let op: deze apparatuur ondersteunt dubbele spanning (110/220 V).
   5. Verbind de USB-kabel van de printer naar de computer.
   6. Druk op de aan/uit-knop om de printer aan te zetten.
   7. Open Repetier-Host v2.3.2 software, die gebruikt zal worden om het 3D-model te bekijken en te printen.
   8. Klik op de optie "Verbinden" in de software-interface.
   9. Met de handmatige bediening van de software selecteer je de extruder (1 of 2) en stuur je de printkop naar de thuispositie (X = 0, Y = 0, Z = 0).
   10. Stel de geselecteerde extruder af voor een correcte spuitpassing met het juiste hulpmiddel van de handmatige bediening in Repetier.
   11. Steek de spuit voorzichtig in de extruder, die al geladen is met hydrogel en is bevestigd aan een extrusiemondstuk (in deze studie gebruikten we een conische polypropyleenmondstuk met een interne diameter van 0,41 mm).
   12. Plaats de kweekplaat in de acrylgeleider die aan het drukbed is bevestigd.
   13. Stel de Z-thuispositie (Z = 0) aan met de Z-eindstopschroef aan de linkerkant van de bioprinter. Dat wil zeggen, stel de gewenste afstand in tussen de extrusiespuit en het printoppervlak. Idealiter zou de nozzle het substraat licht moeten raken, wat in deze studie de kweekplaat was.
   14. Breng de printhead terug naar de thuispositie.
   15. Laad het eerder gegenereerde G-codebestand.
   16. Gebruik het juiste handmatige bedieningsinstrument in de software, om wat hydrogel uit de spuit te extruderen om de materiaalstroom door de nozzle te garanderen.
   17. Begin met het printproces.
   18. Na het printen voert u fotocrosslinking uit van de resulterende steiger met behulp van het UV-lichtsysteem van de 3D-bioprinter, uitgerust met twee LED's op 395-400 nm. Blootstel de steiger 5 minuten aan UV-licht (lichtintensiteit van 20 mW/cm²).
   19. Gebruik dezelfde gedepolymeriseerde 2% agarose-oplossing die wordt gebruikt voor het vervaardigen van de micromallen om de 3D-geprinte steigers aan de putjes van een 12-put kweekplaat te bevestigen. Het bevestigen van de steigers aan de bodem van de putten is noodzakelijk om meer stabiliteit te bieden en verplaatsing tijdens het zaaien van de sferoiden en gedurende de kweekperiode te voorkomen.
       OPMERKING: Controleer bij stap 4.16 of de hydrogel een continue filament vormt tijdens de extrusie. Gewoonlijk wordt de gelatineoplossing in de spuit geladen terwijl het nog vloeibaar is (ongeveer 37 °C). Binnen enkele minuten bij kamertemperatuur (22–25 °C) begint dit biomateriaal over te gaan naar een gelachtige consistentie. Het materiaal mag niet druppelen tijdens het extruderen, omdat dit de printkwaliteit negatief beïnvloedt. Continue filamentvorming tijdens extrusie geeft aan dat de hydrogel een optimale consistentie voor het afdrukken heeft bereikt. De GelMA- en LAP-oplossing die in DMEM worden verdund vertoont een licht oranje kleur. Na UV-geïnduceerde fotocrosslinking wordt vaak een kleurverandering waargenomen, waarbij het materiaal witachtig of doorschijnend wordt, zoals weergegeven in Figuur 3D, E. Bij het gebruik van het UV-systeem zijn veiligheidsbrillen verplicht om voldoende oogbescherming tegen ultraviolette straling te garanderen.
5. Analyse van de drukgetrouwheid
   OPMERKING: De 3D-printnauwkeurigheidsanalyse van GelMA-steigers houdt rekening met de volgende parameters: steigerdiameter, poriediameter en steigerdikte. ImageJ versie 1.54-software werd gebruikt om de metingen uit te voeren.
   1. Maak eerst beelden van de steigers die met een stereomicroscoop worden bekeken. Gebruik een liniaal of schuifklauw als referentie.
   2. Kalibreer en stel de schaal in ImageJ voordat je de beelden analyseert om de metingen uit te voeren.
   3. Gebruik het rechte lijngereedschap om de metingen uit te voeren.
   4. Aangezien zowel de steiger- als de porievorm rond zijn, gebruik het rekenkundige gemiddelde van de steiger en poriediameters voor statistische analyse.
   5. Voor analyse van de printkwaliteit vergelijk je de metingen die ImageJ van de geprinte steigers verkregen met de waarden die zijn gedefinieerd in het 3D-model dat door Tinkercad is gegenereerd.
      OPMERKING: De gemeten dikte van de geprinte steigers wordt vergeleken met de som van de poriediepte en de bodemdikte die in Tinkercad worden geprojecteerd.
   6. Voer statistische analyses uit van de verkregen gegevens. In dit geval kan om de gemeten scaffoldwaarden te vergelijken met de verwachte waarden de Mann-Whitney U-test (niet-parametrisch) worden gebruikt. De Shapiro-Wilk-test wordt gebruikt om de normaliteit te beoordelen. Verschillen worden als statistisch significant beschouwd wanneer p < 0,05.

2. Voorbereiding van hADSC's en sferoïdevorming

OPMERKING: Commercieel verkrijgbare mesenchymale stamcellen (hADSC's) werden gekweekt in celspecifiek groeimedium en gepasseerd bij 80%–90% confluentie volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Cellen werden gebruikt tot passage 7 voor dit protocol. Al het biologisch afval moet correct worden gedekontamineerd of gesteriliseerd voordat het wordt gedumpt en behandeld volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Voor een volgende confocale visualisatie moet de monolaag worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof vóór de vorming van de sferoïden en geïncubeerd worden zoals aanbevolen door de fabrikant. De vorming van de sferoiden kan 30 minuten na het labelen worden gestart.

1. Trypsinisatie van de ASC-monolaag
   1. In een biologische veiligheidskast opent u de kweekfles en brengt u de inhoud over in een afvalcontainer.
   2. Was de monolaag twee keer met 1× Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gooi de oplossing weg.
   3. Voeg 0,125% trypsine/EDTA-oplossing toe, voldoende om de monolaag te bedekken. Sluit de kolf en incubeer tot 5 minuten in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C.
   4. Inactiveer de trypsine/EDTA door een gelijke hoeveelheid DMEM toe te voegen, aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS).
   5. Verzamel de celsuspensie met een serologische pipet of transfer naar centrifugebuizen. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (20–25 °C).
   6. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
   7. Sussen de celpellet opnieuw in DMEM en homogeniseren. Neem een aliquot voor celtelling en levensvatbaarheidsbeoordeling.
2. Spheroïde cultuur (zie Figuur 2B)
   1. Verdeel het juiste aantal cellen dat voor elke mal wordt geplateerd in een centrifugebuis van 15 mL. Voor hADSC's zou elke agaroseschimmel met 81 uitsparingen 1 × 10^{à 6} cellen moeten ontvangen—één sferoïde vormt zich in elke microwell, wat 81 sferoïden per microschimmel oplevert.
   2. Voeg 1× PBS toe en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en voeg 1× PBS toe. Herhaal deze stap twee keer.
   3. Na de derde centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig weggegooid en de buisopening droog met steriele gaas voordat deze weer in verticale positie wordt geplaatst.
   4. Sussief de celpellet opnieuw in 120 μL 3D-kweekmedium voor sferoidkweek en homogeniseer. Stel het ophangingsvolume aan op 200 μL met indien nodig extra 3D-cultuurmedium.
      OPMERKING: Elke mal met 81 resecties heeft een capaciteit van 200 μL.
   5. Aspireer 200 μL en plaats het zorgvuldig in het midden van de mal, zodat er geen bubbelvorming ontstaat.
      OPMERKING: Deze stap kan worden geautomatiseerd met een robotisch pipetsysteem, zoals eerder beschreven²².
   6. Laat de plaat 5 minuten in de biologische veiligheidskast staan zodat de cellen kunnen settelen in de resecties.
   7. Plaats het bord 40 minuten in een bevochtigde broedmachine.
   8. Voeg na deze periode voorzichtig 2 ml 3D Medium toe aan elke put. Breng de plaat terug in de bevochtigde broedmachine bij 37 °C.
3. Meting van sferoïden en statistische analyse
   1. Maak beelden van de sferoïden die langs de twee diagonalen van de agarose-micromal zijn geplaatst, waardoor een "X"-patroon ontstaat, met een omgekeerde optische microscoop uitgerust met een digitale camera en een 10× objectief. Gebruik de 100 μm schaalbalk om de beeldschaal te kalibreren voordat je de diameters meet.
   2. Om de grote en kleine diameters van de sferoïden te bepalen, gebruik je de "lijn"-tool van de software en voer je twee loodrechte metingen uit voor elke gefotografeerde sferoïde, met een hoek van ongeveer 90° ertussen.
   3. Bereken de gemiddelde diameter van elke sferoïde als het rekenkundige gemiddelde van de twee eerder gemeten loodrechte diameters. Bereken de bolrijkheid als de verhouding van de grootste tot de kleinste diameter van elke bol, met waarden dichter bij 1 die een grotere uniformiteit en een meer bolvormige vorm aangeven.
   4. Voer statistische analyses uit met behulp van de verkregen diameter- en sfericiteitswaarden.

3. Inzaaien van sferoïden op GelMA-steigers voor sferoïdenfusie en bioassemblage

1. Na 24 uur sferoïdevorming wordt ze uit de agarose-micromallen gehaald met een pipet met brede boringen en overgebracht in 2 mL microbuizen.
2. Wanneer de sferoïden zich onderaan de microbuisjes vestigen, gooi dan het supernatant weg.
3. Suspendeer de sferoïden opnieuw in 50 μL 3D-medium.
4. Gebruik een pipet met brede boringen om de sferoïden te verzamelen en voorzichtig in de poriën van de GelMA-steigers te plaatsen.
   OPMERKING: In een GelMA-ondersteuningsporie van ongeveer 5,50 mm in diameter en 2 mm diep, zaad je ongeveer 480 tot 640 sferoïden (overeenkomend met 6–8 agarose-micromallen, elk met 81 sferoïden met diameters variërend van 200 tot 400 μm) in 50 μL. Deze schatting was gebaseerd op porievolume en gemiddelde sferoïdediameter, waarbij kwantificatie werd uitgevoerd op basis van het aantal volledige micromallen die werden overgedragen in plaats van op individuele sferoïdetelling, wat een praktische en reproduceerbare schatting van de sferoïdendichtheid binnen de porie garandeert.
5. Na het afzetten van de sferoïden in de GelMA-ondersteuningsporie, wacht je 20–40 minuten om de sferoïden te laten zakken. Voeg 1 ml 3D-medium toe aan elke put.
6. Voeg na 24 uur 1 mL 3D-medium toe aan elke put.
7. Monitor de fusie van sferoïden in de poriën van GelMA-steigers met fasecontrastmicroscopie en stereomicroscopie. Maak de beelden elke 24 uur, van dag 0 (direct na het zaaien) tot dag 3 (72 uur).
8. Herstel de biologische constructie in 4% paraformaldehyde na 72 uur voor visualisatie met confocale microscopie. Behandel paraformaldehyde in een gecertificeerde chemische dampafzuigkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen en oogbescherming) vanwege de giftige en irriterende eigenschappen, en voer afval af volgens de institutionele chemische veiligheidsrichtlijnen. Voor confocale observatie moeten cellen in de monolaag vooraf gelabeld worden met een fluorescerende kleurstof vóór de vorming van de sferoïden.
   OPMERKING: Als verwijdering van het construct uit de GelMA-porie nodig is voor analyse of in vivo toepassing, haal het dan voorzichtig terug met een precisiepincet of een biopsiepunch van passende grootte.

Resultaten

Stamcellen uit humane vetstoffen (hASC's) die in een monolaag waren gekweekt (Figuur 2C), werden binnen 24 uur na het zaaien in agarose-microschimmels succesvol geïnduceerd om sferoïden te vormen (Figuur 2D). De resulterende sferoïden vertoonden een compacte en goed gedefinieerde morfologie. Morfometrische analyse toonde een gemiddelde diameter van 239,8 μm ± 87,0 μm bij 24 uur (Figuur 2E) en een bo...

Discussie

De resultaten uit deze studie benadrukken de succesvolle integratie van kwaliteitscontrole-metrics in een gestandaardiseerde biofabricageworkflow om reproduceerbaarheid te waarborgen. Het gebruik van 3D-geprinte steigers gebaseerd op vooraf vastgestelde ontwerpen biedt structurele ondersteuning voor sferoide bioassemblage^19,23. Als proof-of-concept werd een solide steiger ontworpen met twee centrale poreuze gebieden, afgemeten om...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Bereidt in het laboratorium		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 met Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrifuge	Eppendorf	-	5702
Class II Biological Safety Cabinet	Streamline	-	Model SC2-4E3
CO2 incubator voor celcultuur	Thermo Fisher Scientific	-	Serie 8000 WJ
Conische polypropyleen nozzle 0,41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium met Lage Glucose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Fetaal Rundserum (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gelatine methacryloyl gel sterkte 300 g Bloom, vervangingsgraad 60%	Sigma-Aldrich	900622	Lot/Batch nummer: MKCS2673. Documentatie voor elke batch, inclusief de Veiligheidsinformatieblad (SDS) en het Certificaat van Analyse (CoA), kan worden verkregen via de website van de fabrikant’s.
GraphPad Prism 6.0 software	GraphPad Inc	-	-
Magneetstootplateau met verwarming	IKA	Z671797	Model C-MAG HS7
Human serum albumine 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
ITS (Insulin-transferrin-natriumseleniet) supplement 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscoop	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold bolvormige structuren	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicilline-streptomycine 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ humane adipogene afgeleide stamcellen (ADSC)	Lonza	PT-5006
Natriumchloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Trypsine/EDTA	Gibco	27250018	-