Methodenartikel

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als de buitenste laag van de oogbol speelt het hoornvlies een cruciale rol bij het behouden van homeostase en zicht van het oogoppervlak. Recente vooruitgang in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) heeft een hoge-resolutie analyse van de cellulaire heterogeniteit van het hoornvlies mogelijk gemaakt, maar de bereiding van hoogwaardige single-cell suspensies uit corneaal weefsel blijft een uitdaging vanwege de dichte en complexe structuur. In deze studie stellen we een robuust protocol vast voor het genereren van single-cel suspenties uit hele muishoornvlieën. De procedure houdt in dat het hoornvlies in fijne fragmenten wordt gehakt, gevolgd door sequentiële enzymatische vertering met collagenase A en trypsine. De resulterende celsuspensie werd beoordeeld op kwaliteit aan de hand van meerdere meetmethoden: trypanblauwe kleuring werd gebruikt om de levensvatbaarheid en het aantal cellen te evalueren; immunofluorescentiekleuring voor Pancytokeratine en Keratocan maakte identificatie en kwantificering van belangrijke corneale celtypen mogelijk; en de integriteit van RNA werd geverifieerd met behulp van een bioanalyzer. Dit protocol levert consequent single-cell preparaten op met een hoog aantal cellen, uitstekende levensvatbaarheid (≥ 94,6%) en een hoog aandeel single cells (96,3%), waarmee ze voldoen aan de eisen die compatibel zijn met veeleisende downstream toepassingen, waaronder scRNA-seq.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hoornvlies, gelegen in de buitenste laag van de oogbol, is essentieel voor zijn barrière- en brekingsfuncties, dankzij een sterk georganiseerde architectuur bestaande uit vijf verschillende lagen: het epitheel, de Bowman-laag, stroma, het membraan van Descemet en het endotheel1. Het corneale epitheel is een niet-keratiniseerde, gelaagde plaveiselstructuur die een fysieke barrière vormt tegen externe pathogenen en robuuste antimicrobiële en regeneratieve capaciteiten vertoont. Het stroma, bestaande uit precies uitgelijnde collageenfibrillen, behoudt de transparantie van het hoornvlies en een uniforme brekingsindex2. Het endotheel, een eencellige laag, reguleert de vloeistofoverdracht tussen stroma en waterig humor, waardoor de hydratatie van het hoornvlinchje en de voedingsstoffen behoudenblijven. Desalniettemin heeft deze ingewikkelde structurele en cellulaire complexiteit historisch gezien aanzienlijke uitdagingen opgeleverd bij het onderzoeken van de biologische functies en onderliggende mechanismen van het hoornvlies4.

Om intercellulaire interacties te bestuderen en celtype-specifieke markers te identificeren, worden technieken zoals flowcytometrie sorting5 en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)6 veel toegepast. Een belangrijke technische uitdaging die beide benaderingen gemeen hebben, is echter de bereiding van hoogwaardige single-cell suspensies. Parameters zoals totale celopbrengst, het aandeel individuele cellen en de levensvatbaarheid van cellen zijn cruciaal voor de betrouwbaarheid van downstream-toepassingen die gericht zijn op het karakteriseren van de functie van hoornvliessencellen en de expressie van oppervlaktemarkers7. Ondanks het belang blijft er een gebrek aan gestandaardiseerde en efficiënte protocollen voor het genereren van single-cell suspensies uit hele muishoornvlieën.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om single-cel suspenties uit hoornvlies te verkrijgen. Sequentiële enzymatische vertering met collagenase A, trypsine of TrypLE is toegepast om individuele cellen te isoleren uit zowel menselijke als muishoornvliezen8. Herhaalde trypsinisatie is ook gebruikt voor hoornvliesdissociatie⁷. Daarnaast zijn commerciële multiweefsel-dissociatiekits, zoals die van Miltenyi Biotec, met succes toegepast om corneale single-cell suspensieste genereren. In onze eerdere vergelijkende studie van verschillende manieren voor het verteren van het hoornvlies toonden we aan dat sequentiële behandeling met collagenase en trypsine de optimale aanpak is. Deze methode levert consequent hoge celaantallen, uitstekende levensvatbaarheid (≥94,6%), een hoog percentage individuele cellen (96,3%) en goed bewaarde RNA-integriteit10.

In dit protocol bieden we een gedetailleerde, stapsgewijze procedure voor het genereren van hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen met behulp van deze geoptimaliseerde enzymatische verteringsstrategie, gebaseerd op onze gevestigde ervaring en eerdere bevindingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vrouwelijke C57BL/6 (B6) muizen, 6-8 weken oud, werden geleverd door het Experimenteel Dierencentrum van de Guizhou Medische Universiteit. De dieren werden gehuisvest onder een 12 uur licht/12 uur donkercyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle procedures zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Experimentele Dieren van de Guizhou Medische Universiteit (Goedkeuring nr. 2305185) en uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek.

1. Voorbereiding

  1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten: Maak twee paar oogscharen, twee paar oogzwang, één paar weefselpincet en één 2 mL centrifugebuis schoon door twee keer te spoelen met dubbel gedestilleerd water (DDW). Steriliseer de instrumenten en de buis met een stoomautoclave. Droog alle producten een nacht in een conventionele oven op 65 °C.
  2. Oplossingsvoorbereiding
    1. Supplemental Hormonal Epithelial Medium (SHEM): Bereid SHEM voor door DMEM/F12 medium te schuiven met de volgende componenten: 5% (v/v) foetaal rundserum (FBS), 0,5% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO), 10 ng/mL muizepidermale groeifactor, 5,5 μg/mL transferrine, 0,5 μg/mL hydrocortison, 1% (v/v) penicilline-streptomycine (100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine).
      OPMERKING: SHEM wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen tijdens de verwerking te behouden. Het kan worden vervangen door alternatieve media zoals basale DMEM of fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS) die ten minste 10% (v/v) FBS bevatten.
    2. Fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS)
      1. Los 22,4 g PBS-poeder op in 2 L dubbel gedestilleerd water (DDW) tijdens het roeren met een magnetische roermachine om 1× PBS te verkrijgen.
      2. Autoclave de PBS-oplossing één dag van tevoren en laat het afkoelen.
      3. Onder steriele omstandigheden breng je 47,5 mL steriele 1× PBS over in een 50 mL centrifugebuis en voeg je 2,5 mL van 1% (v/v) penicilline-streptomycine toe.
        OPMERKING: De 1× PBS-formulering (2 L) bevat 137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4 en 2 mM NaH2PO4, pH 7,2.
    3. Collagenase A-oplossingen
      1. Bouillonoplossing: Los 1 g collagenase A-poeder op in 40 mL DDW. Filter steriliseer via een 0,2 μm filter en bewaar bij -20 °C.
      2. Werkoplossing: Verdun 1 mL collagenase, een standaardoplossing, in 4 mL steriele DDW om een uiteindelijke concentratie van 5 mg/mL te verkrijgen.
    4. Trypsine-oplossing: Ontdooi commercieel verkrijgbare 0,25% (met w/v) trypsine/EDTA-oplossing (met 0,91 mM EDTA) op ijs vóór gebruik.
    5. Trypan Blue-oplossing (0,4%): Los 0,4 g Trypan Blue op in 100 mL DDW. Filter met filterpapier en bewaar op 4 °C.
      OPMERKING: De 0,4% Trypan Blue-oplossing wordt gebruikt voor het beoordelen van het totale aantal cellen, het aandeel enkele cellen en de levensvatbaarheid. Het kan worden vervangen door commerciële levende/dode kleurkits of geautomatiseerde celtellingssystemen.

2. Voorbereiding van muishoornvliezen

  1. Steriliseer de dissectiemicroscoop en het werkgebied door het af te vegen met 75% ethanol, en stel het gebied vervolgens 30 minuten bloot aan UV-licht in een biologische veiligheidskast.
  2. Bereid het volgende voor onder steriele omstandigheden: Eén 60 mm petrischaal met 5 ml SHEM-medium, drie 60 mm petrischaaltjes elk met 5 ml 1× PBS aangevuld met 5% penicilline-streptomycine (P-S), drie 60 mm petrischoteltje elk met 5 mL gewone 1× PBS, en één steriele 2 mL centrifugebuis
  3. Euthanace de muis met CO2-verstikking, gevolgd door een cervicale ontwrichting.
  4. Spoel de muizenkop en gesloten oogleden grondig drie keer door onder te dompelen in PBS met 5% P-S voordat je begint met de enucleatie.
  5. Met behulp van een oogschaar maakt u een incisie langs de achterpool van elke oogbol en plaatst u de geïsoleerde ogen zorgvuldig in de Petrischaal met ijskoude SHEM-medium (Figuur 1A).
    OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren, moeten alle oplossingen vooraf worden gekoeld tot 4 °C en moeten alle dissectiestappen op ijs worden uitgevoerd.
  6. Breng onmiddellijk de petrischaal met oogballen over naar een biologische veiligheidskast. Was de oogbollen drie keer in 1× PBS met 5% P-S, en incubeer 5 minuten per was.
  7. Onder een dissectiemicroscoop scheid je het hoornvliesweefsel zorgvuldig: Maak met oogscharen en pincetten een incisie van de achterpool naar het hornvlies limbus. Verwijder voorzichtig het hoornvlies van de sclera en conjunctiva langs de limbalrand. Verwijder de lens en iris volledig met twee paar tangen (Figuur 1B).
  8. Met oogpincet brengt u het hoornvlinstweefsel over in een petrischaaltje met 1× PBS en spoelt u drie keer (5 minuten per stuk) om eventueel niet-hoornvlies en antibiotica te verwijderen.
    OPMERKING: De iris hecht vaak strak aan het hoornvlinst. Zorg ervoor dat het voorzichtig en volledig wordt verwijderd met een pincet om besmetting te voorkomen, zodat alleen helder hoornvliesweefsel overblijft.
  9. Met behulp van oogpincet wordt het gereinigde hoornvlinstweefsel overgebracht in een 2 mL centrifugebuis en 1 mL collagenase A-werkoplossing (5 mg/mL) toegevoegd.
  10. Met behulp van een oogschaar snijdt u het hoornvliesweefsel in ongeveer 0,5 mm × 0,5 mm fragmenten direct binnen de buis.
  11. Incubeer de buis met de hoornvliesfragmenten en collagenase A-oplossing in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 1 uur (Figuur 2A-C).
  12. Controleer tijdens de collagenase A-vertering het weefsel elke 10 minuten. Beëindig de vertering wanneer er geen grote weefselfragmenten meer overblijven door te gaan tot centrifugatie. Centrifugeer het monster op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een centrifuge. Aspireer voorzichtig het supernatant.
  13. Susselt de pellet opnieuw in 200 μL 0,25% trypsine/EDTA-oplossing.
  14. Incubeer de buis in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 10 minuten om de resterende weefselfragmenten te verteren.

3. Isolatie van hoornvlies enkele cellen

  1. Tritureer het mengsel (weefsel en trypsine/EDTA-oplossing) voorzichtig herhaaldelijk met een P1000-pipet met een brede punt om het weefsel te dissociëren tot een enkelcelige suspensie.
  2. Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Suspensieer de celpellet opnieuw in 1 mL PBS met 0,04% rundserumalbumine (BSA) om een single-cell suspension te verkrijgen.
    OPMERKING: Voor cellen die bedoeld zijn voor sequencing of flowcytometrie, resuspendeer in serumvrije PBS. Voor cellen die gekweekt zullen worden, gebruik 1x PBS aangevuld met 0,04% BSA.
  3. Filter de celsuspensie door een voorbevochtigde 40 μm celzeef in een nieuwe 50 mL centrifugebuis om celklonten en afval te verwijderen.
    OPMERKING: Maak de celzeef vooraf nat met PBS om celverlies te minimaliseren. Indien nodig kunnen de gefilterde cellen opnieuw worden gecentrifugeerd en opnieuw worden opgehangen in een gewenst volume voor concentratie.

4. Celtelling

  1. Meng 9 μL celsuspensatie met 1 μL 0,4% Trypan Blue-oplossing en meng voorzichtig.
  2. Laad het mengsel langzaam in een hemocytometerkamer via het aangewezen laadkanaal. Tel de cellen met behulp van de vierkwadrantmethode om het totale aantal cellen, levensvatbaarheid en het aandeel individuele cellen te bepalen. Voer ten minste twee technische replica's uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwaliteit van de single-cel suspenties werd beoordeeld op basis van de totale celopbrengst, het aandeel single cells en de levensvatbaarheid van de cel. De suspensie werd gekleurd met Trypan Blue en geanalyseerd met fasecontrastmicroscopie over meerdere velden (Figuur 3). Uit vier muisogen (acht hoornvlieden) werden in totaal 1,05 × 105 cellen verkregen, met een gemiddelde cellevensvatbaarheid van 94,6% en een single-celverhouding van meer dan ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De introductie van single-cell RNA-sequencing heeft het gebruik van genomische, transcriptomische, epigenetische en proteomische technologieën in oculair onderzoek aanzienlijk verhoogd 9,10,11,12. Daarom is de bereiding van hoogwaardige single-cell suspenties steeds kritischer geworden, omdat het de detectie van signaalvariaties tussen individuele cellen mogel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen hun dankbaarheid en respect uitspreken aan alle dieren die aan hun cellen hebben bijgedragen aan deze studie. Deze studie werd deels ondersteund door Guizhou Provinciale Wetenschaps- en Technologieprojecten (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [aan S.O.]); het Fujian Provinciaal Wetenschapsfonds voor Uitmuntende Jonge Wetenschappers (2023J06053 [tot S.O]); de Natural Science Foundation of China (nr. 82101084 [aan S.O.]; het Guizhou Provinciaal Basisonderzoeksprogramma (Natuurwetenschappen)(QKHJC-ZK[2025]MS-473) [aan S.O.]; het Fonds voor Medische Onderzoeksunie voor Hoogwaardige gezondheidsontwikkeling van de provincie Guizhou (2024GZYKYJJKM0043) [aan S.O.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbitAbcamab150064
AntikeratinAbcamab230175
Anti-pancytokeratinThermo Fisher ScientificAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Autoclaaf sterilisatorAn ShenLDZH-100KBS
Bovine Serum Albumine VSolarbioA8020
CelfilterNEST25836940 μm
CentrifugemachineEppendorf AG22331 Hamburg
Collagenase ARoche10103578001
Confocale microscoop OberkochenZeiss LSM 880
TellplaatMARIENFELDM407859
CentrifugebuisNEST6206112 mL, 50mL
DekglasMARIENFELDM407859
DAPISolarbioC0065
DissectiemicroscoopCarl ZEISSVISU150
DMEM/F12  mediaGibco11320033
DMSOSolarbioD8371
Fetaal  bovien  serumGibco16140071
HydrocortisonSolarbioIH0100
ITSGibco23337619
Muis epidermaal groeifactorInvitrogenPMG8041
Oogchirurgische forcepsDumot0208-5-PO
Oogchirurgische schaarFST15021-15
OvenAISITEDH6000 II
Penicilline &StreptomycineGibco15070063100mL
PetrischaalNEST70520160mm
Fosfaat gebufferde salineSolarbioP1010
Thermostaat incubatorThermo Fisher Scientific3111
Triton-X 100SolarbioT8200
Trypan Blauw SolarbioT8070
Trypsin/EDTA GibcoR001100
Ultra-reinigingstafelYou QiVS-840-2
4% ParaformaldehydeSolarbioP1110

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. Overview of the cornea:structure, function, and development. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).
  2. Delmonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  3. Zhang, X., et al. Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment. Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).
  4. Dou, S., et al. Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege. Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).
  5. Adan, A., et al. Flow cytometry:basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Altshuler, A., et al. Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).
  8. Kaplan, N., et al. Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).
  9. Collin, J., et al. A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells. Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).
  10. Liu, X., et al. Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas. Exp Eye Res. 233, 109544(2023).
  11. Espana, E. M., Birk, D. E. Composition, structure and function of the corneal stroma. Exp Eye Res. 198, 108137(2020).
  12. Topouzi, H., et al. Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).
  13. Zhang, T., et al. The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).
  14. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).
  15. Chen, W., et al. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2. Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).
  16. Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 212, 108767(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizenhoornvliesenzymatische digestiecollagenase AtrypsinedigestieimmunofluorescentiekleuringcellevensvatbaarheidRNA integriteithoornvliesceltypenflowcytometrie

Gerelateerde artikelen