Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Samenvatting

Het plasmamembraan bepaalt de celvorm en dient als het interface dat de intercellulaire communicatie regelt. Membraaneiwitten vormen een belangrijke klasse van therapeutische doelwitten; Daarom biedt super-resolutie van het celmembraan via zijn constitutieve eiwitten veel potentie in de vooruitgang van celbiologie en antilichaamtherapieën. In dit opzicht maakt single-molecule localization microscopy (SMLM) nanoschaalvisualisatie van eiwitorganisaties op biologische structuren mogelijk. Ondanks het belang ervan brengt het toepassen van SMLM op plasmamembraaneiwitten unieke uitdagingen met zich mee. In dit protocol presenteren we een effectieve aanpak met behulp van time-lapse single-antibody labeling (SAL), genaamd membraan SAL (mSAL). We geven gedetailleerde stapsgewijze instructies, waaronder optimalisatie van de antistofconcentratie, laservermogensdichtheid, duur van niet-verlichtingsintervallen, beeldreconstructie en dichtheidsgebaseerde clusteranalyse, om nanoschaal membraaneiwitverdeling en membraanmorfologie op te lossen. We gebruiken het tetraspanine-eiwit CD81 als modelmembraaneiwit om de capaciteit van mSAL aan te tonen op zowel hechtende als suspensiezoogdiercellen. Naast het super-oplossen van het celmembraan en de distributie van membraaneiwitten, maakt onze techniek het mogelijk de farmacodynamiek van therapeutische antilichamen die interageren met hun membraandoelen in de natuurlijke membraanomgeving te onderzoeken.

Inleiding

Het plasmamembraan bevat een diverse reeks eiwitten die de celmobiliteit, adhesie, waarneming en intercellulaire communicatie reguleren. Het begrijpen van de nanoschaalverdeling van plasmamembraaneiwitten is belangrijk, aangezien de functie van eiwitten vaak niet alleen wordt bepaald door expressieniveaus, maar ook door hun ruimtelijke organisatie op het membraan 1,2. Opmerkelijk is dat veel therapeutische antilichamen membraaneiwitten 3,4 aanpakken, waardoor nanoschaalonderzoeken essentieel zijn om te begrijpen hoe antilichaaminteracties worden beïnvloed door de lokale membraaneiwitorganisatie. Echter, nauwkeurige mapping van de verspreiding van membraaneiwitten, het profileren van hun abundantie door één molecuul en realtime monitoring van hun dynamische interacties met bindingspartners blijven uitdagend.

Veelgebruikte single-molecule localization microscopy (SMLM)-technieken, zoals directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)5,6 en DNA-gebaseerde puntaccumulatie voor beeldvorming in nanoschaaltopografie (DNA-PAINT)7, gebruiken immunofluorescentie (IF) kleuring voor het labelen van monsters. Zij bereiken laterale resoluties van ~10 nm en hebben uitgebreide inzichten gegeven in de nanoschaalorganisatie van therapeutische membraandoelen, waaronder humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)8,9, CD2010, T-celreceptoren 11,12,13, geprogrammeerde doodsligand 114, B-celreceptoren 15,16,17 en CD19 17,18. Zo hebben dSTORM-studies waarbij het therapeutische monoklonale antilichaam Trastuzumab wordt gebruikt om HER2, een belangrijke receptor die betrokken is bij borstkanker, direct te detecteren, verschillende clusteringstoestanden aangetoond bij HER2-positieve patiënten8, terwijl verschillende therapeutische antilichamen HER2-clusteringmoduleren 9. DNA-PAINT in combinatie met rasterlichtplaatmicroscopie heeft de oligomere toestanden en interactieprofielen van CD20 in B-cellen met therapeutische monoklonale antilichamen rituximab, ofatumumab en obinutuzumab10 verduidelijkt. Hoewel conventionele SMLM waardevolle inzichten biedt in nanoschaalorganisatie, wordt het volledige potentieel beperkt door traditionele IF-kleuringsmethoden. De kwaliteit van het SMLM-beeld is afhankelijk van de IF-kleuring, die op zijn beurt wordt bepaald door de specificiteit en affiniteit van het labeling-antilichaam. Traditionele SMLM gebruikt antilichamen met hoge affiniteit die doorgaans superieure IF-kleuring en beeldkwaliteit bereiken. De meeste therapeutische antilichamen interageren echter met membraanreceptoren van levende cellen met matige affiniteit om off-target bijwerkingen te minimaliseren19. Bispecifieke T-cel-betrokkenen (TCE's) vertonen bijvoorbeeld een lagere affiniteit voor CD3, wat TCR-internalisatieverhindert 20,21,22. Dergelijke interacties kunnen niet nauwkeurig worden vastgelegd met conventionele IF-technieken.

We hebben eerder een strategie ontwikkeld die direct gebruikmaakt van interacties tussen enkele antistoffen en epitoop, genaamd single-antibody labeling (SAL). SAL maakt hoogdichtheidsmapping van antilichaam-epitoopinteracties mogelijk, terwijl native bindingsevenwichten23 behouden blijven. Hoewel we eerder een protocol hebben gerapporteerd voor intracellulaire cytoskeletale en mitochondriale eiwitten24, is SAL op membraaneiwitten nog niet aangetoond. In dit protocol bieden we een stapsgewijze workflow voor het toepassen van SAL op membraaneiwitten, aangetoond door de etikettering van tetraspanine CD81, een gerapporteerde therapeutische doelkandidaat 25,26,27,28, in zowel suspensie- als hechtende cellen. Door fluorescentief-gelabelde anti-CD81-antilichamen direct te onderzoeken naar de ruimtelijke verspreiding van CD81 op U2OS- en Jurkat T-cellen, demonstreren we de toepassing van SAL-nanoschaalstudies van membraaneiwitten. We noemden deze strategie membraan-SAL (mSAL). Tot slot beschrijven we een clustering-gebaseerde strategie om de geïsoleerde detecties van één enkel molecuul buiten de cel te verminderen.

In wezen gebruikt SAL time-lapse single-molecule labeling om individuele antilichaam-epitoop interacties vast te leggen, en de daaropvolgende single-emitter deconvolutie levert een superresolutiebeeld op basis van SMLM. Door de antistofconcentratie aan te passen en een passend niet-verlichtend interval (NII) tussen opeenvolgende beeldframes te kiezen, stemt SAL de on-rate van het antilichaam af op de detectiesnelheid van één molecuul, waardoor lokalisatie van één molecuul mogelijk is. SAL vereist langere NII's vanwege de van nature trage bindingskinetiek van antilichamen, die de beeldverwervingsduur verlengen (~3-17 uur). SAL is het meest geschikt voor toepassingen die precieze nanoschaalmapping van epitopen vereisen en de evaluatie van de interactiedynamiek tussen individuele antistoffen. Ondanks de lagere doorvoer biedt SAL unieke inzichten in de organisatie van epitoop en de betrokkenheid van antistoffen onder bijna-fysiologische omstandigheden, waardoor het bijzonder waardevol is voor het karakteriseren van therapeutische antilichamen in situ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol gebruikt de gevestigde Jurkat E6.1- en U2OS-cellijnen en bevat geen primaire menselijke of levende dierlijke materialen.

1. Celzaaien/landing en fixatie

OPMERKING: De monstervoorbereiding volgt standaard immunofluorescentie (IF) kleuringsprotocollen, geoptimaliseerd om de subcellulaire organisatie van plasmamembraaneiwitten over verschillende celtypen te behouden. Als er een gevestigd immunokleuringsprotocol bestaat voor het doelwit van interesse, kunnen gebruikers dat protocol volgen tot aan de monsterblokkerende stap 1.2.14. Single-antibody labeling (SAL) is afhankelijk van de cumulatieve detectie van fluorescentie-gelabelde antilichamen terwijl ze binden aan hun antigeen op enkelmolecuulniveau. Fluorescentie-gelabelde antilichamen, verdund in een beeldvormingsbuffer, worden aan de monsters toegevoegd op de microscoopstage, en fluorescentielabeling vindt dynamisch plaats naarmate de beeldverrijking vordert. Tijdens de monstervoorbereidingsfase wordt geen fluorescerende etikettering uitgevoerd.

  1. Bereid nalevende cellen voor, zoals de U2OS-cellijn, zoals beschreven in een eerder gepubliceerd protocol24.
  2. Celsuspensies
    1. Houd Jurkat T-cellen op een dichtheid van 1 x 105 tot 10 x 106 cellen /mL in 10 mL complete RPMI-media (RPMI 1640 aangevuld met 10% (v/v) foetaal rundserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine) op 37 °C in een bevochtigde incubator aangevuld met 5%CO2.
      OPMERKING: De aanbevolen 10 mL volledig medium geldt voor T25-flessen; Gebruikers moeten het volume dienovereenkomstig opschalen bij het gebruik van verschillende kweekvaten.
    2. Bereid het glasoppervlak voor door 200 μL 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) oplossing toe te voegen aan de putten die bedoeld zijn voor gebruik in een 8-kamer afdekglas. Incubeer een nacht bij 4 °C of 2 uur bij 37 °C.
    3. Tel de cellen uit de kweek met een hemocytometer en breng vervolgens 3,5 x 104 cellen over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Het aantal cellen moet mogelijk worden aangepast om een goede verdeling van individuele cellen te bereiken. Een zaaibereik van 30.000-60.000 Jurkat T-cellen bereikt een ideale dichtheid waarbij individuele cellen duidelijk van elkaar gescheiden zijn zonder te dun verspreid te zijn. Het aantal cellen moet mogelijk worden aangepast voor een nieuw celtype.
    4. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten om een celpellet te verkrijgen. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 200 μL voorverwarmde (37 °C) 1x Dulbecco's fosfaatgebroerde zoutoplossing (DPBS). De resulterende celpellet zal zichtbaar zijn als een kleine, witte afzetting onderin de microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Verwijder biologisch gevaarlijk afval volgens de richtlijnen van de instelling en alle toepasselijke lokale, staats- en federale regelgeving.
    5. Aspireer de PLL-oplossing uit het voorbereide kamerafdekglas (stap 1.2.2). Als de PLL-incubatie 's nachts plaatsvindt op 4 °C, verwarm dan het 8-wells bedekte glas voorop tot 37 °C voordat de oplossing wordt aspireerd.
    6. Voeg de celophanging toe uit stap 1.2.4. op de PLL-gecoate kamerput. Incubeer in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C, aangevuld met 5%CO2 , gedurende 30 minuten zodat cellen zich aan het oppervlak kunnen hechten. Meng de celsuspensie grondig voor het plateren en pipetteer op en neer om celklonten te breken en een gelijkmatige verdeling over de put te garanderen.
    7. Controleer de celbevestiging aan het glasoppervlak met een lichtmicroscoop. Onder 10x vergroting richt je de microscoop op de onderkant van het afdekglas.
      OPMERKING: Zachtjes tikken op het kamerafdekglas terwijl je onder de microscoop kijkt, kan helpen om te beoordelen of de cellen aan het oppervlak zijn vastgehecht of nog steeds zweven.
    8. Bereid 200 μL van de fixatiebuffer voor (4% paraformaldehyde en 0,1% glutaraldehyde in DPBS) en verwarm deze voor tot 37 °C in een waterbad.
      OPMERKING: De meegeleverde fixatiebuffer is geoptimaliseerd voor CD81 en is over het algemeen geschikt voor het behouden van membraaneiwitten. Voor nieuwe membraaneiwitdoelen moet de buffersamenstelling mogelijk worden aangepast om optimaal behoud te bereiken. Gebruikers worden aangemoedigd de literatuur te raadplegen voor fixatiecondities die zijn afgestemd op nieuwe doelwitten.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en kankerverwekkend. Glutaraldehyde is giftig en corrosief. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren van dit reagens. Bij huidcontact was je het aangetaste gebied onmiddellijk grondig met zeep en water. Verwijder het reagens volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle geldende lokale, staats- en federale regelgeving.
    9. Aspireer de DPBS uit elke monsterput (vanaf stap 1.2.6) met behulp van een micropipet.
      OPMERKING: Het is cruciaal om alle oplossingsuitwisselingsstappen langzaam uit te voeren om te voorkomen dat cellen van het afdekglas loskomen. Verwijder het biologisch gevaarlijke afval volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle toepasselijke lokale, staats- en federale regelgeving.
    10. Voeg 200 μL voorverwarmde 37 °C fixatiebuffer toe aan een hoek van de put en incubeer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en kankerverwekkend. Glutaraldehyde is giftig en corrosief. Draag geschikte PBM bij het hanteren van deze reagentia. Bij huidcontact was je het aangetaste gebied onmiddellijk grondig met zeep en water. Verwijder het reagens volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle geldende lokale, staats- en federale regelgeving.
    11. Was de vaste cellen 3x met 500 μL DPBS. Sla deze stap over als je doorgaat met stap 1.2.12.
    12. Optioneel: Verwijder langzaam de fixatieoplossing en voeg 200 μL vers bereid 0,1% natriumborhydride toe in DPBS, en incubeer dan 7 minuten op kamertemperatuur. Sla deze stap over en ga door naar stap 1.2.14 als je geen natriumborhydride-reductie gebruikt.
      OPMERKING: De reductie met natriumborhydride helpt autofluorescentie die door glutaraldehyde wordt opgewekt te dempen en neutraliseert niet-gereageerde aldehyden. De vrijgave van waterstofgas als gevolg van natriumborhydride die reageert met de waterige oplossing, zal zich manifesteren als het vrijkomen van bellen. Als de vrijgave van waterstofgas niet wordt waargenomen, gebruik dan een vers gemaakte oplossing van natriumborhydride.
      VOORZICHTIG: Natriumborhydride is giftig en corrosief. Draag de juiste PBM bij het hanteren van dit reagens. Bij huidcontact was je het aangetaste gebied onmiddellijk grondig met zeep en water. Verwijder het reagens volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle geldende lokale, staats- en federale regelgeving.
    13. Aspireer de natriumborhydrideoplossing uit elke put en spoel daarna drie keer met 500 μL DPBS.
    14. Bereid 200 μL van de blokkeringsbuffer voor en voeg dit toe aan de put. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Gebruik geen permeabilisatiereagens (bijv. TritonX-100, saponine), omdat dit membraaneiwitten kan verwijderen. Het hier gepresenteerde membraan SAL (mSAL)-protocol voor CD81 bevatte geen blokkerende stap.
      OPMERKING: Een blokkerende buffer met 5% (w/v) bovine serumalbumine (BSA) in DPBS wordt aanbevolen voor mSAL met nieuwe doelwitten. Bij het gebruik van secundaire antilichamen wordt het bijbehorende serum gebruikt voor blokkering. Bijvoorbeeld 10% (v/v) geitenserum in DPBS bij gebruik van een geit-host secundair antilichaam. Als er een vastgesteld blokkeringsbuffer-recept en een protocol bestaan voor het doelwit, kunnen gebruikers dat protocol volgen. De blokkerende buffer kan optioneel worden aangevuld met isotypecontrole-antilichamen of serum-afgeleide antilichamen om off-target bindingen van antilichamen te verminderen23,24. Voeg alleen een permeabilisatiereagens toe in de blokkerende buffer als het antilichaam zich richt op een intracellulair epitoop van het membraaneiwit.
    15. Voor mSAL met kleurstofgeconjugeerde primaire antilichamen gaat u direct door naar stap 1.2.20.
    16. Bereid 150 μL van de primaire antistofkleuringsoplossing voor (antilichaam bij gewenste concentratie verdund in de blokkeringsbuffer). Sla deze stap over voor mSAL met door kleurstof geconjugeerde primaire antistoffen.
      OPMERKING: Voor primaire antistofkleuring, raadpleeg het datasheet van de leverancier voor aanbevolen aandoeningen. Als concentratie-informatie niet wordt verstrekt, begin dan met 4 μg/mL (27 nM) voor volledige lengte IgG23,24.
    17. Vervang de blokkerende buffer door de primaire antistofoplossing. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 uur of 4 °C 's nachts in een vochtige kamer. Sla deze stap over voor mSAL met door kleurstof geconjugeerde primaire antistoffen.
    18. Was het monster 2x met 400 μL DPBS. Voeg 200 μL blokkeringsbuffer toe aan de put.
    19. Optioneel: Vervang de blokkeringsbuffer door 200 μL postfixatiebuffer (4% paraformaldehyde) en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Postfixatie helpt het bewaren van monsterblokkering voor SAL23,24. Deze stap moet echter worden weggelaten als het de toegankelijkheid van epitoop vermindert. Om het effect van postfixatie op epitoopherkenning door antilichamen te beoordelen, voer je standaard immunofluorescentiekleuring uit met en zonder postfixatie, en vergelijk de kleuringskwaliteit.
    20. Optioneel: Was het monster 2x met DPBS.
    21. Voeg 200 μL DPBS toe aan elke put en bedek de kamer met een transparante film om verdamping te voorkomen. Monsters kunnen tot 1 maand worden bewaard bij 4 °C. Als je mSAL direct na stap 1.2.14 uitvoert, of 1.2.19 zonder post-fixatie, bewaar het monster dan in de blokkeringsbuffer en ga direct door naar stap 2.2.
      OPMERKING: Het bewaren van het monster in DPBS aangevuld met 5 mM natriumazide voorkomt bacteriegroei tijdens opslag.
      VOORZICHTIG: Natriumazide is acuut giftig en kan dodelijk zijn als het wordt ingenomen. Draag de juiste PBM bij het hanteren van dit reagens. Bij huidcontact was je het aangetaste gebied onmiddellijk grondig met zeep en water. Verwijder het reagens volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle geldende lokale, staats- en federale regelgeving.

2. Beeldverwerving

OPMERKING: De beeldvormingsprocedure voor zowel hechtende als suspensiecellen is vergelijkbaar en wordt uitgevoerd met behulp van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Beeldvormingscondities moeten echter worden geoptimaliseerd voor elk celtype.

  1. Laat opgeslagen monsters (bij 4 °C) kamertemperatuur bereiken voordat de beeldvorming wordt opgenomen om condensatie op het glas te voorkomen. Sla deze stap over als je direct doorgaat met beeldvorming na de monstervoorbereiding.
  2. Stroom op het microscoopsysteem: microscoop, sCMOS-camera, laserunit en de computer met de beeldopnamesoftware. Laat het microscoopsysteem 5-10 minuten stabiliseren na het inschakelen, zodat de componenten van het systeem bedrijfstemperaturen kunnen bereiken en thermische drift wordt geminimaliseerd.
    OPMERKING: mSAL kan worden uitgevoerd met elke TIRF-microscoopopstelling en compatibele software. Zet het systeem aan volgens de instructies van het instrument.
  3. Breng dompelolie aan op een TIRF-objectief (bijv. 100x/1,49) en monteer het kamerafdekglas op het microscooppodium.
    OPMERKING: Als het objectief is uitgerust met een correctiekraag, zorg dan dat het op de juiste dikte van het afdekglas is ingesteld bij 23 °C. Het afdekglas dat in deze studie werd gebruikt, had een dikte van 0,13-0,17 mm.
  4. Als je bent uitgerust activeer je het Perfect Focus System (PFS), hef dan voorzichtig het objectief naar het afdekglas en breng het monster scherp.
  5. Bereid goudcolloïden voor als fiduciale markers (1:2 verdunning in ultrazuiver water). Sonicaer de goudcolloïden voordat je ze 3 minuten verdunt om de aggregaten te verspreiden.
  6. Aspireer voorzichtig de opslagbuffer (DPBS of blokkeringsbuffer) uit de monsterput en voeg 200 μL van de goudcolloïdeoplossing toe aan het monster. Incubeer 1 minuut en verwijder de oplossing.
  7. Gebruik brightfield-verlichting om te controleren of er voldoende goudcolloïden zijn afgezet voordat de oplossing wordt aspireerd. Een ideale dichtheid bestaat uit 5 tot 10 goudcolloïden binnen het aangewezen interessegebied (ROI).
    OPMERKING: Alternatief kunnen fluorescerende microsferen (zie Materiaaltabel) worden gebruikt bij een verdunning van 1:1.000 in DPBS.
  8. Was één keer met 500 μL ultrazuiver water om overtollige goudcolloïden te verwijderen, en voeg dan 200 μL DPBS toe.
  9. In de beeldvormingssoftware wordt de optische configuratie voor de fluoroforen (van de antilichaamprobe) gecreëerd, inclusief de juiste dichroïsche fase, laserexcitatiegolflengte en vermogensdichtheid, camera-integratietijd, emissiefilter en camerapixelbinning (indien van toepassing). Een pixelgrootte van 150-160 nm wordt aanbevolen om een optimale resolutie te bereiken.
  10. Maak een optische configuratie voor een fotobleachingstap. Een laservermogen van 380 W/cm2 of hoger met een camera-integratietijd van 1 s wordt aanbevolen.
    OPMERKING: Fotobleaching tijdens de verwerving helpt overlapping tussen individuele fluorescentie-antilichaambindingsgebeurtenissen te minimaliseren. Het verzamelde licht kan door een emissiefilter met een niet-overeenkomende golflengte worden geleid om camerasaturatie te voorkomen.
  11. Stel de laserhoek aan om TIRF-verlichting te creëren. Met brightfield-verlichting identificeer je een cel voor mSAL. Zorg ervoor dat er minstens 5 goudcolloïden zichtbaar zijn binnen de ROI om stage drift tijdens beeldreconstructie te corrigeren. Bevestig autofluorescentie van de goudcolloïden bij de vermogensdichtheid van de beeldvormingslaser.
  12. Stel de beeldparameters in: niet-verlichtingsinterval (NII), aantal frames en de frequentie van de fotobleachingstap (indien nodig) in de beeldverkenningssoftware. Voor mSAL van CD81 op U2OS- en Jurkat-T-cellen met CD81-antilichaam waren de optimale instellingen een NII van 5 seconden, 2.000 totale frames en een fotobleachingstap elke 5e frame.
    OPMERKING: Deze parameters moeten geoptimaliseerd worden voor elk eiwit van belang, het antilichaam dat voor mSAL wordt gebruikt, en het celtype. Zie stap 3 voor meer details over optimalisatie. Het optimale aantal frames kan variëren tussen het antilichaam-doelwit en het celtype. Voor nieuwe doelsystemen wordt het vastleggen van 2.000-3.000 frames aanbevolen als uitgangspunt. NII's verlengen de duur van beeldverwerving. Bijvoorbeeld, een mSAL-acquisitie van 3.000 frames met een 20 s NII resulteert in ~17 uur verwervingstijd.
  13. Bereid de beeldvormingsbuffer voor door het CD81-antilichaam te verdunnen tot een concentratie van 1 μg/mL in 200 μL van 5% BSA (w/v) in DPBS. Voor mSAL van CD81 was de uiteindelijke antistofconcentratie 0,5 nM voor Jurkat T-cellen en 2 nM voor U2OS-cellen.
    OPMERKING: De concentratie van antistoffen hangt af van de lokale substraathoeveelheid en de affiniteit van het antilichaam. Het is cruciaal om de antistofconcentraties voor elk eiwitdoel, elk antilichaam dat voor beeldvorming wordt gebruikt en elk celtype te optimaliseren. Zie stap 3.1 voor meer details over optimalisatie.
  14. Voeg de voorbereide beeldbuffer toe aan de put en begin met de acquisitie.

3. Optimalisatie van beeldvormingsparameters

OPMERKING: mSAL-beeldvormingsparameters worden beïnvloed door de eiwitexpressie, de lokale organisatie ervan en de keuze van het antilichaam dat voor beeldvorming wordt gebruikt. Het doel van het optimaliseren van beeldvormingsparameters is het identificeren van de antistofconcentratie en NII die ruimtelijk opgeloste enkelmolecuulgebeurtenissen veroorzaken, terwijl voldoende hoge dichtheden behouden blijven om de epitoopbemonstering te maximaliseren.

  1. Antistofconcentratie
    1. Verdun het antilichaam tot 0,5 nM voor Jurkat-cellen en 2 nM voor U2OS-cellen in 200 μL van 5% (w/v) BSA in DPBS en voeg de antistofoplossing toe aan de put. Voor optimale labeling van enkele antistoffen, gebruik een antistofconcentratie op of nabij zijn evenwichtsdissociatieconstante (Kd); als Kd onbekend is, wordt aanbevolen te beginnen op 1 nM.
    2. Gebruik de live-viewfunctie in de beeldvormingssoftware die is geconfigureerd voor mSAL om de binding van antistoffen te monitoren.
    3. Pas de TIRF-hoek en beeldparameters aan om een signaal-ruisverhouding (SNR) van ≥ 3 te bereiken.
      OPMERKING: Een optimale TIRF-hoek verbetert de SNR door onscherpe fluorescentie door diffunderende antilichamen in de beeldvormingsbuffer te beperken. Een laservermogensdichtheid van 100-200 W/cm2 en een camera-integratietijd van 50 ms kunnen aan het begin worden gebruikt. Als de SNR laag is, verhoog dan geleidelijk het laservermogen en/of de integratietijd van de camera en monitor de veranderingen in de SNR totdat deze een optimale waarde bereikt.
    4. Configureer de beeldparameters in de beeldverwervingssoftware om ten minste een 10-frame opname te verkrijgen met een NII van 5 s (zie stap 2.12).
      OPMERKING: Een 5 s NII wordt aanbevolen als uitgangspunt. Er moet een NII-scan worden uitgevoerd om de optimale NII voor een nieuw antilichaam-doelsysteem te identificeren (stap 3.2).
    5. Begin met de overname. Evalueer de schaarsheid van de localisaties van de opgenomen film met één molecuul.
      OPMERKING: Gedetailleerde stappen om de lokalisatiedichtheid te verkrijgen worden beschreven in een eerdere publicatie24. Een localisatiedichtheid van één molecuul tussen 0,02 en 0,15 gebeurtenissen/μm2 bleek optimaal voor mSAL.
    6. Als er direct na toevoeging van de beeldvormingsbuffer meerdere overlappende antilichaambindingsgebeurtenissen worden waargenomen of als er in de loop van de tijd enkele molecuullokalisaties zich ophopen naarmate de opname vordert, wordt de opname afgebroken. Verlaag de antistofconcentratie met 2 keer en herhaal de opname op een nieuw monster. Herhaal dit proces waarbij de antistofconcentratie met 2 keer wordt verlaagd en het aantal gebeurtenissen per oppervlakte-eenheid wordt herbeoordeeld totdat de gewenste dichtheid van de localisatie van enkelmolecuul is bereikt.
      OPMERKING: overlappende gebeurtenissen manifesteren zich als meerdere grote puncta die helderder of groter worden wanneer een nieuw antilichaam zich bindt binnen de diffractiegrens van het eerste antilichaam.
    7. Als de gebeurtenisdichtheid schaars is, verhoog dan de antistofconcentratie in de beeldvormingsbuffer met 2 keer en herhaal de opname op een nieuw monster. Herhaal dit proces waarbij de antistofconcentratie met 2 keer wordt verhoogd en het aantal bindingsgebeurtenissen per oppervlakte-eenheid wordt herberekend totdat de gewenste dichtheid van de localisatie van enkelmolecuul is bereikt.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elke concentratieoptimalisatieproef een nieuw monster te gebruiken om mogelijke interferentie van vooraf gebonden antilichamen bij latere lokalisatiedichtheidsevaluaties te voorkomen.
  2. NII-optimalisatie
    1. Configureer de beeldparameters in de beeldverwervingssoftware om een 50-frame acquisitie te verkrijgen (zie stap 2.12). Zet de NII op 0 (geen vertraging).
    2. Bereid de beeldvormingsbuffer voor op de geoptimaliseerde antistofconcentratie uit stap 3.1 en voeg deze toe aan de monsterput. Begin met de overname.
    3. Herhaal stappen 3.2.1-3.2.2, waarbij NIIs worden aangepast naar 1, 3, 5, 10 of 20 s. Voer elke aankoop uit op een nieuw monster.
    4. Evalueer de dichtheid en de spaarzaamheid van de enkele molecuullokalisaties van de opgenomen film (zie stappen 3.1.5-3.1.7). De laagste NII met de optimale enkelmolecuul-gebeurtenisdichtheid wordt bepaald als de optimale NII.
      OPMERKING: De antistofconcentratie moet mogelijk verder worden geoptimaliseerd om een optimale localisatiedichtheid van één molecuul voor de bijbehorende NII te bereiken. Zie stap 3.1. Eerdere rapporten tonen aan dat langere NII's (10-20 s) selectiever waren voor bindingsgebeurtenissen met hogere dichtheid, maar het uitbreiden van de NII voorbij 20 s leverde geen extra verbeteringop 23,24. Als ruimtelijk overlappende bindingsgebeurtenissen optreden tijdens de beeldverwerving, voer dan een fotobleachingsstap in op intervallen die voldoende zijn om fluorescentie uit gebonden antilichamen te verwijderen. Als bijvoorbeeld overlappende gebeurtenissen verschijnen bij het vijfde frame, pas dan elke vijfde frame fotobleaching toe. Het voorkomen van ruimtelijk overlappende gebeurtenissen wordt beschreven in de NOTITIE van stap 3.1.6.

4. Data-analyse

OPMERKING: mSAL-beeldreconstructie gebruikt de gratis NIH-software Fiji29 met de ThunderSTORM30-plugin . Fiji versie v1.54r en ThunderSTORM versie 1.3 werden in dit protocol gebruikt. Gedetailleerde beeldanalyse is beschreven in een eerder protocol 24. In deze sectie beschrijven we de analyseworkflow die specifiek voor mSAL wordt gebruikt. De analyse die in dit protocol wordt gepresenteerd gebruikte een Prime95B sCMOS-camera (serienummer A18B203004) met foto-elektronen per A/D van 0,98, en het camerabasisniveau van 100. De beeldpixelgrootte ingesteld op 147 nm.

  1. Stel de parameters voor de reconstructie in in het venster Run Analysis. De parameters die worden gebruikt voor CD81 mSAL-beeldreconstructies worden hieronder beschreven. De Preview-functie moet worden gebruikt om de gedetecteerde single-molecule bindingsgebeurtenissen in het geselecteerde frame te evalueren voordat de volledige analyse wordt uitgevoerd.
    Beeldfiltering:
    Filter: Wavelet-filter (B-spline)
    B-Spline volgorde: 2
    B-Spline schaal: 4
    Benaderende lokalisatie van moleculen:
    Methode: Lokaal maximum
    Piekintensiteitsdrempel: std(Wave.F1)
    Connectiviteit: 8-wijk
    Subpixellokalisatie van moleculen:
    Methode: PSF: Geïntegreerde Gaussische
    Fittingstraal [px]: 2
    Fittingmethode: Maximum likelihood
    Initiële sigma [px]: 0,75
    Multi-emitter fitting analyse: niet geselecteerd
    Visualisatie van de resultaten:
    Methode: Genormaliseerde Gaussische
    Vergroting: 7,3
    Updatefrequentie [frames]: 50
    Laterale onzekerheid: 20
    OPMERKING: De voorfilterparameters worden gebruikt om de detectie van enkele emitters boven de achtergrond te verbeteren. Ze dienen als startpunten, maar moeten geoptimaliseerd worden voor elke dataset. De parameters van de benaderende lokalisatie- en detectiemethode worden gebruikt voor enkelmolecuulbindingsgebeurtenissen. Het gebruik van lokale intensiteitsmaxima met 8-buurtconnectiviteit is aangetoond dat ze betrouwbare prestatiesleveren 31. De geïntegreerde Gaussische methode met maximum likelihood fitting werd gekozen omdat deze veel wordt gebruikt en een betrouwbare benadering biedt van de point spread function (PSF) in single-molecule imaging toepassingen 32,33,34,35. De visualisatiemethode die in dit protocol wordt gebruikt is genormaliseerd Gaussisch. Gebruikers kunnen de visualisatiemethode kiezen die het beste bij hun data past. De vergroting was ingesteld om een gereconstrueerde pixelgrootte van 20 nm te geven, wat passend is voor de verwachte lokalisatieprecisie die haalbaar is met antilichaam-gebaseerde labeling, waarbij de koppelingsfout ongeveer ~10 nm bedraagt. De vergrotingsfactor van 7,3 werd berekend door de diffractiebeperkte pixelgrootte te delen door de gewenste gereconstrueerde pixelgrootte (147 nm / 20 nm = 7,3). De updatefrequentie bepaalt hoe vaak het gereconstrueerde beeld tijdens de verwerking wordt ververst, maar beïnvloedt het eindresultaat niet. De laterale onzekerheid wordt ingesteld op 20 (maar niet geforceerd) zodat de reconstructie de berekende lokalisatie-onzekerheden bevat. Voor meer details over beschikbare opties, raadpleeg de ThunderSTORM Gebruikersgids30 of klik op het vraagteken naast het invoerveld.
  2. Begin de ThunderSTORM-analyse met een initiële sigma van 1,6 pixels en een passende straal van 3. Verfijn de parameters indien nodig. Multi-emitter fitting werd niet gebruikt, omdat de gebeurtenisdichtheden in de diffractie-beperkte beelden niet-overlappend bleven.
  3. Klik op Oké om de reconstructie uit te voeren. Zodra het is voltooid, opent het resultaatvenster automatisch.
  4. Gebruik de Plot-histogramfunctie om de piek-sigma te vinden. Converteer deze waarde (nm) naar pixels door te delen door de pixelgrootte van de ruwe data, en voer vervolgens de ThunderSTORM-analyse opnieuw uit met de nieuwe waarde voor de initiële sigma en de passingsradius ingesteld op een geheel getal dicht bij 3x de initiële sigma30.
  5. Bepaal de driftcorrectie met behulp van de geselecteerde fiduciale marker24.
  6. Voer beeldreconstructie uit over het volledige gezichtsveld en pas de berekende driftcorrectie toe.
  7. Voor nabewerking van de afbeelding klik je op het tabblad Filter in het resultaatvenster. Pas filters toe om slecht gelokaliseerde gebeurtenissen te verwijderen. In de weergegeven resultaten voor CD81 werden gebeurtenissen met sigma groter dan 200 nm en onzekerheid groter dan 20 nm verwijderd. Gebruik de Plot-histogramfunctie om de sigma-verdeling te onderzoeken en een geschikte cutoff te bepalen.
    OPMERKING: Enkele molecuullokalisaties met hoge sigma-waarden ontstaan doorgaans door zwakke fluoroforen met lage fotonenaantallen of door overlappende emitters. Lokalisaties met een onzekerheid groter dan 20 nm werden ook verwijderd, aangezien een onzekerheid die de uiteindelijke pixelgrootte overschrijdt een slechte lokalisatienauwkeurigheid aangeeft. Voor aanvullende richtlijnen over filterparameters, raadpleeg de ThunderSTORM User Guide30.
  8. Sla de resultaattabel op met localisatiegegevens van één molecuul voor downstream analyses door Exporteren te selecteren. Het geëxporteerde bestand zal in .csv bestandsformaat zijn en in dit protocol aangeduid worden als mSAL.csv. Sla het resulterende genormaliseerde Gaussiaanse beeld op.

5. Clusteranalyse

OPMERKING: Tijdens epitoop-probing interageren antilichamen met hun beoogde doelwitten (specifieke interacties) evenals met off-target moleculen (niet-specifieke interacties). Omdat mSAL afhankelijk is van de cumulatieve detectie van enkele antilichaam-antigeen bindingsgebeurtenissen, dragen sommige niet-specifieke interacties onvermijdelijk bij aan het gereconstrueerde beeld. Interacties tussen antilichamen en epitoop vertonen verschillende kinetische vingerafdrukken die in principe specifieke van niet-specifieke binding kunnen onderscheiden, waarbij specifieke en niet-specifieke gebeurtenissen worden onderscheiden door hun lokale interactiedichtheden, in plaats van door een enkele molecuul verblijf maal36. Hier wordt een dichtheidsgebaseerde ruimtelijke clustering van applicaties met ruis (DBSCAN)37-analyse beschreven om laag-dichtheidsgebeurtenissen te verwijderen, waarbij hoog-dichtheidsgebeurtenissen behouden blijven die waarschijnlijker specifieke antistofbindingen weerspiegelen. Daarnaast kan dichtheidsgebaseerde clustering ook kwantitatieve inzichten bieden in de nanoschaal ruimtelijke organisatie van eiwitten, met name die waarvan bekend is dat ze zich van nature organiseren in clusters, zoals CD81 in tetraspanine-verrijkte microdomeinen 38,39,40,41,42. De meegeleverde DBSCAN-analyse werd uitgevoerd met behulp van MATLAB 2025a. Voor gebruikers zonder toegang tot MATLAB wordt het uitvoeren van vergelijkbare DBSCAN-analyses met open-source alternatieven zoals Python of R 43,44,45 aanbevolen. De code die in dit protocol wordt gebruikt, kan worden verkregen uit: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. De code draaien
    1. Download het MATLAB-bestand via de GitHub-link hierboven.
    2. Start MATLAB en open de code. Op regels 37 en 38 stel je het minimale aantal punten (minPTS) en epsilon in voor de clusterparameters. De volgende parameters werden gebruikt:
      Jurkat T-cellen:
      minPTS: 7
      Epsilon: 60
      U2OS-cellen:
      minPTS: 7
      Epsilon: 80
      OPMERKING: Zie stap 5.2 voor meer details over het optimaliseren van deze parameters.
    3. Stel het bestandspad in de MATLAB-software in op de map die het gereconstrueerde mSAL.csv bestand bevat.
    4. Voer de code uit door op Run te klikken. De code zal de gebruiker vragen een bestand te selecteren. Selecteer het mSAL.csv-bestand en klik op Openen.
    5. De geclusterde gegevens worden automatisch opgeslagen in de map genaamd MATLAB Data in het bestandspad dat in de code is aangewezen. Open dit bestand in ThunderSTORM door te klikken op Plugins > ThunderSTORM > Importeren/Exporteren > Importeren resultaten.
    6. Bewaar het resulterende single-molecule localisatie microscopiebeeld.
  2. Optimalisatie van de clustering-inputs
    OPMERKING: De twee invoerparameters voor het DBSCAN-algoritme zijn de minPTS en epsilon. Epsilon definieert de straal rond een punt om zijn buurt vast te stellen, terwijl minPTS het minimale aantal punten binnen die buurt specificeert dat nodig is om een dicht gebied te vormen. Punten die aan deze dichtheidseis voldoen, worden geclassificeerd als kernpunten, en hun buurten worden recursief aan het cluster toegevoegd. Punten die niet aan de dichtheidseis voldoen maar binnen de buurt van een kernpunt vallen, worden als grenspunten aangeduid, terwijl alle overige punten als ruispunten worden beschouwd.
    1. Voer de analyse uit met de hierboven beschreven invoer (stap 5.1.2) als uitgangspunt. Kies een minPTS-waarde die hoger is dan het aantal ruislokalisaties, maar lager dan het aantal lokalisaties op de cel. Na het selecteren van minPTS past je epsilon aan zodat dit aantal lokalisaties binnen de buurtradius van representatieve on-cel regio's kan worden vastgelegd.
      OPMERKING: minPTS en epsilon kunnen onafhankelijk van elkaar worden aangepast. Een praktische aanpak om deze parameters te selecteren is om eerst de verstrooiingsgrafiek van ruispunten buiten de cel te onderzoeken en deze te vergelijken met het aantal locaties dat binnen vergelijkbare gebieden op de cel is waargenomen.
    2. Evalueer het venster met het label Figuur 2 dat de geclusterde gegevens toont. Als de data clusters op de cel behoudt met het verwachte fenotype en geminimaliseerde lokalisaties buiten de cel, zijn de clustering-invoer voldoende.
      OPMERKING: De geclusterde data moet de structuur behouden van de gegevens die met mSAL zijn verkregen. Als de clusters klein lijken, gelokaliseerd tot alleen de zeer hoogdichte gebieden van de oorspronkelijke data, en een aanzienlijk aantal bindingsgebeurtenissen uitsluiten die correneren met het verwachte fenotype, kunnen de clusterparameters te beperkend zijn. Als de niet-specifieke binding buiten de cel niet voldoende is verminderd bij grote clusters, kunnen de clusterparameters te inclusief zijn.
    3. Als de clusterparameters te beperkend zijn, verlaag dan de minPTS en verhoog het epsilon om meer punten in de geclusterde data op te nemen. Als de clusteringparameters te inclusief zijn, verhoog dan de minPTS en verlaag je de epsilon.
    4. Na het aanpassen van de minPTS en epsilon, voer je de code opnieuw uit. Herhaal stappen 5.2.2-5.2.3 totdat optimale clustering is bereikt.

6. Validatie van antistof die aan zijn doelwit bindt

OPMERKING: Voor membraaneiwitten zonder goed gedefinieerde morfologie kan het valideren van de nauwkeurigheid van de opgeloste structuren een uitdaging zijn. Om de specificiteit van de antilichamen te valideren, kunnen gebruikers een fluorescerend eiwit (FP) fusie van het doeleiwit tot expressie brengen. Als eerste controle kan conventionele immunofluorescentiekleuring worden uitgevoerd op cellen die de FP-fusie tot expressie brengen. Voor preciezere validatie bij het beoordelen van nieuwe antilichamen kan mSAL worden uitgevoerd op de FP-expressieve cellen om te bevestigen dat gelokaliseerde bindingsgebeurtenissen overeenkomen met het fluorescentief-getagde doelwit. Hier wordt een protocol beschreven voor het transfecteren van U2OS-cellen met CD81-mStayGold als voorbeeld, waarmee bevestiging mogelijk is dat CD81 mSAL-lokalisaties overeenkomen met de FP-gelabelde CD81 op het celoppervlak. Gebruikers kunnen elk geschikt fluorescerend eiwit vervangen, mits de emissie niet overlapt met het fluorescentiekanaal van het te valideren antilichaam.

  1. Zaad U2OS-cellen in een 8-put kamerdiabaan en groei tot ~70% confluentie. Cellen behouden in 200 μL complete groeimedia (DMEM aangevuld met 10% (v/v) foetaal rundereserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).
  2. Combineer 100 ng van het DNA-construct dat het eiwit codeert met een fluorescerende reporter met 5 μL Lipofectamine 2000. Vortex 30 seconden en 30 minuten incuberen op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Deze studie maakte gebruik van CD81 die is gefuseerd met mStayGold. Standaard moleculaire kloontechnieken werden gebruikt bij het genereren van DNA-plasmiden, hoewel deze in dit protocol niet worden beschreven. Het DNA: De lipofectamineverhoudingen die worden verstrekt, zijn geoptimaliseerd voor cellen die in 8-well-kamerglaasjes zijn geplaatst en kunnen aangepast moeten worden volgens de instructies van de fabrikant voor andere monsterformaten.
  3. Voeg 5 μL DNA/lipofectamine-oplossing toe aan cellen. Incubeer de kamerslide 4 uur bij 37 °C, aangevuld met 5%CO2 in een vochtige omgeving.
  4. Vervang de media door voorverwarmde complete groeimedia. Incubeer gedurende > 8 uur bij 37 °C, aangevuld met 5%CO2 in een vochtige omgeving om detecteerbare niveaus van eiwitexpressie mogelijk te maken.
  5. Beoordeel de fluorescentie-expressieniveaus op de cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop of een beeldcamera. Een transfectie-efficiëntie van ≥ 30% wordt aanbevolen. Als de fluorescentie-expressieniveaus suboptimaal zijn, optimaliseer dan de DNA: lipofectamine-verhouding volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    OPMERKING: Tijdelijk expressieve cellen moeten worden gebruikt voor antistofvalidatie binnen 24-48 uur na transfectie.
  6. Om de cellen te repareren, volg stap 1.2.8-1.2.13.
  7. Bewaar de vaste monsters in 200 μL DPBS met 5 mM natriumazide totdat ze klaar zijn voor beeldvorming. Monsters kunnen tot 1 maand worden bewaard bij 4 °C.
    VOORZICHTIG: Natriumazide is acuut giftig en kan dodelijk zijn als het wordt ingenomen. Draag de juiste PBM bij het hanteren van dit reagens. Bij huidcontact was je het aangetaste gebied onmiddellijk grondig met zeep en water. Verwijder het reagens volgens de richtlijnen van de instelling van de gebruiker en alle geldende lokale, staats- en federale regelgeving.
  8. Volg stappen 2.1-2.12 om de microscoop op te stellen en het monster te monteren. Identificeer een cel die het eiwit van belang tot expressie brengt met behulp van het fluorescentiesignaal.
  9. Ter referentie: maak een TIRF-afbeelding van de cel. Als een fluorescerend eiwit in hetzelfde beeldvormingskanaal als het mSAL-antilichaam wordt gebruikt, voer dan fotobleaching uit van het fluorescerende eiwit. Om het eiwit te fotobleken, gebruik je het maximale laservermogen gedurende > 10 minuten totdat er geen signaal meer wordt waargenomen.
  10. Voeg de voorbereide beeldbuffer toe aan de put en begin met beeldvormen. De analyse moet worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven (stap 4).
  11. Open zowel het gereconstrueerde beeld als het TIRF-beeld van het fluorescerende eiwit dat vóór de mSAL-opname is verkregen. Beoordeel de bindingslocaties van mSAL-antilichamen door het uiterlijk en de lokalisaties van het tot expressie gebrachte eiwit, afgebeeld in de diffractiebeperkte TIRF-afbeelding, te vergelijken met het mSAL-beeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in dit protocol beschreven mSAL-techniek maakt het mogelijk om individuele antistofbindingsgebeurtenissen aan hun overeenkomstige plasmamembraaneiwitdoelen te visualiseren, waardoor een superresolutiekaart van de verspreiding van membraaneiwitten wordt geproduceerd. CD81 wordt hier als representatief voorbeeld gebruikt, hoewel de aanpak gemakkelijk aanpasbaar is aan andere membraaneiwitten.

Het immobiliseren van Jurkat T-cellen met voldoende afstand tussen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De organisatie van plasmamembraaneiwitten speelt een essentiële rol bij het reguleren van celfunctie. Conventionele fluorescentiemicroscopietechnieken worden beperkt door de diffractiegrens van licht, waardoor hun nanoschaalorganisatie wordt verhuld. SMLM overwint deze beperking door ruimtelijke resoluties van 10-20 nm47 te bereiken, waardoor de karakterisering van hun nanoschaalassemblages 10,48,49 mogelijk is....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs geven aan dat zij geen belangenconflicten hebben om te melden.

Dankbetuigingen

Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number R35GM146786 en het College of Liberal Arts and Sciences van de University of Illinois Chicago. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-CD81 Alexa Fluor 488 AntibodyThermo Fisher ScientificMA5-44132Imaging antibody
Benchtop centrifugeEppendorf5424
Bovine serum albuminMilliporeSigmaA7906-100G
Chambered cover glass, 8-wellCellvisC8-1-N
DMEM mediaThermo Fisher Scientific11960069
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific14190-144
Fetal bovine serumMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehyde, 10 %Electron Microscopy Sciences16120
Gold colloids, 100 nmTed Pella15711−20Fiducial marker
Immersion oil Cargille Laboratories16245
Inverted microscope equipped with TIRF moduleNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMicroscope
Jurkat E6.1 cell lineMilliporeSigma88042803-1VLSuspension cells
Laser Launch, 6 lineOxxiusL6CC-CS8-1511Excitation laser
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfection reagent
Microcentrifuge tube, 1.5 mL VWR89000-028
Microscopy imaging softwareNikon InstrumentsNIS-Elements Advanced ResearchImage acqisition software
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Microscope objective
Paraformaldehyde, 16 %Electron Microscopy Sciences15710
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122Antibiotics
Poly-L-Lysine solution, 0.01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS CameraTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CCamera
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-093Media for suspension cells
Sodium azideThermo Fisher Scientific19038-1000
Sodium borohydrideMilliporeSigma213462-25G
T25 culture flasksThermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck microspheresFiducial marker
Tissue culture dish, 100 mm Corning353003
U2OS cell lineATCCHTB-96Adherent cells

Referenties

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Plasmamembraansuperresolutie-microscopieCD81-eiwitdichtheidsgebaseerde clusteringantilichaambindingdriftcorrectietherapeutische antilichamen
Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.