Method Article

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het plasmamembraan bepaalt de celvorm en dient als het interface dat de intercellulaire communicatie regelt. Membraaneiwitten vormen een belangrijke klasse van therapeutische doelwitten; Daarom biedt super-resolutie van het celmembraan via zijn constitutieve eiwitten veel potentie in de vooruitgang van celbiologie en antilichaamtherapieën. In dit opzicht maakt single-molecule localization microscopy (SMLM) nanoschaalvisualisatie van eiwitorganisaties op biologische structuren mogelijk. Ondanks het belang ervan brengt het toepassen van SMLM op plasmamembraaneiwitten unieke uitdagingen met zich mee. In dit protocol presenteren we een effectieve aanpak met behulp van time-lapse single-antibody labeling (SAL), genaamd membraan SAL (mSAL). We geven gedetailleerde stapsgewijze instructies, waaronder optimalisatie van de antistofconcentratie, laservermogensdichtheid, duur van niet-verlichtingsintervallen, beeldreconstructie en dichtheidsgebaseerde clusteranalyse, om nanoschaal membraaneiwitverdeling en membraanmorfologie op te lossen. We gebruiken het tetraspanine-eiwit CD81 als modelmembraaneiwit om de capaciteit van mSAL aan te tonen op zowel hechtende als suspensiezoogdiercellen. Naast het super-oplossen van het celmembraan en de distributie van membraaneiwitten, maakt onze techniek het mogelijk de farmacodynamiek van therapeutische antilichamen die interageren met hun membraandoelen in de natuurlijke membraanomgeving te onderzoeken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het plasmamembraan bevat een diverse reeks eiwitten die de celmobiliteit, adhesie, waarneming en intercellulaire communicatie reguleren. Het begrijpen van de nanoschaalverdeling van plasmamembraaneiwitten is belangrijk, aangezien de functie van eiwitten vaak niet alleen wordt bepaald door expressieniveaus, maar ook door hun ruimtelijke organisatie op het membraan 1,2. Opmerkelijk is dat veel therapeutische antilichamen membraaneiwitten 3,4 aanpakken, waardoor nanoschaalonderzoeken essentieel zijn om te begrijpen hoe an....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol gebruikt de gevestigde Jurkat E6.1- en U2OS-cellijnen en bevat geen primaire menselijke of levende dierlijke materialen.

1. Celzaaien/landing en fixatie

OPMERKING: De monstervoorbereiding volgt standaard immunofluorescentie (IF) kleuringsprotocollen, geoptimaliseerd om de subcellulaire organisatie van plasmamembraaneiwitten over verschillende celtypen te behouden. Als er een gevestigd immunokleuringsprotocol bestaat voor het doelwit van interesse, kunnen gebruikers dat protocol volgen tot aan de monsterblokkerende stap 1.2.14. Single-antibody labeling (SAL) is afhankel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in dit protocol beschreven mSAL-techniek maakt het mogelijk om individuele antistofbindingsgebeurtenissen aan hun overeenkomstige plasmamembraaneiwitdoelen te visualiseren, waardoor een superresolutiekaart van de verspreiding van membraaneiwitten wordt geproduceerd. CD81 wordt hier als representatief voorbeeld gebruikt, hoewel de aanpak gemakkelijk aanpasbaar is aan andere membraaneiwitten.

Het immobiliseren van Jurkat T-cellen met voldoende afstand tussen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De organisatie van plasmamembraaneiwitten speelt een essentiële rol bij het reguleren van celfunctie. Conventionele fluorescentiemicroscopietechnieken worden beperkt door de diffractiegrens van licht, waardoor hun nanoschaalorganisatie wordt verhuld. SMLM overwint deze beperking door ruimtelijke resoluties van 10-20 nm47 te bereiken, waardoor de karakterisering van hun nanoschaalassemblages 10,48,49 mogelijk is........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs geven aan dat zij geen belangenconflicten hebben om te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number R35GM146786 en het College of Liberal Arts and Sciences van de University of Illinois Chicago. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD81 Alexa Fluor 488 AntibodyThermo Fisher ScientificMA5-44132Imaging antibody
Benchtop centrifugeEppendorf5424
Bovine serum albuminMilliporeSigmaA7906-100G
Chambered cover glass, 8-wellCellvisC8-1-N
DMEM mediaThermo Fisher Scientific11960069
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific14190-144
Fetal bovine serumMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehyde, 10 %Electron Microscopy Sciences16120
Gold colloids, 100 nmTed Pella15711−20Fiducial marker
Immersion oil Cargille Laboratories16245
Inverted microscope equipped with TIRF moduleNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMicroscope
Jurkat E6.1 cell lineMilliporeSigma88042803-1VLSuspension cells
Laser Launch, 6 lineOxxiusL6CC-CS8-1511Excitation laser
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfection reagent
Microcentrifuge tube, 1.5 mL VWR89000-028
Microscopy imaging softwareNikon InstrumentsNIS-Elements Advanced ResearchImage acqisition software
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Microscope objective
Paraformaldehyde, 16 %Electron Microscopy Sciences15710
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122Antibiotics
Poly-L-Lysine solution, 0.01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS CameraTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CCamera
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-093Media for suspension cells
Sodium azideThermo Fisher Scientific19038-1000
Sodium borohydrideMilliporeSigma213462-25G
T25 culture flasksThermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck microspheresFiducial marker
Tissue culture dish, 100 mm Corning353003
U2OS cell lineATCCHTB-96Adherent cells

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMembrane ProteinsSingle Antibody LabelingPlasma MembraneSuper Resolution MicroscopyCD81 ProteinDensity Based ClusteringAntibody BindingDrift CorrectionTherapeutic Antibodies

Related Articles