Fytochemische profilering, gaschromatografie–massaspectrometrie-analyse en in vivo-activiteit van Terminalia mantaly bij ratten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat fytochemische analyse, gaschromatografie–massaspectrometriekarakterisering en gevalideerde in vivo assays integreert om de ontstekingsremmende, pijnstillende en koortsdempende werking van Terminalia mantaly te evalueren, waarmee een reproduceerbaar kader wordt geboden voor farmacologische beoordeling van medicinale planten.

Samenvatting

Synthetische medicijnen tegen ontsteking, pijn en koorts zijn effectief, maar veroorzaken vaak bijwerkingen, waardoor de interesse in plantaardige therapeutische alternatieven toeneemt. Terminalia mantaly H. Perrier, traditioneel gebruikt in de Afrikaanse geneeskunde, heeft beperkte wetenschappelijke bevestiging. Deze studie presenteert een geïntegreerd experimenteel protocol dat fytochemische screening, kwantitatieve analyse van fenolische en flavonoïde verbindingen, gaschromatografie–massaspectrometrie (GC-MS) karakterisering en in vivo farmacologische tests combineert om het therapeutische potentieel van het methanolische extract van T. mantaly te evalueren. Fytochemische screening bevestigde de aanwezigheid van meerdere bioactieve klassen, en GC–MS-analyse identificeerde twintig bestanddelen, waaronder vetzuren, fytosterolen, tocopherolen en andere bioactieve verbindingen met bekende ontstekingsremmende en antioxidante eigenschappen. In vivo farmacologische evaluatie bij ratten toonde dosisafhankelijke ontstekingsremmende activiteit aan in het carrageenan-geïnduceerde pooedeemmodel, een significante verlenging van de pijn-onttrekkingslatentie bij de staartonderdompelingsassay, en een vermindering van door gist veroorzaakte pyrexia. Bij hogere doseringen vertoonde het extract effecten vergelijkbaar met standaardmedicijnen zoals diclofenac en paracetamol. Beoordelingen van acute toxiciteit en cytotoxiciteit gaven een gunstig veiligheidsprofiel aan binnen het geteste dosisbereik. Samen valideren deze bevindingen het etnomedisch gebruik van T. mantaly en tonen ze een reproduceerbaar experimenteel kader aan om fytochemische samenstelling te koppelen aan farmacologische activiteit. Het protocol biedt een praktische methodologische referentie voor onderzoekers die medicinale planten onderzoeken en ondersteunt de ontwikkeling van plantafgeleide middelen voor de behandeling van ontstekings- en koortsaandoeningen.

Inleiding

Ontsteking, pijn en koorts zijn onderling verbonden pathologische processen die ten grondslag liggen aan een breed scala aan acute en chronische ziekten. Hoewel synthetische geneesmiddelen zoals niet-steroïde ontstekingsremmers, corticosteroïden en paracetamol de basis van de therapie blijven, wordt hun langdurige gebruik vaak geassocieerd met gastro-intestinale irritatie, niercomplicaties, hepatotoxiciteit en andere^bijwerkingen. Deze beperkingen hebben geleid tot een groeiende interesse in medicinale planten als veiligere, duurzamere alternatieven voor het beheersen van ontstekings- en koortsaandoeningen. Natuurlijke producten zijn bekend om hun rijke diversiteit aan bioactieve moleculen, waarvan vele als voorlopers dienen voor de moderne geneesmiddelenontwikkeling. In deze context heeft T. mantaly, een lid van de familie Combretaceae, aandacht getrokken vanwege het etnomedicinale gebruik in traditionele Afrikaanse systemen voor de behandeling van infecties, gastro-intestinale aandoeningen en ontstekingsaandoeningen ^2,3. Ondanks de traditionele relevantie blijven systematische farmacologische studies die het therapeutisch potentieel bevestigen beperkt. In het bijzonder is er een tekort aan uitgebreide onderzoeken die fytochemische screening, biologische evaluaties in vivo en geavanceerde chemische profileringsmethoden, zoals GC–MS, integreren. Het dichten van deze kloof is cruciaal om de folkloristische toepassingen wetenschappelijk te onderbouwen en potentiële loodverbindingen voor farmaceutisch gebruik te identificeren⁴. In de huidige studie werd het methanolzuurextract van T. mantaly onderworpen aan een gedetailleerde fytochemische en farmacologische evaluatie. Voorlopige analyse bevestigde de aanwezigheid van belangrijke metabolieten, waaronder fenolen, flavonoïden, tannines, saponinen en terpenoïden, die allemaal bekend staan om hun bijdragen aan ontstekingsremmende, pijnstillende en antioxidante effecten⁵. Kwantitatieve tests toonden verder aan dat het extract aanzienlijke niveaus van fenolische en flavonoïde verbindingen bevatte, met waarden vergelijkbaar met referentienormen, wat wijst op een sterk antioxidantpotentieel.

Diermodellen werden gebruikt omdat de geëvalueerde farmacologische responsen geïntegreerde ontstekings-, neurale en thermoregulatieve routes omvatten die niet in vitro kunnen worden gereproduceerd. De in vivo assays leverden duidelijk farmacologisch bewijs van bioactiviteit. De ontstekingsremmende (pooedeem veroorzaakt door carrageenan), pijnstillende (staartonderdompeling) en antipyretische (pyrexie veroorzaakt door gist) eigenschappen werden getest bij ratten, waarbij dosisafhankelijke ontstekingsremmende werking vergelijkbaar was met die van diclofenacnatrium bij hogere doseringen. Evenzo verhoogde het extract de latenties bij de staartonderdompeling bij ratten, wat de pijnstillende effectiviteit bevestigde, terwijl door gist geïnduceerde pyrexiemodellen duidelijke antikoortseffecten lieten zien, die nauw overeenkwamen met die van paracetamol⁶. Chemische profilering via GC–MS-analyse bood diepere inzichten in de bioactieve samenstelling. In totaal werden 20 verbindingen geïdentificeerd, waaronder 3,5-dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-one, linolzuur, γ-sitosterol, squaleen en vitamine E. Deze verbindingen zijn goed gedocumenteerd vanwege hun antioxidante, ontstekingsremmende en cardioprotectieve eigenschappen, wat de farmacologische resultaten ondersteunt^{die zijn} waargenomen ^7,8. Belangrijk is dat toxiciteitsbeoordelingen verwaarloosbare cytotoxische effecten aan het licht brachten, wat de veiligheid bij de geteste doseringen onderstreept. Gezamenlijk pakt deze studie een cruciale kloof aan door zowel fytochemisch als farmacologisch bewijs te leveren voor de medicinale waarde van T. mantaly. De bevindingen onderbouwen niet alleen de traditionele toepassingen, maar benadrukken ook het potentieel als natuurlijke bron van loodverbindingen voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen ontstekingen en aanverwante aandoeningen. De experimentele modellen die in deze studie zijn gebruikt, weerspiegelen voornamelijk acute ontstekings- en nociceptieve responsen en bieden daarom voorlopig farmacologisch bewijs in plaats van een directe indicatie van chronische therapeutische effectiviteit.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens internationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en voldeden aan de aanbevelingen van de OESO. Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Bahauddin Zakariya Universiteit in Multan. (Goedkeuringsnummer: 3 /UREC/2025). Alle inspanningen werden geleverd om het lijden van dieren te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren te verminderen.

1. Bereiding van T. mantaly whole methanolic extract (TMWM)

1. Verzamel verse stengels, wortels en bladeren van T. mantaly, verifieer het plantmateriaal en doe een vouchermonster in een erkend herbarium.
   OPMERKING: Het plantmateriaal dat in deze studie is gebruikt, is verzameld bij Punjab Nursery, Mattital Road, Multan, op 12 november 2023. De geografische coördinaten van de verzamellocatie zijn 30,2236° N, 71,4755° E. De plant werd taxonomisch geauthenticeerd door taxonoom Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, hoogleraar botanica aan de Bahauddin Zakariya Universiteit in Multan, en een voucherexemplaar (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) werden ondergebracht in het herbarium van de Bahauddin Zakariya Universiteit in Multan. De plant werd verzameld uit zijn natuurlijke habitat onder geschikte omgevingsomstandigheden, en de verzamellocatie werd vastgelegd met foto's.
2. Was het plantmateriaal met kraanwater gevolgd door gedestilleerd water om verontreinigingen te verwijderen, en droog vervolgens in de schaduw bij 25–30 °C gedurende 7–10 dagen totdat een constant gewicht is bereikt.
3. Maal het gedroogde materiaal tot grof poeder en weeg 500 g met een analytische weegschaal. Doe het poeder over in een schone glazen container en voeg 2,5 liter methanol toe.
4. Macereer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 72 uur met wisselvallig schudden elke 6–8 uur. Filter door Whatman No.1 filterpapier.
5. Concentreer het filtraat onder verminderde druk met een roterende verdamper bij 39 °C, en bewaar het gedroogde extract vervolgens in luchtdichte containers op kamertemperatuur tot gebruik.
   VOORZICHTIG: Methanol is giftig en brandbaar. Voer het hanteren uit in een dampkap terwijl je handschoenen en beschermende bril draagt. Verwijder oplosmiddelafval volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
   OPMERKING: Het gedroogde extract kan enkele weken in luchtdichte containers op kamertemperatuur worden bewaard voordat verdere analyse plaatsvindt.

2. Schatting van het totale fenolische gehalte (Folin–Ciocalteu-methode)

1. Bereid een gallische zuurvoorraadoplossing (100 μg/mL) voor door 10 mg gallisch zuur op te lossen in 100 mL methanol en bereid seriële verdunningen voor variërend van 1–10 μg/mL.
2. Los 10 mg extract op in 10 mL methanol om een oplossing van 1 mg/mL te verkrijgen. Breng 0,5 mL van elke standaard of monster over in reageerbuizen.
3. Voeg 2,5 mL Folin–Ciocalteu-reagens toe verdund 1:1 met water, en voeg vervolgens 2,0 mL 7,5% natriumcarbonaatoplossing toe. Meng en breng op 25 ± 2 °C gedurende 30 minuten.
4. Meet de absorptie bij 765 nm ten opzichte van een reagensblank en bereken het totale fenolgehalte als mg gallienzuurequivalenten per g extract.

3. Schatting van het totale flavonoïdengehalte (aluminiumchloridemethode)

1. Bereid een rutin-voorraadoplossing (1000 μg/mL) door rutin op te lossen in methanol, en maak vervolgens seriële verdunningen in het bereik van 10–80 μg/mL.
2. Breng 0,5 mL van de standaard- of extractoplossing over in reageerbuizen en voeg 1,5 mL methanol, 0,1 mL 10% aluminiumchloride (AlCl₃) oplossing, 0,1 mL 1 M kaliumacetaatoplossing en 2,8 mL gedestilleerd water toe.
3. Incubeer 30 minuten op kamertemperatuur en meet de absorptie bij 415 nm. Uitdruk resultaten als mg rutin-equivalenten per g extract⁹.

4. Gaschromatografie–massaspectrometrie (GC–MS) analyse

1. Los 10 mg extract op in 1 mL HPLC-methanol en filter via een 0,22 μm spuitfilter in een GC-flesje.
2. Voer analyse uit met een Agilent 7890B GC gekoppeld aan een 5977A MS uitgerust met een HP-5MS capillaire kolom (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Gebruik helium als draaggas bij 1,0 mL/min met injectortemperatuur van 250 °C.
3. Houd de ionenbrontemperatuur van 230 °C en de quadrupooltemperatuur van 150 °C. Programmeer de oven van 60 °C (2 minuten vasthouden) naar 180 °C bij 10 °C/min en vervolgens naar 280 °C bij 5 °C/min met een laatste houdpauze van 10 minuten.
4. Injecteer 1 μL van het gefilterde extract in splitmodus (10:1) en neem chromatogrammen op over een m/z-bereik van 40–600. Voer een oplosmiddel-blanco uit voordat je het monster injecteert.
5. Identificeer verbindingen door spectra te vergelijken met de NIST-massaspectrale bibliotheek en bevestig identiteiten met behulp van retentietijd en normalisatie van het piekgebied.

5. Ontstekingsremmende activiteit (door carrageenaan geïnduceerd pootoedeem)

1. Gebruik gezonde Albino Wistar-ratten van 180–220 g en pas 7 dagen aan. Fast dieren overnachten voor het experiment met vrije toegang tot water.
2. Verdeel dieren willekeurig in vijf groepen (n = 5 per groep). Geef normale zoutoplossing aan de controles; oraal toedienen van 100, 200 en 300 mg/kg aan de behandelgroepen; en het toedienen van diclofenacnatrium (40 mg/kg, subcutaan) aan de standaardgroep.
3. Na 1 uur injecteer je 0,1 ml vers bereide 1% carrageenaan in het subplantaire gebied van de rechterachterpoot.
4. Meet de pootdikte op 0, 1, 2, 3 en 4 uur met een digitale vernier-remklauw en bereken de toename ten opzichte van de basislijn.
5. Bepaal het percentage remming van oedeem vergeleken met de controlegroep¹⁰.
   VOORZICHTIG: Carrageenpoeder kan irritatie veroorzaken. Vermijd inademing en huidcontact en voer biologisch afval af volgens institutionele bioveiligheidsprocedures.

6. Pijnstillende activiteit (staartonderdompelingstest)

1. Gebruik geacclimatiseerde Albino Wistar-ratten die worden onderhouden onder een 12 uur licht/donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.
2. Verdeel dieren in vijf groepen (n = 5). Geef gedestilleerd water aan controles, haal oraal uit bij 100, 200 en 300 mg/kg aan de behandelgroepen, en paracetamol (20 mg/kg) aan de standaardgroep.
3. Houd het waterbad op 55 ± 1 °C. Dompel 1–2 cm van de distale staart in en registreer de basislijn onttrekkingslatentie met een afkaptijd van 15 seconden.
4. Herhaal de metingen 30, 60, 90 en 120 minuten na de behandeling, zodat elke keer hetzelfde deel van de staart wordt ondergedompeld.
5. Bereken de procentuele toename in latentie en druk de resultaten uit als gemiddelde ± SD.

7. Fieterende activiteit

1. Gebruik geacclimatiseerde ratten en registreer de normale rectale temperatuur met een gesmeerde digitale thermometer.
2. Bereid een suspensie van 20% brouwsist in gedestilleerd water en injecteer subcutaan met 10 mL/kg in de dorsum om koorts op te wekken.
3. Meet na 18 uur opnieuw de rectale temperatuur en sluit dieren uit die niet minstens 0,5 °C stijging.
4. Verdeel koortsratten willekeurig in vijf groepen (n = 5 per groep). Geef normale zoutoplossing aan de controlegroep, plantextract oraal bij 100, 200 en 300 mg/kg aan de behandelgroepen, en paracetamol (150 mg/kg) aan de standaardgroep.
5. Meet de rectale temperatuur op 0, 1, 2 en 3 uur na de behandeling en bereken de verlaging ten opzichte van de basislijn¹¹.
   VOORZICHTIG: Brouwersgistsuspensies zijn biologische materialen en moeten worden behandeld met standaard bioveiligheidsmaatregelen. Verwijder ongebruikte suspensie en besmette materialen als biologisch afval.
   OPMERKING: Na gistinjectie kunnen dieren worden teruggebracht naar kooien en onder standaardomstandigheden worden gehouden tot de temperatuurmeting.

8. Acute toxiciteitsstudies

1. Voer de studie uit volgens richtlijn 423 van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) met gezonde Albino Wistar-ratten van beide geslachten, die 180–220 g wegen.
2. Vasten dieren 's nachts voor dosering en verdeel ze willekeurig in groepen (n = 5 per groep).
3. Geef een enkele orale dosis van 5 g/kg lichaamsgewicht van het extract aan de behandeldieren en gedestilleerd water (1 mL/kg) aan de controledieren.
4. Observeer dieren continu gedurende de eerste 4 uur na dosering, periodiek gedurende de eerste 24 uur en dagelijks gedurende 14 dagen.
   OPMERKING: Observatiecriteria omvatten veranderingen in huid- en vachtconditie, ogen en slijmvliezen, ademhalingspatroon, speeksel, tremoren, stuiptrekkingen, locomotorische activiteit en algemene gedragsreacties.
5. Registreer klinische tekenen van toxiciteit, sterfte en lichaamsgewicht op dag 0, dag 7 en dag 14.
6. Beoordeel de veiligheid op basis van overlevingskans en waargenomen gedrags- of fysieke veranderingen¹².
   OPMERKING: Gedragsscores omvatten monitoring van houding, loop, activiteitsniveau, verzorgingsgedrag, reactie op externe prikkels en tekenen van lusteloosheid of hyperactiviteit.

9. Statistische analyse

1. Verzamel alle experimentele gegevens en geef de resultaten uit als gemiddelde ± standaarddeviatie met n = 5 dieren per groep.
2. Voer de gegevens in in kolomformaat in de GraphPad Prism-software.
3. Beoordeel de datanormaliteit met behulp van de Shapiro–Wilk-test voordat je vergelijkende analyse toepast.
4. Voer statistische analyse uit met GraphPad Prism-software door te selecteren: Analyseer → eenrichtingsvergelijkingen van ANOVA → Tukey.
5. Voer eenrichtingsanalyse van variantie uit, gevolgd door Tukey's post hoc meervoudige vergelijkingstest om de statistische significantie tussen groepen te bepalen.
6. Beschouw statistisch significante verschillen bij p < 0,05.

Resultaten

De experimentele benaderingen die in deze studie worden beschreven, genereerden reproduceerbare in vitro- en in vivo-gegevens die de beoordeling van zowel de fytochemische samenstelling als de farmacologische activiteiten van het methanolische extract van T. mantaly mogelijk maakten. Alle experimentele metingen werden uitgevoerd in replicaten en de resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De statistische significantie tussen groepen werd bepaald met behulp van eenrichtings-ANOVA g...

Discussie

In deze studie werd een combinatie van fytochemische karakterisering en gevestigde in vivo farmacologische modellen gebruikt om het ontstekingsremmende, pijnstillende en koortsdempende potentieel van het methanolische extract van T. mantaly te evalueren. De gebruikte experimentele modellen worden veel gebruikt in het onderzoek naar natuurlijke producten en bieden een praktisch kader voor de voorlopige beoordeling van biologische activiteit.

De reprodu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Albino Wistar-ratten	Institutioneel dierenverblijf	N/A	Experimentele dieren
Aluminiumchloride	Sigma-Aldrich	237051	Flavonoid assay
Brewer’s gist	Sigma-Aldrich	YSC2	Pyrexia-inductie
Carrageen	Sigma-Aldrich	C1013	Paw oedeem-inductie
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Monsterverwerking
Diclofenac natrium	Sigma-Aldrich	D6899	Anti-inflammatoire standaard
Digitale rectale thermometer	Omron	MC-246	Rectale temperatuurmeting
Digitale vernier-calliper	Mitutoyo	500-196-30	Paw dikte meting
Gedestilleerd water	In-house	N/A	Solvent
Folin–Ciocalteu reagens	Sigma-Aldrich	F9252	Fenolovereenkomst
Gallzuur	Sigma-Aldrich	G7384	Fenolovereenkomst
GC–MS systeem	Agilent Technologies	7890B–5977A	Fytochemisch profilering
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versie 8.0	Statistische analysesoftware
Methanol (HPLC-kwaliteit)	Merck	106009	Extractie solvent
Orale gavage-naald	Instech	FTP-20-38	Orale toediening
Paracetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Analgesische en antipyretische standaard
Kaliumacetaat	Merck	104820	Flavonoid assay
Roterende verdamper	Büchi	R-200	Extractconcentratie
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Flavonoid standaard
Natriumcarbonaat	Merck	106392	Fenolovereenkomst
UV–Visible spectrofotometer	Shimadzu	UV-1800	Absorbancemeting
Waterbad (thermostaat)	Memmert	WNB14	Staartonderdompelingstest