Transcriptome sequencing identificeerde centrale pathogene chemokines in atherosclerotische plaques

Samenvatting

Deze studie heeft als doel de onderliggende mechanismen van ontstekingsfactoren die geassocieerd zijn met atherosclerotische plaques (AP) te analyseren met behulp van RNA-sequencing. De resultaten identificeerden CCL3, CCL4 en CXCL1 belangrijke inflammatoire hubgenen in AP. Deze chemokines kunnen atherosclerose aanjagen door de opbouw van M0-macrofagen te bevorderen terwijl ze beschermende immuuncellen onderdrukken, wat potentiële therapeutische doelwitten onthult.

Samenvatting

Atherosclerotische plaque (AP) is een soort inflammatoire vezelweefselproliferatieve ziekte na beschadiging van endotheelcellen en gladde spiercellen in de arteriewand, wat kan leiden tot verschillende gradaties van obstructie van de cardiovasculaire en cerebrovasculaire bloedtoevoer. Effectieve therapeutische benaderingen gericht op ontsteking zijn echter tot nu toe grotendeels uitgevallen, wat suggereert dat aanvullende inzichten nog nodig zijn. In deze studie was het doel om transcriptomische veranderingen in AP gerelateerd aan inflammatoire factoren te analyseren met behulp van RNA-sequencing (RNA-seq). RNA-seq werd uitgevoerd op monsters van AP-patiënten (n = 11) en controlepersonen (n = 3). Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) werden geïdentificeerd met Metascape, gevolgd door KEGG-routeverrijkingsanalyse met het clusterProfiler-pakket in R-software, immuuninfiltratieanalyse met CIBERSORT, en een eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerk met behulp van de STRING-database. Hubgenen binnen het PPI-netwerk werden geïdentificeerd met behulp van de CytoHubba-plugin. In totaal werden 3713 DEG's geïdentificeerd in de AP-groep, waaronder 2097 up-regulated en 1616 downregulated genen. De resultaten toonden aan dat DEG's voornamelijk verrijkt waren in immuun- en ontstekingsgerelateerde routes. Drie ontstekingsgerelateerde factoren CCL3, CCL4 en CXCL1 werden beschouwd als belangrijke hubgenen in het pathologische proces van AP. Immuuninfiltratieanalyse toonde een onderscheidende microomgeving in AP aan, gekenmerkt door een significante toename van M0-macrofagen samen met een vermindering van CD8⁺ T-cellen, geactiveerde NK-cellen en rustende mastcellen binnen AP. Samenvattend beschrijven deze procedurele bevindingen de differenteniële expressie van CCL3, CCL4 en CXCL1 en hun associatie met een veranderde immuuncelsamenstelling in AP, waarbij de drie chemokines als potentiële kandidaten voor verder mechanistisch onderzoek worden benadrukt.

Inleiding

Hart- en vaatziekten (CVD) vormen wereldwijd een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid¹. Naarmate de wereldwijde trend van veroudering in de bevolking toeneemt^{, neemt ook} het incidentie van CVD toe. Daaronder is atherosclerotische plaque (AP) een van de belangrijkste oorzaken van CVD³. AP is een chronische ontstekingsziekte, die wordt gekenmerkt door de geleidelijke ophoping van lipiden in de intima van de slagaders en de vorming van plaques⁴. AP is de gemeenschappelijke basis voor cardiovasculaire en cerebrovasculaire gebeurtenissen en betreft voornamelijk grote en middelgrote slagaders, wat leidt tot ischemie en letsel, en is een belangrijke factor die cardiovasculaire en cerebrovasculaire ziekten en overlijden^veroorzaakt. Door het ontbreken van duidelijke symptomen in de vroege stadia is AP meestal gevorderd tegen de tijd dat het wordt vastgesteld, wat resulteert in een hoog sterftecijfer^{van 6}. De behandeling van AP richt zich op de risicofactoren, waaronder aanpasbare factoren zoals lage lichamelijke activiteit, zittend gedrag, roken, psychische problemen⁷, en obesitas en type 2 diabetes door een vetrijk dieet, evenals niet-modificeerbare factoren zoals genen, leeftijd en geslacht⁸. Recente studies hebben aangetoond dat het metabool syndroom, homocysteïnemie, hyperurikemie en alvleesklierresistentie belangrijke risicofactoren zijn voor het ontstaan en de ontwikkeling van atherosclerose ^9,10.

Theorieën gerelateerd aan de pathogenese van AP omvatten voornamelijk theorieën over lipideninfiltratie, ontsteking, oxidatieve stressrespons, infectie en interactie tussen genetische en omgevingsfactoren^11,12. Onder hen worden ontsteking en oxidatieve stress erkend als de kernpathogenese van AP en nemen zij deel aan alle processen van ontstaan tot ontwikkeling en achteruitgang van AP¹³. Plotselinge schade aan AP, onstabiele plaque, activatie van bloedplaatjes en trombose zijn belangrijke pathogenese van myocardinfarct en hemorragische beroerte¹⁴. Met voortdurend onderzoek is vastgesteld dat AP niet alleen lipiden bevat, maar ook veel ontstekingscellen¹⁵. Roken, hypertensie, lipidenstoornissen, hyperinsulinemie, hyperglykemie, hoge urinezuur- en andere schadelijke prikkels zorgen ervoor dat witte bloedcellen en endotheelcellen continu oplosbare adhesiemoleculen en diverse cytokines vrijgeven en zo monocyten stimuleren om zich aan vasculaire endotheelcellen te hechten. De opgehoopte chemokines leiden verder tot de migratie van monocyten naar de subendotheelruimte en differentiëren zich tot macrofagen, die vervolgens het cholesterolrijke geoxideerde laagdichtheidslipoproteïne (LDL) in het weefsel fagocyteren, waardoor ze omzetten in schuimcellen en de vorming van lipidestrepen¹⁶ initiëren. De vroege pathologische schade van AS, namelijk lipidestrepen, bestaat voornamelijk uit macrofagen en T-lymfocyten, wat een typische ontstekingslaesie¹⁷ is. Daarom zijn verschillende ontstekingscellen en hun producten betrokken bij de start en progressie van AP¹⁸. Het ontstekingslandschap van AP is echter complex en omvat meerdere bekende en mogelijk onbekende factoren. Traditionele candidate-genbenaderingen slagen er mogelijk niet in dit volledige spectrum van ontstekingsfactoren te vangen.

Om deze beperking aan te pakken, maakten we gebruik van RNA-sequencing (RNA-seq), een onbevooroordeelde high-throughput transcriptomische methode. Deze benadering is vooral geschikt voor hypothese-genererende studies waarbij de belangrijkste moleculaire drijfveren niet vooraf zijn vastgesteld. In tegenstelling tot kandidaatgen- of microarray-gebaseerde methoden biedt RNA-seq een breder dynamisch bereik, een hogere gevoeligheid en de mogelijkheid om nieuwe transcripten te detecteren zonder voorafgaand probe-ontwerp^19,20. Deze kenmerken maken het bijzonder geschikt voor het ontdekken van ontstekingsgerelateerde signaturen in AP, waar de moleculaire basis onvolledig gekarakteriseerd blijft.

In deze studie werd RNA-seq uitgevoerd om de onderliggende mechanismen van ontstekingsfactoren die met AP geassocieerd zijn te analyseren. Bio-informatica-instrumenten met verschillende algoritmen werden gebruikt om te screenen op een reeks DEG's. Vervolgens werden verrijkingsanalyses (WGCNA, KEGG-route, mcode, GSEA, hubgenanalyse) en eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyse uitgevoerd. De resultaten van deze studie dragen bij aan een beter begrip van het moleculaire pathologische mechanisme achter ontstekingsgedreven AP en spelen een belangrijke rol bij het zoeken naar nieuwe biomarkers.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Liaocheng Volksziekenhuis (goedkeuringsnummer: 2023014) en hield zich aan de principes van de Verklaring van Helsinki. Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen. Formulieren voor geïnformeerde toestemmingen werden ondertekend door alle patiënten of hun families.

Patiënten en monsters

Deze studie analyseerde retrospectief 11 patiënten met ernstige carotisarteriestenose die van januari 2023 tot december 2023 een carotidarterectomie ondergingen op de afdeling Vasculaire Neurochirurgie, Liaocheng Volksziekenhuis, provincie Shandong, China. Deze patiënten werden ingeschreven als de AP-groep. De diagnose van halsslagaderstenose was gebaseerd op beeldvormende gegevens zoals CTA of cerebrale angiografie. De inclusiecriteria voor de AP-groep waren: (1) leeftijd tussen 50 en 80 jaar; (2) computertomografie, angiografie/digitale subtractie-angiografie, bevestigde intracraniële interne carotisarteriestenose ≥70%; (3) pre-on-start aangepaste Rankin-schaalscore ≤ 1; (4) geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënt of diens juridische vertegenwoordiger. De uitsluitingscriteria waren: (1) ontstekings- of immuunziekten; (2) aanwezigheid van psychiatrische stoornissen; (3) aanwezigheid van kwaadaardige tumoren; (4) zwangerschap, lactatie of vruchtbaarheidspotentie. Leeftijdsmatching Patiënten met ernstig traumatisch hersenletsel die in dezelfde periode orgaandonatie in hetzelfde ziekenhuis ondergingen, werden geselecteerd als controlegroep (NA; Normale controle, n = 3). Proefpersonen in de twee groepen werden gematcht op leeftijd, geslacht en body mass index om confounding factors uit te sluiten. De inclusiecriteria voor de controlegroep waren: (1) leeftijd tussen 50 en 80 jaar; (2) geen voorgeschiedenis van coronaire hartziekte, halsslagaderstenose of andere systemische vaatziekten; (3) geïnformeerde toestemming verkregen van de juridische vertegenwoordiger van de patiënt. Monsters van de arterie intima en plaque van de carotisarterie werden tijdens de carotisendarterectomie genomen uit de AP-groep, terwijl aorta intima-monsters werden genomen uit de controlegroep na orgaandonatie. Het vaat- en plaqueweefsel werd opgeslagen in vloeibare stikstoftanks voor latere tests. De basiskenmerken van AP-patiënten zijn weergegeven in Tabel 1.

Monstervoorbereiding

De totale RNA-extractie werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. RNA-concentratie en zuiverheid werden beoordeeld met een Nanodrop ND-2000 spectrofotometer op 260 nm en 280 nm (A260/A280-verhouding tussen 1,8 en 2,0). De RNA-integriteit werd beoordeeld met 2% agarosegelelektroforese bij 100 V gedurende 30 minuten. RNA-integriteitswaarden (RIN's) werden verkregen met de Agilent 2100 bioanalyzer (monsters met RIN ≥ 7,0 werden gebruikt voor downstream analyse). Alle monsterbehandelingen en RNA-extractieprocedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders gespecificeerd. Afval van TRIzol-reagens werd afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk chemisch afval.

RNA-sequencing

Na de behandeling van totaal RNA met DNase I werd mRNA verrijkt met Oligo D (T) magnetische kralen en vervolgens 5 minuten gefragmenteerd in korte stukken bij 94 °C. De resulterende mRNA-fragmenten dienden als sjabloon, met willekeurige oligonucleotide als primer. Eerste-streng cDNA werd gesynthetiseerd via het M-MuLV reverse transcriptase-systeem bij 42 °C gedurende 50 minuten, gevolgd door RNase H-gemedieerde afbraak van RNA-strengen. De synthese van de tweede streng werd uitgevoerd met behulp van dNTP's binnen het DNA-polymerase I-systeem. Het dubbelstrengs cDNA werd gezuiverd, uiteinden gerepareerd en voorzien van een "A"-overhang om de adapterligatie te vergemakkelijken. AMPure XP-kralen werden gebruikt om cDNA-fragmenten van 250-300 bp te selecteren, die vervolgens werden geamplificeerd via PCR. Daarna werden de versterkte producten gezuiverd om de uiteindelijke bibliotheek te genereren. Bibliotheeksequencing werd uitgevoerd op het Illumina HiSeq-platform met een leeslengte van 150 bp in pared-end. Voor gegevenskwaliteitscontrole (QC) werden ruwe gegevens met adaptersequenties of laagwaardige bases gefilterd met behulp van interne scripts. Vanwege sequencingfouten die door het instrument kunnen ontstaan, werd de datakwaliteit beoordeeld door de verdeling van sequencingfoutpercentages te analyseren (foutpercentage < 1% werd als acceptabel beschouwd). Daarnaast werd de distributie van GC-inhoud vastgesteld. Alle sequencingprocedures werden uitgevoerd bij omgevingstemperatuur, tenzij anders vermeld. Reagentia die gevaarlijke chemicaliën bevatten (bijv. DNase I-buffers) werden afgevoerd volgens institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.

QC-drempels en probleemoplossing

Alleen monsters met RIN ≥ 7.0 en bibliotheken met fragmentgrootte 250–300 bp werden gebruikt. Minimaal 14 miljoen ruwe reads per monster met Q30 ≥ 98% was vereist. De lage bibliotheekopbrengst werd opgelost door het aantal PCR-cycli te verhogen naar 18, maar 15 cycli hadden de voorkeur om de dubbele frequentie onder de 15% te houden.

Selectie van DEG's

We evalueerden de verdeling van genexpressieniveaus over verschillende monsters. Inter-steekproefcorrelatie van genexpressieniveaus werd gebruikt om de experimentele betrouwbaarheid en de geschiktheid van steekproefselectie te verifiëren. Principal component analysis (PCA) werd toegepast om intergroepsverschillen en intra-groep reproduceerbaarheid te evalueren. DEG's werden geïdentificeerd met behulp van de Metascape online database (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). DEG's werden gedefinieerd als die met |log₂(fold change) | > 1 en een p.-waarde < 0,05, die als statistisch significant werden beschouwd. Alle bio-informatische analyses werden uitgevoerd met standaardparameters, tenzij anders gespecificeerd. Als tussentijdse reproduceerbaarheidscontrole werden PCA-plots gegenereerd om te bevestigen dat monsters clusterden per groep in plaats van per batch.

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyse

KEGG (http://www.genome.jp/)-analyse is een systematische benadering om genfunctie te evalueren voor de ontdekking van biologische regulerende routes. Dit artikel verkreeg voor het eerst de officiële symboolconversiegen-ID van het differentiële gen uit org.Hs.eg (versie 3.12.0). KEGG-padanalyse werd uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket in R-software (versie 4.2.0). Een p. < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Een tussentijdse uitkomst was het genereren van een gerangschikte lijst van verrijkte routes met bijbehorende gentellingen en aangepaste p-waarden.

PPI-netwerkanalyse

Om het PPI-netwerk en het schermsleutelgen te construeren, werd de STRING-database (versie 11.0, https://string-db.org/) gebruikt. Alleen interacties met een samengestelde score boven de 0,9 werden als statistisch significant behouden. Het netwerk werd gevisualiseerd en geanalyseerd met behulp van Cytoscape (versie 3.10.1), een open-source bio-informatica-tool ontworpen voor het verkennen van moleculaire interactienetwerken. Hubgenen binnen het PPI-netwerk werden geïdentificeerd met behulp van de CytoHubba-plugin (versie 0.1).

Naafgen

De top 20 sleutelgenen zijn geselecteerd door CytoHubba Plugin. Rood duidt op hoge niveaus van het gen. De bio-informatica analyse van de hubgenen door Metascape online database (versie 3.5, http://metascape.org/gp/index) om 20 hubgenen te analyseren vooraf. Genverrijking werd geïdentificeerd in de volgende ontologieklassen: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Alle genen in het genoom dienen als verrijkingsachtergrond. Items met p. < 0,05, minimumaantal 3 en verrijkingsfactor > 1,5 werden gescreend.

Statistische analysemethode

SPSS 25.0 statistische software werd gebruikt om de gegevens te analyseren. De telgegevens werden uitgedrukt als frequentie of percentage, en de vergelijking tussen groepen werd getest met de Chi-kwadraattest. De meetgegevens waren consistent met het gemiddelde ± standaardafwijking van de normale verdeling, en de T-test werd gebruikt voor de vergelijking tussen groepen. p. < 0,05 werd als een significant verschil beschouwd.

Resultaten

RNA-seq data-analyse van differentiële genen in atherosclerotische plaques

Alleen samples met RIN ≥ 7.0 werden gebruikt voor bibliotheekvoorbereiding. Alle 14 monsters (11 AP, 3 controle) haalden deze drempel. Alle monsters werden in één batch gesequenced; daarom was er geen aanpassing van batch-effect nodig. Gemiddeld werden 16,8 miljoen ruwe reads per monster gegenereerd; Na kwaliteitsfiltering werden 16,5 miljoen schone reads (98%) behouden, waarvan 91% uniek was gemapt op het menselijke referentiegenoom (HG38). De analyse van DEG toonde aan dat er 2097 opgereguleerde en 1616 gelaagde genen (|log2FC| >1, P <0,05) waren bij patiënten met plaques van atherosclerose vergeleken met gezonde controles (Figuur 1A). De heatmap van de top 20 opgereguleerde en neergereguleerde differentieel expressieve genen werd weergegeven in Figuur 1B. Transcriptoom RNAseq-sequencing toonde monstercorrelaties aan (Figuur 1C). De correlatie tussen co-expressieve genmodules en fenotypes werd geanalyseerd door WGCNA (Figuur 1D). PCA-analyse toonde aan dat er een significant verschil was tussen de NA-groep en de AP-groep (P .< 0,05) (Figuur 1E).

KEGG-verrijkingsanalyse van differentiële genen

KEGG-routeverrijkingsanalyse met behulp van het clusterProfiler-pakket in R-software (versie 4.2.0) werd afzonderlijk uitgevoerd op de opgereguleerde en neergereguleerde differentieel tot expressie gebrachte genen in de ziektegroep (Figuur 2A,B). De resultaten toonden aan dat deze genen significant verrijkt waren in routes gerelateerd aan immuniteit en ontsteking, zoals hematopoëtische cellijn, reumatoïde artritis, focale adhesie, integrinesignalering en chemokine-signaalroute.

GSEA-analyse

GSEA-analyse toonde aan dat de kerngenen in de experimentele groep voornamelijk aan de top verrijkt waren, wat een opwaartse regulatie laat zien (Figuur 3A). Kerngenen in de controlegroep waren voornamelijk verrijkt aan de onderkant, wat een neerwaartse trend laat zien (Figuur 3B). Samenvattend werden ontstekingsgenen opgereguleerd in de experimentele groep (ASA) en gedownreguleerd in de controlegroep (NA).

PPI-netwerkanalyse

In het PPI-netwerk dat wordt geanalyseerd met behulp van de STRING-database (versie 11.0), liggen knooppunten met dezelfde cluster-ID meestal dicht bij elkaar. Zoals te zien is in Figuur 4A, toonde deze clustering aan dat de overeenkomstige genen voornamelijk betrokken zijn bij de regulatie van celactivatie, ontstekingsrespons en celactivatie. Figuur 4B toonde hetzelfde netwerk gekleurd door p-waarden, waarbij clusters met meer genen significantere p-waarden vertonen.

Identificatie van hubgenen en analyse van immuuncelinfiltratie

DEG's werden geselecteerd voor mcode-analyse en de getoonde analyseresultaten die voornamelijk betrekking hebben op acetylcholinereceptoren (Figuur 5 en Tabel 2). Hubgenanalyse met de CytoHubba-plugin in Cytoscape identificeerde de top 20 hubgenen, waarvan de meeste geassocieerd waren met immuniteit en ontsteking (Figuur 6A, linker paneel). De top 10 hubgenen bestonden uit CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 en CCR5 (Figuur 6A, rechter paneel). De kruising van hubgenen met het olink-inflammatoire panel 92-genen onthulde 5 veelvoorkomende genen, waaronder CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 en CCL4 (Figuur 6B). De CIBERSORT-analyse toonde significante verschillen in immuuncelinfiltratie tussen de ziektegroep en gezonde controlegroepen. In vergelijking met de controlegroep vertoonde de ziektegroep een significant hoger aandeel M0-macrofagen (p < 0,05) (Figuur 6C). Omgekeerd waren de verhoudingen CD8 T-cellen, geactiveerde NK-cellen en de meeste rustcellen significant lager in de ziektegroep (p. < 0,05 voor alle) (Figuur 6C).

Functionele analyse van hubgenen

We analyseerden verder de biologische functie van het Hub-gen met behulp van de metascape-database, waaruit bleek dat deze genen voornamelijk geassocieerd zijn met cytokine-gemedieerde signaalroutes en calcium-gemedieerde signalering (Figuur 7A en Tabel 3). Celtype-signaturen werden vervolgens gebruikt om transcriptionele regulerende factoren van het hubgen te verrijken, waarbij werd aangetoond dat hubgenen voornamelijk gerelateerd waren aan gao dikke darm 24W C11-paneth-achtige cel, cui ontwikkelende C8-macrofagen en manno midbrain neurotypes hmgl (Figuur 7B). De ziekteverrijkingsanalyse van de DisGeNET-database toonde aan dat de hubgenen geassocieerd waren met huidlaesies, epstein-barrvirusinfecties en tekenbome-encefalitis (Figuur 7C). Analyse van de weefselkenmerkende verrijking in de PaGenBase-database toonde aan dat hubgenen voornamelijk verrijkt waren in de milt, het bloed en de long (Figuur 7D). Daarnaast onthulde TRRUST-databaseanalyse dat RELA en NFKB1 de belangrijkste transcriptiefactoren zijn die de hubgenen reguleren (Figuur 7E).

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

De verwerkte telmatrix wordt geleverd als aanvullende bestanden (Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2). Alle andere gegevens worden volledig gepresenteerd in het artikel. Ruwe sequencinggegevens zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek.

Figuur 1: Analyse van DEG's. (A) Gezonde plaques en atherosclerotische plaques, differentiële genvulkaankaart, upregulated 2097, downregulated 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0,05). (B) Heatmap van de top 20 opge- en downreguleerde differentieel expressieve genen. (C) Steekproefcorrelatieanalyse. (D)De correlatie tussen co-expressieve genmodules en fenotypes werd geanalyseerd door WGCNA. (E) PCA-analyse (NA-groep verschilde significant van AP-groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: KEGG-analyse. De KEGG-routeverrijkingsanalyse werd afzonderlijk uitgevoerd op de opgereguleerde (A) en neergereguleerde (B) differentieel tot expressie gebrachte genen in de ziektegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: GSEA-analyse. (A) GSEA-analyse toonde aan dat de kerngenen in de experimentele groep voornamelijk aan de top verrijkt waren, wat een opwaartse regulatie laat zien. (B) In de controlegroep waren de kerngenen voornamelijk aan de onderkant verrijkt en lieten ze een neerwaartse trend zien. Samenvattend werden ontstekingsgenen opgereguleerd in de experimentele groep (AP) en gedownreguleerd in de controlegroep (NA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: PPI-netwerkdiagram. (A) Gekleurd op cluster-ID, waarbij knooppunten die dezelfde cluster-ID delen meestal dicht bij elkaar liggen. (B) Kleuren met P-waarden, waarbij items met meer genen meer significante P-waarden hebben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: mcode-analyse van TEG's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Analyse van het naafgen. (A) Top 20 hubgenen (linker paneel) en top 10 hubgen (rechter paneel) verkregen via gradenberekeningsmethode via de CytoHubba-plugin in Cytoscape, die voornamelijk geassocieerd zijn met immuniteit en ontsteking. (B) Snijpunt van hubgenen en olink inflammatoire panel; 92 genen identificeerden 5 intersectiegenen. (C) Het CIBERSORT-algoritme werd gebruikt om de infiltratieabundantie van 22 immuuncelsubsets tussen AP- en NA-groepen te vergelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bio-informatica analyse van hubgenen. (A) Functionele annotatie van hubgenen met behulp van de Metascape-database. (B) Verrijkingsanalyse van transcriptieregulatoren geassocieerd met hubgenen op basis van celtype-signaturen. (C) Ziekteverrijkingsanalyse van hubgenen uitgevoerd met de DisGeNET-database. (D) Weefselspecifieke expressiepatronen van hubgenen geïdentificeerd via de PaGenBase-database. (E) Transcriptioneel regulatief netwerk van hubgenen geanalyseerd met behulp van de TRRUST-database. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MCODE	GA	Beschrijving	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Sterk calciumpermeabele nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Sterk calciumpermeable postsynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandemporiedomein kaliumkanalen	-10.3
MCODE_2	GA:0030322	Stabilisatie van membraanpotentiaal	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - rustmembraanpotentiaal	-9.7

Tabel 1: De basiskenmerken van AP-patiënten

MCODE	GA	Beschrijving	Log10(P)
MCODE_1	GA:0030322	Sterk calciumpermeabele nicotinische acetylcholinereceptoren	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Presynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Sterk calciumpermeable postsynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-16.7

Tabel 2: De MCODE-verrijkingsanalyse van DEG's.

MCODE	GA	Beschrijving	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Sterk calciumpermeabele nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Sterk calciumpermeable postsynaptische nicotinische acetylcholinereceptoren	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandemporiedomein kaliumkanalen	-10.3
MCODE_2	GA:0030322	Stabilisatie van membraanpotentiaal	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - rustmembraanpotentiaal	-9.7

Tabel 3: De MCODE-verrijkingsanalyse van het hubgen.

Aanvullend dossier 1: Controle (n=3) Genexpressie.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Patiënten (n=10) Kern tabelgen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Met de voortdurende verdieping van het onderzoek naar AP worden er voortdurend nieuwe cytokines in AP gedetecteerd, en ontsteking is een belangrijke factor geworden in het ontstaan en de ontwikkeling van AS^21,22. De activatie van albumine kan de verbinding tussen endotheelcellen en de vasculaire intimale matrix verbreken en endotheelcellen stimuleren om zich los te laten van de vasculaire intima. Geïnduceerd vasculair intimitaal letsel^23,24. Ontsteking induceert oxidatieve modificatie van LDL-C, en de aangepaste LDL-C leidt op zijn beurt tot het ontstekingsproces in de intima van de slagader, waardoor de vorming van AP²⁵ wordt versneld. Onstabiele plaques kunnen uiteindelijk scheuren en ACS veroorzaken bij gebruik van interne en externe oorzaken²⁶. Tijdens het ruptuur van plaque scheiden macrofagen, vaatvormige gladde spiercellen (VSMC) en lymfocyten ontstekingsfactoren af zoals leukocyteninterleukine-1 (IL-1), IL-6, intervasculaire adhesiefactor-1 en intercellulaire adhesiefactor-1. Tegelijkertijd is de expressie van leukocytenintegrine (CD11b/CD18), een receptor op monocyten en granulocyten, met^27,28 verhoogd. Het moleculaire mechanisme van ontsteking dat leidt tot de vorming van AP moet echter nog verder worden onderzocht.

Het voorkomen en de ontwikkeling van AP veroorzaakt door ontsteking is een complex verloop van multifactoractie, multi-genverandering en multistadia ziekte, vooral nauw verwant aan de abnormale expressie van veel genen. In deze studie bleek uit RNA-Seq en bio-informatica analyse dat, tussen gezonde controleweefsels en AP, de vulkaangrafiek van DEG's 2097 upreguliere en 1616 downgereguleerde genen liet zien. Verdere KEGG-verrijkingsanalyse van DEG's toonde aan dat de DEG's voornamelijk verrijkt waren in immuun- en ontstekingsgerelateerde routes. De analyse van de hubgenen identificeerde de top 10 hubgenen, bestaande uit CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 en CCR5. De kruising van hubgenen met het olink-inflammatoire panel 92-genen onthulde 5 veelvoorkomende genen, waaronder CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 en CCL4. Deze resultaten suggereren dat de ontstekingsgerelateerde factoren CCL3, CCL4 en CXCL1 een cruciale rol kunnen spelen in het pathologische proces van AP. Immuno-infiltratieanalyse toonde een duidelijk micro-milieu aan met een significante toename van M0-macrofagen, samen met verminderingen van CD8⁺ T-cellen, geactiveerde NK-cellen en rustende mastcellen binnen plaques.

M0-macrofagen vormen een niet-toegewijde pool die gemakkelijk geoxideerd LDL kan internaliseren en kan differentiëren tot schuimcellen, een kenmerkend evenement in vroege atherogenese²⁹. Het verhoogde aandeel M0-macrofagen dat in de ziektegroep is waargenomen, wijst op een ophoping van deze precursorcellen binnen de plaque-microomgeving. CCL4, voornamelijk geproduceerd door geactiveerde macrofagen en T-cellen, dient als een persistente stimulus die macrofagenactivatie ondersteunt via de NFκB-signaalroute, de expressie van adhesiemoleculen bevordert en matrixmetalloproteïnase-2 en -9 induceert, waardoor de overgang van M0-macrofagen naar een pro-atherogene toestand wordt vergemakkelijkt en de plaquestabiliteit direct in gevaar wordt^{gebracht 30}. Het verminderde aandeel CD8⁺ T-cellen kan het CCL3-gemedieerde onderdrukking van atheroprotectieve T-cel-subsets weerspiegelen. Komissarov et al. toonden aan dat T-celmigratie naar menselijke atherosclerotische plaques voornamelijk plaatsvindt via de CCR5-CCL3-as³¹. Bovendien ontdekten Döring et ^al.32 een niet-canoniek pad waarbij CCL17-signalen via CCR8 induceren om CCL3-expressie te induceren, wat op zijn beurt de differentiëring van regulerende T-cellen onderdrukt; genetische ablatie van CCL3 in CD4⁺ T-cellen verhoogde het aantal FoxP3⁺ Treg en beperkte de atherosclerose, terwijl CCL3-toediening de ziekte verergerde en de differentiatie van Treg beperkte. Deze verschuiving vermindert waarschijnlijk atheroprotectieve CD8⁺ regulerende T-cellen terwijl het pathogene effector T-cellen bevordert, wat resulteert in de netto afname van het CD8⁺ T-celaandeel zoals waargenomen in onze analyse. De afnames in geactiveerde NK-cellen en rustende mastcellen weerspiegelen waarschijnlijk veranderingen in activatiestatus in plaats van een absoluut verlies van deze populaties. Bonaccorsi et ^al.33 rapporteerden dat symptomatische halsslagaderplaques verhoogde NK-celinfiltratie en productie van IFN-γ vertonen, wat direct NK-celactivatie koppelt aan klinische plaque-instabiliteit. Voor mestcellen toonden Wezel et ^al.34 aan dat chemokines die vrijkomen uit geactiveerde mestcellen, met name CXCL1, neutrofiele rekrutering via de CXCL1/CXCR2-as induceren, waardoor de voortdurende ontstekingsrespons wordt verergerd en plaqueprogressie en destabilisatie wordt bevorderd. Dus het verminderde aandeel geactiveerde NK-cellen en rustende mastcellen weerspiegelt waarschijnlijk hun activatie, degranulatie of uitputting binnen het inflammatoire plaquemilieu, in plaats van een echte numerieke uitputting.

Er zijn verschillende beperkingen van deze studie. Ten eerste is deze studie uitsluitend gebaseerd op transcriptoomsequencing en wordt beperkt door de kleine steekproefgrootte. Naast de beperkte steekproefgrootte moeten verschillende technische beperkingen van het RNA-seq protocol worden opgemerkt. Bulk RNA-seq maskeert cellulaire heterogeniteit; enkelcelbenaderingen zijn nodig om celtype-specifieke expressie van CCL3, CCL4 en CXCL1 te onderscheiden. Computationele immuundeconvolutie (CIBERSORT) levert alleen schattingen, geen directe metingen. RNA-abundantie correleert niet altijd met eiwitniveaus; Orthogonale validatie is vereist. Toekomstige studies zouden deze beperkingen moeten aanpakken door gebruik te maken van single-cell transcriptomics, grotere en onafhankelijke cohorten, en orthogonale eiwitvalidatie.

Samenvattend onderstreepten de huidige bevindingen de belangrijke rol van ontstekingsfactoren in het pathofysiologische proces van AP. Daarnaast identificeerden we de hubgenen CCL3, CCL4 en CXCL1, die mogelijk een gecoördineerd chemokinenetwerk vormen dat atherosclerose aandrijft door de ophoping van M0-macrofagen te bevorderen, beschermende T-cel-subsets te onderdrukken en de activatietoestanden van NK-cellen en mestcellen te veranderen. Al met al benadrukken deze bevindingen de drie chemokines als cruciale regulatoren van het plaque-immuunmicro-milieu en potentiële therapeutische doelwitten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	RNA-extractie
Nanodrop ND-2000 spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	ND2000	RNA-concentratiedetectie
Agilent 2100 bioanalyzer	Agilent	G2939BA	RNA-kwaliteitscontrole
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Transcriptoomsequencing
Oligo D (T) magnetische kralen	New England Biolabs	S1550S	RNA-verrijking