Method Article

Hepatitis E Virus Fluorescentiereductie Neutralisatietest voor het meten van neutraliserende antilichaamtiters

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is geen standaard virusneutralisatietest beschikbaar voor het Hepatitis E-virus (HEV), een niet-cytopathisch positief strengs RNA-virus. Hier wordt een fluorescentie-reductie-neutralisatietest (FRNT) beschreven op basis van kwantificering van fluorescerend gelabeld viraal capside-eiwit om de effectiviteit van anti-HEV-antilichamen te evalueren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De virusneutralisatietest meet het neutralisatiepotentieel van een antilichaam of een mengsel van antilichamen tegen het bijbehorende virus. Het is een waardevolle techniek om de effectiviteit van vaccinkandidaten en neutraliserende antilichamen die tegen het virus zijn ontwikkeld, te evalueren. De plaque reduction neutralization test (PRNT) is een populaire methode om de titer van virusspecifieke neutraliserende antilichamen te evalueren. PRNT is echter niet haalbaar in het geval van niet-cytopathische virussen. Hepatitis E-virus (HEV) is een positief gevoel enkelstrengs RNA-virus, behorend tot de familie Hepeviridae. Het is wereldwijd een belangrijke oorzaak van acute virale hepatitis. Het vertoont geen cytopathisch effect in zoogdiercelkweek. Er is een vaccin tegen HEV beschikbaar in China. Vaccins of therapeutische antilichamen tegen HEV zijn echter niet beschikbaar in het grootste deel van de wereld. Verschillende laboratoria werken aan vaccinkandidaten tegen de HEV. Een neutralisatietest om de effectiviteit van HEV-vaccins te meten zal een zeer nuttig hulpmiddel zijn voor onderzoekers. Hier beschrijven we een fluorescentiereductie-neutralisatietest (FRNT) om de 50% neutralisatietiter (NT50) van anti-HEV-antilichamen te schatten. Anti-HEV ORF2-geneutraliseerd, of konijn-IgG-geneutraliseerde HEV, werd gebruikt om Huh7-cellen te infecteren, gevolgd door immunofluorescerende kleuring van het virale ORF2-eiwit. Fluorescentie-positieve cellen werden gekwantificeerd in de ImageJ-toepassing, en NT50 werd geschat op 2,1 x 103. Deze methode kan worden toegepast om de NT50 van anti-HEV-antilichamen te schatten die aanwezig zijn in gevaccineerde muizen-sera, door HEV teruggevonden individuele sera, en laboratoriumgeproduceerde anti-HEV-antilichamen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis E-virus (HEV) is een positief zintuig enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Hepeviridae-familie 1,2. Het veroorzaakt meestal zelfbeperkende acute hepatitis, maar kan chronische hepatitis veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen 3,4. Zwangere vrouwen lopen een hoog risico op het ontwikkelen van fulminant leverfalen, waarbij het sterftecijfer tot wel 30% kan stijgen. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldde wereldwijd ongeveer 19,47 miljoen gevallen van acute hep....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De goedkeuring van de institutionele ethische commissie (IEC) werd verkregen om een ontlastingsmonster te nemen van een HEV-geïnfecteerde patiënt die was opgenomen op de afdeling Gastro-enterologie van AIIMS, New Delhi. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten die aan het onderzoek deelnamen. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Virusisolatie en kwantificatie

  1. Met geïnformeerde toestemming kunt u het ontlastingsmonster van een HEV-geïnfecteerde patiënt verkrijgen voor zuivering van het viru....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infectie van Huh7-cellen met g1-HEV en viruskarakterisering

De g1-HEV werd geïsoleerd uit een fecaal monster met behulp van een reeks stappen, zoals geïllustreerd (Figuur 1A). Het genoomkopieaantal van de gezuiverde g1-HEV werd geschat met RT-qPCR, gevolgd door opslag bij -80 °C. Om virale infectie en replicatie te bevestigen, werden Huh7-cellen geïnfecteerd met 1,8 × 104 genoomkopie-equivalenten van d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT is een op immuno kleuring gebaseerde methode om het neutralisatiepotentieel van antilichamen te schatten. Het is gebruikt om NT50-waarden voor antilichamen tegen meerdere virussen te schatten, waaronder Denguevirus (DENV), Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) en Japans encefalitisvirus (JEV)23,24,25. Bij deze methode wordt het virus geïncubeerd met een tes.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van de Biotechnology Industry Research Assistance Council, Department of Biotechnology, regering van India, toegekend aan MS, S en BN. Het onderzoek in het MS-laboratorium wordt ondersteund door een kernsubsidie van het Translational Health Science and Technology Institute. SA wordt ondersteund door een functie als Project Research Scientist, gefinancierd door de Indian Council of Medical Research, regering van India. UB wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie van de Indiase overheid.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
Video Coming Soon

Related Articles