Method Article

Hepatitis E Virus Fluorescentiereductie Neutralisatietest voor het meten van neutraliserende antilichaamtiters

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is geen standaard virusneutralisatietest beschikbaar voor het Hepatitis E-virus (HEV), een niet-cytopathisch positief strengs RNA-virus. Hier wordt een fluorescentie-reductie-neutralisatietest (FRNT) beschreven op basis van kwantificering van fluorescerend gelabeld viraal capside-eiwit om de effectiviteit van anti-HEV-antilichamen te evalueren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De virusneutralisatietest meet het neutralisatiepotentieel van een antilichaam of een mengsel van antilichamen tegen het bijbehorende virus. Het is een waardevolle techniek om de effectiviteit van vaccinkandidaten en neutraliserende antilichamen die tegen het virus zijn ontwikkeld, te evalueren. De plaque reduction neutralization test (PRNT) is een populaire methode om de titer van virusspecifieke neutraliserende antilichamen te evalueren. PRNT is echter niet haalbaar in het geval van niet-cytopathische virussen. Hepatitis E-virus (HEV) is een positief gevoel enkelstrengs RNA-virus, behorend tot de familie Hepeviridae. Het is wereldwijd een belangrijke oorzaak van acute virale hepatitis. Het vertoont geen cytopathisch effect in zoogdiercelkweek. Er is een vaccin tegen HEV beschikbaar in China. Vaccins of therapeutische antilichamen tegen HEV zijn echter niet beschikbaar in het grootste deel van de wereld. Verschillende laboratoria werken aan vaccinkandidaten tegen de HEV. Een neutralisatietest om de effectiviteit van HEV-vaccins te meten zal een zeer nuttig hulpmiddel zijn voor onderzoekers. Hier beschrijven we een fluorescentiereductie-neutralisatietest (FRNT) om de 50% neutralisatietiter (NT50) van anti-HEV-antilichamen te schatten. Anti-HEV ORF2-geneutraliseerd, of konijn-IgG-geneutraliseerde HEV, werd gebruikt om Huh7-cellen te infecteren, gevolgd door immunofluorescerende kleuring van het virale ORF2-eiwit. Fluorescentie-positieve cellen werden gekwantificeerd in de ImageJ-toepassing, en NT50 werd geschat op 2,1 x 103. Deze methode kan worden toegepast om de NT50 van anti-HEV-antilichamen te schatten die aanwezig zijn in gevaccineerde muizen-sera, door HEV teruggevonden individuele sera, en laboratoriumgeproduceerde anti-HEV-antilichamen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis E-virus (HEV) is een positief zintuig enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Hepeviridae-familie 1,2. Het veroorzaakt meestal zelfbeperkende acute hepatitis, maar kan chronische hepatitis veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen 3,4. Zwangere vrouwen lopen een hoog risico op het ontwikkelen van fulminant leverfalen, waarbij het sterftecijfer tot wel 30% kan stijgen. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldde wereldwijd ongeveer 19,47 miljoen gevallen van acute hepatitis E (AHE) en 3450 sterfgevallen veroorzaakt door HEV wereldwijd in 20216. HEV wordt in ontwikkelingslanden voornamelijk overgedragen via besmet voedsel en water, vanwege slechte sanitaire voorzieningen, terwijl sporadische beroepsmatige infecties in ontwikkelde landen samenhangen met het consumeren van rauw of onvoldoende gaar vlees6. HEV is ingedeeld in acht genotypen. Genotype (g) 1- en g2- HEV infecteren uitsluitend mensen. g3- en g4-HEV hebben een breed scala aan gastherten, zoals mens, konijn, varkens, wild zwijn en hert. g5- en g6-HEV infecteren wilde zwijnen, terwijl g7- en g8-HEV kamelen infecteren. Een enkel geval van menselijke overdracht van g7-HEV is gemeld in het Midden-Oosten door consumptie van kameelvlees en melk 7,8. HEV-infectie komt vooral voor in landen met een laag tot middeninkomen. Er zijn verschillende uitbraken in het water gemeld in endemische regio's van Zuid- en Zuidoost-Azië, Afrika en Mexico, voornamelijk veroorzaakt door g1- en minder vaak door g2-HEV-infectie. Beroepsmatige sporadische infectiegevallen in ontwikkelde landen in Europa en Oost-Azië worden meestal veroorzaakt door de g3-HEV 6,7.

Het HEV-genoom is een 7,2 kb plus-streng RNA dat een 7-methylguaninekap bevat aan het 5′-uiteinde, drie open leesframes (ORF's) gevolgd door een poly-adenyleerd 3'-uiteinde. ORF1 codeert voor het niet-structurele polyproteïne, bestaande uit zeven verschillende domeinen: Methyltransferase (Met), Y-domein, Papain-achtige cysteïneprotease (PCP), V-domein, macrodomein (X-domein), Helica (Hel) en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp). ORF2 codeert voor het capside-eiwit, dat verantwoordelijk is voor de assemblage van virale capsiden. ORF3 codeert voor een fosfoproteïne dat als viroporine werkt en helpt bij virale uitgang9. Een extra open leesframe, ORF4, is aanwezig in de g1-HEV, die via een cap-onafhankelijk mechanisme wordt vertaald, met behulp van een intern ribosoom-intreeplaats-achtig element binnen de ORF1. De expressie van ORF4 wordt versterkt door endoplasmatisch reticulum stressveroorzakende verbindingen. ORF4 is voorgesteld om de g1-HEV replicatiecomplexassemblage10 te bevorderen.

Hoewel HEV zich niet efficiënt in vitro repliceert, zijn sommige virusstammen, geïsoleerd van hepatitis E-patiënten, succesvol vermeerderd in hepatocyten, longcellijn en colonepitheliale cellijn11. Het is echter moeilijk om het virus robuust te verspreiden in de gekweekte cellen. Infectieuze cDNA-kloon van g1-HEV (Sar55-stam) is gebruikt voor in vitro-studies, maar een efficiënte productie en vermeerdering van g1-HEV-stammen in gekweekte cellen is tot nu toe niet bereikt. Sommige g3- en g4-HEV-stammen groeien beter in gekweekte cellen12. Desalniettemin is het gezuiverde virus dat wordt geproduceerd uit cellen die zijn getransfecteerd met het in vitro getranscribeerde en afgekapte p6 HEV-genomische RNA niet voldoende voor meerdere assays. Daarbovenop zijn alle door celcultuur geproduceerde HEV-deeltjes quasi-omhuld, wat hun infectie beïnvloedt. Daarentegen is HEV die in besmet voedsel en water wordt gevonden niet-omhuld en zeer besmettelijk. HEV die aanwezig is in de ontlasting van patiënten is niet omhuld en is de meest voorkomende bron van natuurlijke infecties. Daarom zorgt het gebruik van HEV, gezuiverd uit de uitwerpselen van de patiënt, voor een efficiënte infectie in het zoogdiercelkweeksysteem. Onze eerdere studies hebben de betrouwbaarheid aangetoond van de door de uitwerpselen gezuiverde g1-HEV van patiënten bij het kwantificeren van virale replicatie in menselijke hepatomacellen (Huh7). Gezuiverd virus opgeslagen in -80 °C behoudt de infectie gedurende meerdere jaren en is gebruikt in meerdere onafhankelijke studies om de virale replicatie te schatten 10,13,14,15. Deze studie ontwierp een HEV-neutralisatietest met gezuiverde G1-HEV verkregen van een patiënt. Het virus werd gezuiverd, getiterd, gekarakteriseerd en opgeslagen in aliquots in -80 °C voor toekomstig gebruik in neutralisatietests. Omdat HEV niet-cytopathisch is, is de traditionele PRNT-methode niet nuttig om het virusneutralisatiepotentieel van anti-HEV-antilichamen te schatten. Er zijn verschillende pogingen gedaan om neutralisatietests voor HEV te ontwikkelen, waaronder een op flow cytometrie gebaseerde neutralisatieassay, een antigeen ELISA-kit gebaseerde neutralisatietest voor het detecteren van pORF2 die in celsupernatanten wordt uitgescheiden, een in vitro ELISA-gebaseerde bindingsassay, een RT-PCR-gebaseerde assay en een fluorescentie-gebaseerde neutralisatieassay 16,17,18,19,20. Een ELISA-gebaseerde assay detecteert indirect antistofbinding om de functionele neutralisatie van het virus te evalueren, maar kan de werkelijke infectie niet meten. De op flow cytometrie gebaseerde methode meet meestal het percentage geïnfecteerde cellen met behulp van een pseudovirus. De RT-PCR-gebaseerde neutralisatiemethode is ingewikkelder dan FRNT; Daarom is de kans op afhandelingsfouten groter. Aan de andere kant wordt de hier beschreven FRNT-methode beperkt door de beschikbaarheid van hoog-titer infectieus virus en beeldvormingsmogelijkheden. Desalniettemin is het een efficiënte methode om NT50 van anti-HEV-antilichamen te meten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De goedkeuring van de institutionele ethische commissie (IEC) werd verkregen om een ontlastingsmonster te nemen van een HEV-geïnfecteerde patiënt die was opgenomen op de afdeling Gastro-enterologie van AIIMS, New Delhi. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten die aan het onderzoek deelnamen. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Virusisolatie en kwantificatie

  1. Met geïnformeerde toestemming kunt u het ontlastingsmonster van een HEV-geïnfecteerde patiënt verkrijgen voor zuivering van het virus.
  2. Suspendeer het fecalmonster opnieuw in Dulbecco's fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS) bij 10% eindconcentratie (w/v) en centrifugeer bij 7800 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Gebruik handschoenen bij het hanteren van het HEV-ontlastingsmonster en maak het werkgebied na het werk schoon met 70% ethanol (voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast).
  3. Verzamel het supernatant en laat het door een 0,45 μm filter gaan.
  4. Voeg 8% PEG6000 bereid in 0,4 M NaCl toe aan het virussupernatant en incubeer 16 uur bij 0 °C.
  5. Centrifugeer het monster op 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  6. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 40 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Concentreer de suspensie tot 5 mL volume door middel van tangentiële stroomfiltratie (TFF) met een 30 kDa membraanpatroon. Filter het door een 0,2 μm filter in de bioveiligheidskast, maak aliquots en bewaar het bij -80 °C. Gebruik één aliquot om het totale RNA te isoleren en voer RT-qPCR uit.
  8. Gebruik meerdere verdunningen van pSK-HEV2 plasmide [pBluscript-vector met cDNA van een infectieuze kloon van g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng tot 0,000001 ng DNA/reactie bij 10x seriële verdunning) om een standaard te plotten voor kwantificatie van viraal RNA.
  9. Plot de grafiek met de hoeveelheid pSK-HEV2 DNA op de X-as en de bijbehorende Ct-waarden op de Y-as. Extrapoleer de concentratie viraal RNA uit de standaardplot.
  10. Kwantificeer het HEV-genomisch RNA-niveau uit de standaardplot en bereken het genoomkopienummer van het virus met de volgende formule: Aantal kopieën = ng*(aantal/mol) / basen *(ng/g)*(g/mol basen).

2. Infectie van Huh7-cellen met g1-HEV

  1. Neem een T75-fles met Huh7-cellen. Controleer onder de microscoop of de cellen samenvloeiend en gezond zijn.
  2. Verwijder het medium met een aspirator (voer alle stappen uit in de bioveiligheidskast). Voeg 10 mL DPBS toe, draai en verwijder het eruit.
  3. Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe, zodat het gelijkmatig over het oppervlak wordt verdeeld.
  4. Bred 30–60 seconden in een CO2-broedmachine totdat de cellen voor 90% losgelaten zijn.
  5. Voeg 5 mL volledig medium toe, verspreid het gelijkmatig over het gehele oppervlak van de T75 en pipetteer meerdere keren om een uniforme eencellige populatie te creëren, vrij van aggregaten.
  6. Breng de celsuspensatie over in een 50 mL conische buis, centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Aspireer het kweekmedium via de conische buis in de bioveiligheidskast.
  8. Voeg 5 ml volledig medium toe aan de buis en suspendeer de cellen tot een uniforme suspensie door zacht pipetteren.
  9. Neem 10 μL celsuspensie en leg het op een celteller-slide. Tel de cellen in 4 kwadranten en bereken het gemiddelde/mL.
  10. Zaad 0,5 x 106 cellen /put van een 6-well plaat in 2 mL DMEM (aangevuld met 10% FBS).
  11. De volgende dag verwijder je het medium, spoel je 1 mL DPBS in en voeg je 50 μL g1-HEV-virus toe (gelijk aan 4,5 × 10 4-genoomkopieën van het gezuiverde g1-HEV) in 1 mL serumvrij medium (SFM).
  12. Incubeer de cellen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
  13. Was de cellen met 500 μL DPBS en voeg vervolgens 2 mL complete media toe (DMEM aangevuld met 2% FBS).
  14. Incubeer de cellen 72 uur in een 5% CO2-incubator bij 37 °C.
  15. Ga verder voor stroomafwaartse assays.

3. RT-qPCR-toets

  1. Verwijder het groeimedium van de 6-well plaat (vanaf stap 2.15) en was de cellen met 1 mL DPBS.
  2. Voeg 1 mL TRI-reagens direct toe aan de 6-wellplaat om de cellen te lyseren. Pipetteer het lysaat meerdere keren op en neer, en doe het daarna over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL.
    OPMERKING: TRI-reagens is giftig als het wordt ingeademd, doorgeslikt of in contact komt met de huid. Gebruik beschermende handschoenen tijdens het gebruik van het reagens en vermijd het inademen van dampen. Gebruik het bij voorkeur binnen de chemische kap. Alle plasticwaren moeten RNAse-vrij zijn.
  3. Incubeer de monsters 5 minuten op kamertemperatuur. Voeg 0,2 mL chloroform toe, sluit de buis stevig af, en laat het dan 10–15 seconden vortexen (chloroform is gevaarlijk en giftig; behandel met de juiste PBM). Broed 2–3 minuten.
  4. Centrifugeer de monsters 15 minuten op 12.000 × g bij 4 °C. Breng de waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg 0,5 mL isopropanol toe aan de waterige fase en meng goed door de buis een paar keer om te draaien.
  5. Broed 10 minuten uit op kamertemperatuur.
  6. Centrifugeer 10 minuten op 12.000 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  7. Sussief de pellet opnieuw in 1 mL 75% ethanol. Centrifugeer 5 minuten op 7500 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  8. Laat de RNA-pellet 5–10 minuten aan de lucht drogen.
  9. Sussen de pellet opnieuw in 50 μL nucleasevrij water (NFW), incubeer bij 55 °C gedurende 10 minuten, meng met de hand en meet de RNA-concentratie met spectrofotometrie.
  10. Voer TaqMan-probe-gebaseerde eenstaps RT-qPCR uit met behulp van de volgende primers:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV Sonde: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonuclease P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP Probe: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTGCGGGG[BHQ1]3′.
  11. Bereken de relatieve kwantificatie van g1-HEV RNA met behulp van de 2−ΔΔCT-methode .

4. Immunofluorescentietest (IFA)

  1. Splits de Huh7-cellen zoals beschreven in eerdere stappen.
  2. Plaats de microscopie-kwaliteit glazen deklaag in een 12-well plaat en zaad 0,2 × 106 cellen per put in 1 mL volledig medium (DMEM aangevuld met 10% FBS).
  3. Infecteer de cellen met 1,8 × 104 genoomkopieën van de gezuiverde g1-HEV in 500 μL SFM. Incubeer de cellen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
  4. Was de cellen drie keer met 500 μL DPBS.
  5. Voeg 2 mL complete media toe (DMEM aangevuld met 2% FBS).
  6. Incubeer de cellen 72 uur in een 5% CO2-incubator, 37 °C.
  7. Was de cellen drie keer met 500 μL DPBS, en incubeer 5 minuten op kamertemperatuur tussen elke wasbeurt.
  8. Voeg 500 μL 4% PFA (paraformaldehyde) toe aan cellen en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur.
    OPMERKING: 4% PFA is schadelijk bij inademing, veroorzaakt huid- en oogirritatie en kan een allergische huidreactie veroorzaken. Voor de veiligheid draag beschermende handschoenen en oogbescherming bij het gebruik van het reagens en vermijd het inademen van dampen.
  9. Was de cellen met 500 μL DPBS, drie keer gedurende 5 minuten elk, en incubeer in DPBS gedurende 30 minuten.
  10. Voeg 250 μL blokkerende oplossing (5% Normal Goat Serum, 0,5% BSA, 0,3% Triton X-100 in DPBS) toe aan de cellen en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
  11. Verwijder blokkeringsoplossing, spoel één keer met 500 μL DPBS, en incubeer de cellen met 250 μL primaire antistoffen (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Normal Goat Serum, 1:500 verdunning van anti-ORF2 antilichaam of konijn IgG), 's nachts bij 4 °C.
  12. Was de cellen drie keer met 500 μL DPBS gedurende elk 5 minuten.
  13. Incubeer de cellen met secundair antilichaam (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Normal Goat Serum, 1:1000 verdunning van geitenantikonijn Alexa fluor 594 antilichaam) gedurende 1 uur bij RT.
  14. Was de cellen drie keer met DPBS gedurende 5 minuten per uur. Voeg 10 μL Prolong goud antifade reagens met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) oplossing toe aan de glazen glaas. Bevestig de cellen met de dekmantel, waarbij de cellen naar de DAPI-oplossing op glazen glaasjes wijzen, zodat luchtbellen ontstaan.
  15. Sluit de deklaag af met nagellak.
  16. Neem fluorescerende beelden in een confocale microscoop met een 60x objectief.
  17. Stel de microscoop in op fluorescerende signaalvisualisatie en -acquisitie.
  18. Eerst richt je de kernen in de diparaat die overeenkomen met nepcellen (ongeïnfecteerd) op 60x vergroting. Stel de drempelspanning en laser zo aan dat er geen achtergrondfluorescentiesignaal zichtbaar is. Controleer de controleantilichamen (konijn IgG) gekleurde preparaat en controleer dat er geen achtergrondfluorescentiesignaal zichtbaar is.
  19. Visualiseer dia's van HEV-geïnfecteerde cellen zonder de bovenstaande parameters te veranderen. Neem beelden in 1028 x 1028 pixels.

5. Fluorescentiereductie-neutralisatietest (FRNT)

  1. Virusneutralisatie en infectie van Huh7-cellen
    1. Splits de Huh7-cellen zoals beschreven in eerdere stappen. Plaats de coverslip in een 12-well plaat en zaad 0,2 × 106 cellen per put in 1 mL complete media (DMEM + 10% FBS).
    2. De volgende dag bereid je een 10-voudige seriële verdunning van antilichamen voor (anti-ORF2 en konijn IgG) in SFM met 25 μg/mL beginconcentratie van antilichaam in stappen van 1:10 tot 1:105 verdunning . Het eindvolume van de verdunning moet 100 μL zijn.
    3. Voeg 1,8 x 104 genomische kopieën toe die gelijkwaardig zijn aan de gezuiverde g1-HEV aan elke antistofverdunning.
    4. Incubeer het mengsel van antistoffen en virus bij een 5% CO2-incubator, 37 °C gedurende 1 uur.
    5. Verwijder de 12-wellplaat met Huh7-cellen (de vorige dag gezaad) en was de cellen met 500 μL DPBS.
    6. Voeg het antilichaam-virusmengsel toe aan de cellen en plaats de plaat in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
    7. Was de cellen met 500 μL DPBS.
    8. Voeg DMEM + 2% FBS-media toe aan cellen en incubeer de plaat in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 72 uur.
    9. Voer IFA uit zoals vermeld in sectie 4 (stap 4.7 en verder).
    10. Neem fluorescerende beelden van 5 willekeurige velden met een 10x objectief in 1028 x 1028 pixels.
    11. Sla de afbeeldingen op in JPEG/TIFF-formaat. Kwantificeer de fluorescentievlekken met behulp van ImageJ-analyse zoals hieronder beschreven.
    12. Om de afbeelding in ImageJ te analyseren, converteer je de RGB-afbeelding naar een 8-bits afbeelding. Klik op de afbeelding > typ > 8-bit.
    13. Pas de drempel van de afbeelding aan. Klik op de afbeelding > pas > drempel aan. Selecteer het onderste drempelniveau op 40 en het bovenste drempel op 255.
    14. Voor tellen selecteer je Analyseren> Deeltjes analyseren. Selecteer weergaveresultaten, maak resultaten duidelijk, vat samen, sluit randen uit en composieer ROI's. Selecteer toevoegen aan manager, voeg gaten toe en leg het over. Druk op OK en het aantal fluorescerende vlekken verschijnt.
  2. Schatting van NT50
    1. Bereken de % neutralisatie van elke verdunning met de volgende formule:
      % neutralisatie= 100-[(((ORF2-positieve cellen in verdunning)⁄(ORF2-positieve cellen in viruscontrole)) X 100]
    2. Bereken NT50 met de volgende formule:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      Waarbij, D1 = Verdunning waarbij het % neutralisatiepercentage onder de 50 ligt
      D2 = Verdunning waarbij % neutralisatie boven de 50 ligt
      N1= % neutralisatie onder de 50
      N2= % neutralisatie boven 50
    3. Bereken antilog van Log10 NT50 met behulp van een formule:
      NT50= 10log10 (NT50)
    4. Plot de grafiek van (gemiddelde±SD) van alle velden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infectie van Huh7-cellen met g1-HEV en viruskarakterisering

De g1-HEV werd geïsoleerd uit een fecaal monster met behulp van een reeks stappen, zoals geïllustreerd (Figuur 1A). Het genoomkopieaantal van de gezuiverde g1-HEV werd geschat met RT-qPCR, gevolgd door opslag bij -80 °C. Om virale infectie en replicatie te bevestigen, werden Huh7-cellen geïnfecteerd met 1,8 × 104 genoomkopie-equivalenten van d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT is een op immuno kleuring gebaseerde methode om het neutralisatiepotentieel van antilichamen te schatten. Het is gebruikt om NT50-waarden voor antilichamen tegen meerdere virussen te schatten, waaronder Denguevirus (DENV), Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) en Japans encefalitisvirus (JEV)23,24,25. Bij deze methode wordt het virus geïncubeerd met een tes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van de Biotechnology Industry Research Assistance Council, Department of Biotechnology, regering van India, toegekend aan MS, S en BN. Het onderzoek in het MS-laboratorium wordt ondersteund door een kernsubsidie van het Translational Health Science and Technology Institute. SA wordt ondersteund door een functie als Project Research Scientist, gefinancierd door de Indian Council of Medical Research, regering van India. UB wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie van de Indiase overheid.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNAOp bestelling gesynthetiseerd door Genscript en gekenmerkt in ons laboratorium14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband en medewerkers, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles