Oplossende micronaaldarray-patches vervaardigd met oplosmiddelgiettechniek en essentiële karakterisering van micronaald-gebaseerde biomedische apparaten

Samenvatting

Het huidige werk heeft als doel als praktische gids te dienen waarmee onderzoekers hun eigen DMP-apparaten kunnen voorbereiden met behulp van de oplosmiddelgietmethode, ook wel micromolding genoemd, en om basiskarakterisering uit te voeren.

Samenvatting

Micronaald-gebaseerde technologie heeft het veld van huid- en transdermale toedieningsonderzoek gerevolutioneerd en wordt tegenwoordig beschouwd als de meest eenvoudige manier om medicijnen via de huid toe te dienen. Het succes van Microneedle Array Patches (MAPs) is vooral te danken aan hun vermogen om de huidbarrièrefunctie te neutraliseren die de binnenkomst van topisch toegepaste geneesmiddelen tegenwerkt door pijnloos door de laag van het hoornvlies te doorboren. Oplossende MAPs (DMAP's) onderscheiden zich van andere MAP-gebaseerde apparaattypes vanwege de biocompatibiliteit van hun bestanddelen, de mogelijkheid tot zelftoediening door patiënten en het ontbreken van scherp afval dat na gebruik ontstaat. DMAP's zijn meestal gemaakt van polymere materialen die bij het inbrengen in de huid opnieuw dispersen wanneer ze in contact komen met interstitiële vloeistoffen, waardoor hun lading wordt vrijgegeven. Op laboratoriumniveau worden DMAP's meestal vervaardigd met behulp van de oplosmiddelgietmethode, waarbij negatieve mastermallen van de gewenste vorm en lengte van de MAPs worden gebruikt, waarop door medicijnen geladen polymere dispersies worden gegoten. Vervolgens worden ze gedwongen de holtes van de mal te vullen door middel van een centrifugale kracht of positieve druk. Na het drogen worden DMAP's vast en worden ze van de mastermallen verwijderd, waarna ze routinematig verschillende karakteriseringsstudies ondergaan voordat ze worden gebruikt. Deze assays omvatten doorgaans de studie van de mechanische eigenschappen van DMAP's, het bepalen van het restwatergehalte, ex vivo vermogen om de huidstructuur te penetreren, de werking van geneesmiddelafgifte en in vitro beoordeling van biocompatibiliteit.

Inleiding

Hoewel topische en transdermale toediening van farmacologisch actieve stoffen door en in de huid wordt beschouwd als een veelbelovend alternatief voor orale medicijntoediening, brengt dit aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege de natuurlijke huidbarrièrefunctie die door de laag van het thonehornshin wordt uitgevoerd. Deze beperking treft vooral grote moleculen, met name die met een molecuulgewicht >500 Da¹. Daarnaast is passieve diffusie door de huid van andere moleculen met specifieke fysisch-chemische eigenschappen, zoals opvallende hydrofiliteit of lipofiliteit, ook beperkt. Verschillende technologische strategieën zijn voorgesteld om deze barrière te overwinnen, waaronder iontoforese, sonoforese, elektroporatie, het gebruik van chemische versterkers, thermische methoden en nanosize-systemen. Toch vallen Microneedle Array Patches (MAPs) eruit vanwege verschillende voordelen: uitstekende effectiviteit in het neutraliseren van de functie van het stratum corneum, kosteneffectiviteit, een pijnloze ervaring voor patiënten en de mogelijkheid tot zelfbeheersing zonder^{medische hulp.}

MAPs zijn apparaten die microgrote naaldvormige uitsteeksels bevatten die de laag van het hoornvlies doorboren en de epidermale barrière omzeilen. Verschillende MAP-typen worden in de literatuur beschreven, namelijk: vaste, gecoate, oplossende, zwellende en holle MAPs. Oplossende MAPs (DMAP's) bestaan uit wateroplosbare polymeermaterialen en gebruiken een "poke and release"-strategie, wat hun extra interessante eigenschappen verklaart. Met name lossen ze op bij het inbrengen in de huidstructuur wanneer ze in contact komen met interstitiële vloeistoffen, waardoor hun inhoud wordt vrijgegeven. In vergelijking met de "poke and patch"-strategie van vaste MAP's, waarbij ze worden gebruikt om microkanalen binnen de huidstructuur te creëren die de doorgang van een vervolgens plaatselijk toegepaste formulering ^3,4 mogelijk maken, is de "poke and release"-benadering niet onderworpen aan de tijd dat microkanalen open blijven. De "poke and flow"-strategie vereist de voorbereiding van holle MAP's, waarvan de architectuur aanzienlijk complexer en moeilijker te vervaardigen is. Een extra voordeel van DMAP's is dat ze na toepassing geen scherp afval genereren, waardoor het risico op naaldsteekletsels en biologische besmetting wordt verminderd. Bovendien maakt hun eenvoudige en minimaal invasieve toepassing mogelijk zelfbeheersing door patiënten, wat hun gebruik ondersteunt in beperkte of geografisch afgelegen omgevingen waar de toegang tot getraind zorgpersoneel, medische infrastructuur en veilige systemen voor het verwijderen van scherpe voorwerpen^{beperkt is}. De wetenschappelijke gemeenschap die zich richt op dermale en transdermale geneesmiddelafgifte heeft zich steeds meer gewend tot MAP-technologie, met name DMAP's, om de beperkingen van de eerder genoemde strategieën te overwinnen. Hoewel de eerste publicatie over MAPs dateert uit de jaren 80, kende de technologie begin jaren 2000 een grote opleving. Sindsdien is het aantal publicaties exponentieel gegroeid, tot ongeveer 500 artikelen per jaar, tegenwoordig⁵.

DMAP's worden meestal vervaardigd met de oplosmiddelgietmethode of micromolding⁶. Deze productietechniek is gebaseerd op het gebruik van negatieve meestermallen van de gewenste MAP-vorm en lengte. Na het gieten van polymere dispersies geladen met geneesmiddelen of zelfs nanosize-systemen, wordt een externe kracht uitgeoefend om de micronaaldvormige holtes van de mastermal te vullen. Eenmaal gedroogd kunnen DMAP's voorzichtig worden verwijderd door ze eraf te pellen of de hoofdschimmel op te lossen met een chemisch middel. Deze mastermallen zijn gemaakt van verschillende materialen, waarbij polydimethylsiloxaan (PDMS) het meest voorkomt, dankzij de flexibiliteit en lage hechting, wat het deformen van DMAP's vergemakkelijkt. De voorbereiding van meestermallen wordt doorgaans uitgevoerd met lithografische methoden; echter, commerciële PDMS-mallen van verschillende vormen, lengtes en dichtheden van micronaalden zijn nu beschikbaar.

Hier wordt een richtlijn gegeven voor de bereiding van DMAP's met behulp van de oplosmiddelgiettechniek. In dit geval wordt het proces uitgevoerd met behulp van centrifugale kracht of het aanbrengen van positieve druk. Dit maakt een efficiënt kosten-protocol alternatief voor kostbare productiemethoden van MAP-gebaseerde biomedische apparaten mogelijk, waardoor een bredere groep onderzoekers MAPs kan integreren in hun huidgerelateerde onderzoek. Daarnaast omvat de essentiële karakterisering voor academische en fundamentele onderzoeksdoeleinden die voorafgaat aan in vivo testen, naaldlengte en geometrie, mechanische weerstand tegen compressie, prestatie bij ex vivo inbrenging, laad- en afgifte van geneesmiddel, restwaterinhoud, stabiliteit, ex-vivo geneesmiddelabsorptie en in vitro veiligheidsprofiel.

Protocol

De reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

1. Productie van oplossende micronaaldarrays door centrifugatie

1. Bereid de colloïdale waterige verspreiding van de bestanddelen van DMAP's voor door ze op te lossen in de juiste hoeveelheid water en krachtig te roeren. Afhankelijk van de geselecteerde polymeren en concentratie kan de dispersietijd variëren. Verwarm het water indien nodig matig (40-45 °C) om de verspreiding van het polymeer te vergemakkelijken.
   OPMERKING: De meest gebruikte polymeren voor de bereiding van DMAP's zijn poly(vinylpyrrolidon) (PVP), karayagom, hyaluronzuur (HA), poly(methylvinylether alt-maleïnezuur) (PMVE-MA), poly(vinylalcohol) (PVA), carboxymethylcellulose (CMC), chitosan, enzovoort, maar elk ander wateroplosbaar materiaal met optimale eigenschappen kan worden gebruikt. Voor de meeste formuleringen ligt de typische werkconcentratie tussen 5% en 30% w/w. Lagere concentraties leveren over het algemeen snel oplossende DMAP's op, terwijl hogere concentraties langzaam oplossende apparaten opleveren. De optimale concentratie moet echter empirisch worden bepaald door verschillende DMAP-prototypes te maken, omdat deze afhangt van het molecuulgewicht, de viscositeit en de gewenste mechanische eigenschappen van de micronaalden van het polymeer.
2. Laat de polymeren minimaal een nacht roeren om volledige dispersie te bereiken, terwijl luchtbellen verwijderd kunnen worden.
3. Centrifugeer de polymere dispersie als er luchtbellen blijven bestaan (1000 x g; 5 min; 25 °C).
4. Voeg de lading (geneesmiddel of nanodeeltje) toe bij de gewenste concentratie en roer matig tot het homogeen is zonder nieuwe luchtbellen toe te voegen.
5. Verwijder PDMS-mallen in platen met 12 putten. Hiervoor kun je de mallen in de putten plaatsen met modelleerklei, tandcement of een vergelijkbaar materiaal.
6. Giet 50 μL van het medicijngeladen polymere mengsel op de PDMS-mallen en centrifuge (3000 x g; 5 min; 25 °C). Draai daarna de platen 180° en herhaal het centrifugatieproces om te zorgen dat alle naaldvormige holtes worden gevuld.
7. Verwijder voorzichtig het overtollige polymere dispersie door medicijnen. Gebruik een pipet om de polymeerdispersie over te brengen als deze vloeibaar is; Gebruik een spatel als het erg stroperig is.
8. Herhaal het dubbele centrifugatieproces (stap 1.6) om eventuele door medicijnen belaste polymeerdispersie die tijdens de vorige stap overloopt, terug in de mal te plaatsen.
9. Droog de door medicijnen belaste polymere dispersie in de mallen onder vacuüm (600 mBar; 30 min; 25 °C).
10. Herhaal het protocol minstens twee keer van stap 1.6-1.9 om de juiste vulling van de mastermallen met de door medicijnen belaste polymere dispersie te waarborgen.
    OPMERKING: De centrifugale kracht kan geleidelijk worden verminderd door middel van 500 x g (25 °C) bij elke herhaling.
11. Bereid een sterk geconcentreerde polymere dispersie vrij van geneesmiddel voor om de basisplaat van het DMAP-apparaat te maken. Het zorgt ervoor dat het geneesmiddel dat aanwezig is in de dispersie gevuld in de malholtes niet terugstroomt naar de basisplaat.
12. Giet 50 μL van de vrij-geneesmiddel polymeerdispersie op de PDMS-mallen en verspreid door tweemaal te centrifugeren, inclusief middenpuntplaten, bij een draai van 180° (500 x g; 5 min; 25 °C; 2x). Na centrifugatie voeg je 100 μL van de dispersie toe aan elke mal, gevolgd door het toevoegen van nog eens 50 μL aan de basisplaat na 12 uur.
13. Laat de DMAP's 3-5 dagen op kamertemperatuur in de PDMS-mallen drogen in een droog-afdichtende uitdroger.
14. Demold de DMAP's van PDMS voorzichtig met een tang of haal ze eraf met scotch cellulosetape (Figuur 1).
15. Karakteriseer de vervaardigde DMAP's (zie stap 3).

2. Productie van oplossende micronaaldarrays door het uitoefenen van positieve druk

1. Ga verder zoals beschreven in de vorige sectie tot stap 1.5.
2. Giet 150 μL van het medicijngeladen polymeermengsel op de PDMS-mallen en plaats deze in een druktank.
3. Vul de druktank met lucht tot deze een druk van 3-4 bar bereikt gedurende minstens 15 minuten.
4. Verwijder voorzichtig het overtollige polymere dispersie door medicijnen. Daarvoor, als de polymeerdispersie vloeibaar is, gebruik je een pipet, terwijl je bij aanzienlijk viskeuze deze met een spatel verwijdert.
5. Herhaal druktoepassing (stappen 2.2-2.3) om eventuele door medicijnen belaste polymere dispersie die tijdens de vorige stap overliep terug in de mal te brengen.
6. Droog de door medicijnen geladen polymere dispersie in de mallen onder vacuüm (600 mbar; 30 min; 25 °C).
7. Bereid een sterk geconcentreerde polymere dispersie vrij van geneesmiddel voor om de basisplaat van het DMAP-apparaat te maken. Het zorgt ervoor dat het geneesmiddel dat aanwezig is in de dispersie gevuld in de malholtes niet terugstroomt naar de basisplaat.
8. Giet 0,2 g van de vrij-geneesmiddel polymeerdispersie op de PDMS-mallen en oefen een positieve druk uit, zoals beschreven in stap 2.3.
9. Ga op vergelijkbare wijze te werk zoals beschreven in de vorige sectie vanaf stap 1.13.

3. Karakterisering van DMAP's

OPMERKING: In deze stap werden methoden uitgevoerd waarbij menselijke en/of dierlijke huidweefsels werden gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Daarnaast werden de methoden waarbij dierenhuidmonsters werden gebruikt uitgevoerd volgens het 3R-principe voor dierproeven.

1. Visualiseer de DMAP's met een microcamera met de juiste vergroting om de naaldachtige projecties te onderscheiden⁷.
   OPMERKING: Als ze zijn geladen met een gekleurd medicijn of kleurstof, moet er een andere kleur worden waargenomen tussen de uiteinden en de basisplaat.
2. Bevestig de DMAP's aan een ondersteuningsapparaat en visualiseer de morfologie en lengte van micronaaldachtige projecties met optische microscopie. Er moet een scherpe puntstructuur worden geobserveerd. Noteer de lengte van micronaaldachtige projecties met de juiste software voor je optische microscoop.
   OPMERKING: Om de lengte van de micronaald met optische microscopie te meten, moeten MAPs loodrecht op de objectieven worden weergegeven. Lengtemetingen en de vorm van micronaaldachtige projecties moeten worden bevestigd door Scanning Electron Microscopy.
3. Evalueer de mechanische eigenschappen van DMAP's ten opzichte van de vervorming van de micronaalden na compressie op een vast oppervlak. Daarvoor plaats je het DMAP-apparaat in een commercieel verkrijgbare DMAP-applicator en pers je het 30 seconden samen tegen een roestvrijstalen vlak oppervlak. Na het comprimeren registreer je de lengte van de micronaaldachtige projecties en bereken je het vervormingspercentage door dit te vergelijken met de beginlengte volgens de volgende vergelijking⁷:
   
   Waarbij h_o en h_f respectievelijk de lengte van micronaalden vóór en na de compressie betekenen.
   OPMERKING: Indien beschikbaar, standaardiseert het gebruik van een texture analyzer de compressiekracht. In dat geval bootst een kracht van 32 N/array de gemiddelde duimkracht na die patiënten toepassen bij zelfbeheersende DMAP-apparaten.
4. Bepaal de voorlopige inbrengcapaciteit van DMAP's met een surrogaatmethode voor kunstmatige huid, gebaseerd op thermoplastische platen van olefine-type materiaal⁸. Daarvoor comprimeert u het DMAP-apparaat tegen acht gebonden vellen volgens de voorwaarden beschreven in stap 3.4. Het aantal gaten dat in elke laag wordt gemaakt, wordt waargenomen met optische microscopie of met een microscoopcamera, en het percentage penetratie op verschillende dieptes wordt berekend.
   OPMERKING: Commercieel verkrijgbare thermoplastische platen hebben meestal een dikte van 127 μm.
5. Bepaal de ex vivo inbrengcapaciteit van DMAP's met behulp van menselijke, varkens- of knaagdierhuidexplants die eerder zijn verwijderd en zorgvuldig getrimd. Maak de huidexplant schoon met overvloedig water door het 1-2 minuten in water te weken en plaats het vervolgens op een met aluminiumfolie omwikkeld schuimmateriaal met de kant van het stratum corneum naar boven gericht.
   1. Ga door met de invoeging onder de voorwaarden beschreven in stap 3.4. Laat de DMAP's in de huid worden ingebracht tot de micronaaldtoppen zijn opgelost. Als DMAP's worden geladen met een kleurstof of gekleurd medicijn, toont de kleuring van de binnen- en buitenzijde van de huid een succesvolle DMAP-invoeging⁹. Daarnaast kunnen microkanalen worden waargenomen door histologische analyse van huidsecties⁷.
      OPMERKING: Deze stap, waarbij ex vivo menselijke of dierlijke huid betrokken is, is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedkeuring van de ethische commissie voor Mens- en Dieronderzoek van de Universiteit van Valencia. Geïnformeerde toestemming werd verkregen waar van toepassing, en alle experimenten volgden institutionele en Europese ethische normen voor het gebruik van menselijk en dierlijk weefsel in biomedisch onderzoek.
6. Bepaal het restwatergehalte met thermogravimetrische analyse. Gewichtsverlies dat tot 100-110 °C wordt waargenomen wordt toegeschreven aan het resterende water¹⁰.
   OPMERKING: Afhankelijk van de literatuurbron is het maximale toegestane restwatergehalte 5%-10% van het totale gewicht om optimale drooglegging van DMAP's te waarborgen.
7. Kwantificeer de lading door de DMAP's onder te dompelen in 5-10 mL water (of alternatief, een geschikt waterig vrijlaatmedium voor het geanalyseerde geneesmiddel) bij 32-37 °C en de ladinghoeveelheid te kwantificeren met een optimale analysemethode.
   OPMERKING: UV-Vis spectrofotometrie wordt vaak gebruikt voor de analyse van kleine moleculen. Voor verbindingen met lage detectie- en kwantificatielimieten wordt high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) in combinatie met UV-Vis, fluorescentie of elektrochemische detectie sterk aanbevolen. HPLC in combinatie met massaspectrometrie kan worden toegepast wanneer uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit vereist zijn. De analytische bepaling van eiwit- en antilichaamladingen wordt doorgaans uitgevoerd met behulp van bicinchonininezuur (BCA) assays en immunoassays, zoals respectievelijk enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of Western blotting. Geneesmiddelvrijstellingsprofielen worden verkregen door bemonstering (0,2-1 mL) op vooraf bepaalde tijdstippen uit het vrijgaand waterige medium¹¹. Na elk bemonsteringspunt wordt het afgetrokken volume vervangen door hetzelfde volume getemperde releasemedia om fouten te voorkomen die verband houden met automatische concentratie van monsters.
8. Beoordeel de stabiliteit van DMAP's door de hierboven genoemde karakteriseringsassays te herhalen om ervoor te zorgen dat de kenmerken van DMAP's constant blijven tijdens de opslagperiode onder de ontworpen opslagomstandigheden.
   OPMERKING: Als de lading thermosstabiel is, worden DMAP's meestal opgeslagen bij kamertemperatuur (25 °C). Voor thermogevoelige werkzame stoffen worden DMAP's bewaard bij 4 °C. De relatieve luchtvochtigheid moet onder de 30% blijven. De stabiliteit van DMAP's wordt routinematig gemonitord gedurende een periode van zes maanden.
9. Bepaal de ex vivo huiddepositie en -absorptie via de huid met behulp van een Franz-diffusiecel (FDC) opstelling. Bereid hiervoor de huid voor zoals beschreven en breng de DMAP's in de huidstructuur gedurende 30 seconden, zoals beschreven in stap 3.6.
   1. Daarna lijm je de donorkamer van FDC op de huid met een geschikte hoeveelheid cyanoacrylaat. Wanneer gedroogd, bevestig je het huiddonorkamercomplex met de juiste klemmen¹² aan de receptorkamer. Ga ten slotte door met het steekproefprotocol zoals beschreven in subsectie 3.5.
      OPMERKING: Deze stap met ex vivo menselijke of dierlijke huid is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedkeuring van de Human and Animal Research Ethics Committee van de Universiteit van Valencia. Geïnformeerde toestemming werd verkregen waar van toepassing, en alle experimenten volgden institutionele en Europese ethische normen voor het gebruik van menselijk en dierlijk weefsel in biomedisch onderzoek. Als DMAP's langzaam oplossen, bevestig ze dan aan de huid met chirurgische kleefbanden om automatische uitstoot uit de huidstructuur te voorkomen.
10. Beoordeel in vitro biocompatibiliteit met behulp van metabole activiteitstests, zoals op tetrazolium en Resazurine gebaseerde assays, of proliferatietests, waaronder 5-Bromo-2'-deoxyuridine bromodeoxyuridine (BrdU) assays, volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Voorkeurscellijnen zijn keratinocyten, fibroblasten of melanocyten. Cellen die niet aan DMAP's worden blootgesteld, worden doorgaans gebruikt als negatieve controles, terwijl cellen behandeld met 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) als positieve controles dienen. De biocompatibiliteitsbeoordeling hangt af van het ontbindingsprofiel van de DMAP's. Voor snel oplossende DMAP's (oplossen binnen 24 uur) wordt de extractmethode gebruikt, waarbij het apparaat wordt opgelost vóór celblootstelling. Voor langzaam oplossende DMAP's wordt de direct contactmethode toegepast, waarbij het apparaat direct aan de zaadde putten wordt toegevoegd. Volgens de internationale normen ISO 10993-regelgeving worden cellevensvatbaarheidsresultaten >70% als niet-toxisch beschouwd.

Resultaten

Vervaardigde DMAP's moeten een homogeen uiterlijk aangeven met een succesvolle vorming van micronaaldachtige projecties, zoals weergegeven in Figuur 2A. Wanneer een gekleurde lading alleen in de micronaaldstructuur wordt geladen, kan een kleine hoeveelheid geneesmiddel de basisplaat van DMAP's besmetten door overloop van de uiteinden of onvolledige reiniging vóór het gieten van de vrij-geneesmiddel polymeerdispersie. Er is echter een duidelijk verschil waarg...

Discussie

Het hier beschreven protocol maakt de bereiding van DMAP's mogelijk. De veelzijdigheid en het brede scala aan polymeermaterialen die voor de productie van DMAP's kunnen worden gebruikt, maken echter de productie van oplosmiddeltjes met verschillende kenmerken mogelijk. De gepresenteerde resultaten komen overeen met sneloplossende DMAP's, aangezien ze zijn geproduceerd met PVP, een zeer waterdispergeerbaar polymeer in lage concentratie. De oplostijd van DMAP's kan eenvoudig worden aangepa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuur 12-well plate	N/A	N/A	Geen specificaties. Elke commerciële celcultuur 12-well plate is geschikt
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 G	Vervangbaar door elke andere centrifuge die aanpasbaar is aan celcultuurplaten
Methyleenblauw	Sigma Aldrich	66720	CAS 122965-43-9. Vervangbaar door elke andere kleurstof of merk
Modelleerklei	N/A	N/A	Geen specificaties. Elke commerciële modelleerklei is geschikt
Olefine-type thermoplastische platen	Amcor	PM996	Parafilm M
Poly(vinyl alcohol) (PVA) MW: 9-10 kDa	Sigma Aldrich	363146	CAS 9002-89-5. Vervangbaar door elke andere merk
Poly(vinyl pyrrolidone) (PVP) MW: 40 kDa	Sigma Aldrich	PVP40	CAS 9003-39-8. Vervangbaar door elke andere merk
Polydimethylsiloxane (PDMS) mallen	Micropoint Technologies	ST-06	Array naaldverdeling 15 x 15; Hoogte 600 µm; Basis 200 µm; Naald Pitch 500 µm. Vervangbaar door elke andere PDMS mal met andere holtevorm en lengte
Druktank	Protrima	AT-10HT	Vervangbaar door elke andere druktank die 4 bar druk ondersteunt