Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het effect van thymoquinon op Keap-1/Nrf-2 signalering, oxidatieve stress en gedrag bij ratten evalueren

252 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

13 maart 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol demonstreert hoe de effecten van thymoquinon op het Keap-1/Nrf-2-pad, biomarkers van oxidatieve stress en gedragsuitkomsten kunnen worden beoordeeld in een rattenmodel van subchronische deltamethrine-blootstelling.

Samenvatting

Recente ontwikkelingen in onderzoek naar pesticideblootstelling hebben de interesse in op antioxidanten gebaseerde beschermingsstrategieën vergroot. Thymoquinon (TQ), een bioactief stof afkomstig van planten, heeft een beschermende werking tegen verschillende giftige stoffen. Deze studie beschrijft een protocol om de effecten van TQ op oxidatieve stressparameters, de Keap-1/Nrf-2 signaalroute en gedragsuitkomsten bij ratten die zijn blootgesteld aan lage dosis Deltamethrine (DTM) te evalueren. Hier werden 24 volwassen mannelijke Wistar Albino-ratten (250 ± 20 g) willekeurig toegewezen aan vier groepen (n = 6/groep): controle, TQ, DTM en DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) en TQ (10 mg/kg) werden intragastrisch toegediend gedurende 30 dagen. Het lichaamsgewicht werd gedurende het hele onderzoek gemonitord. Locomotorische activiteit en angstachtig gedrag werden beoordeeld met de open veld-test op dag 31, en depressie-achtig gedrag werd beoordeeld met de gedwongen zwemtest op dag 32. Aan het einde van de experimentele periode werden plasma en hersenweefsels verzameld voor biochemische, histopathologische en moleculaire analyses. Oxidatieve stressmarkers, waaronder malondialdehyde, totale stikstofoxide-, glutathion- en sulfhydrylgroepniveaus, werden gemeten in plasma- en cerebrale cortexmonsters. Kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap-1) en nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf-2) expressieniveaus werden geanalyseerd met behulp van Western blotting en immunohistochemie. Dit protocol biedt een uitgebreide en reproduceerbare benadering voor het onderzoeken van door pesticiden veroorzaakte neurotoxiciteit en de modulerende effecten van antioxidantverbindingen.

Inleiding

Insecticiden worden veel gebruikt in de landbouw en in huiselijke omgevingen om plagen te bestrijden; Chronische blootstelling aan lage doses kan echter leiden tot milieuvervuiling en nadelige gezondheidseffecten bij zowel mensen als dieren. Dergelijke blootstelling, met name via besmet voedsel en water, is in verband gebracht met een verhoogd risico op neurologische aandoeningen en andere systemische toxiciteiten1.

Pyrethroiden hebben organofosfor-insecticiden grotendeels vervangen vanwege strengere regelgeving voor laatstgenoemde en hun relatief lagere zoogdiertoxiciteit. DTM, een type II pyrethroïde met een α-cyanogroep, behoort tot de meest gebruikte insecticiden wereldwijd en wordt beschouwd als zeer effectief tegen insecten2. Desondanks hebben experimentele studies aangetoond dat DTM-blootstelling oxidatieve stress en neurotoxiciteit induceert in diermodellen 3,4.

DTM is een zeer lipofiele verbinding die gemakkelijk de bloed-hersenbarrière doorbreekt en de neuronale functie verstoort door het openen van spanningsgestuurde natriumkanalen te verlengen. Dit effect leidt tot herhaalde neuronale vuren, verhoogde intracellulaire natriuminstroom en een verhoogde aanmaak van reactieve zuurstofstukken, wat uiteindelijk leidt tot oxidatieve schade, ontsteking en gedragsveranderingen, met name in kwetsbare hersengebieden zoals de hippocampus en cerebrale cortex1. Gezien de groeiende bezorgdheid over door pesticiden veroorzaakte neurotoxiciteit, is er steeds meer aandacht geweest voor op antioxidanten gebaseerde beschermende strategieën die afkomstig zijn van natuurlijke bronnen. TQ, een belangrijk bioactief bestanddeel van Nigella sativa essentiële olie, heeft krachtige antioxidante, ontstekingsremmende en neuroprotectieve eigenschappen5. Verschillende studies hebben de gunstige effecten aangetoond tegen chemisch geïnduceerde oxidatieve stress en neurodegeneratieve processen 5,6,7,8,9.

Een van de belangrijkste mechanismen achter de beschermende effecten van TQ is de modulatie van het Keap-1/Nrf-2 signaalpad. Deze route speelt een centrale rol bij het handhaven van de cellulaire redoxhomeostase door de expressie van antioxidanten en ontgiftende enzymen te reguleren. Onder oxidatieve stresscondities wordt de door Keap-1 gemedieerde repressie van Nrf-2 verlicht, waardoor Nrf-2 kan transloceren naar de kern en de antioxidantrespons-elementafhankelijke genexpressie9 kan activeren.

Omdat DTM-blootstelling veranderingen veroorzaakt op moleculair, biochemisch, histologisch en gedragsniveau, is één enkele analytische benadering onvoldoende om de volledige omvang van de neurotoxische effecten te vatten. Daarom integreert dit protocol gedragsbeoordelingen, biomarkeranalyses van oxidatieve stress, histopathologische evaluatie en moleculair onderzoek van het Keap-1/Nrf-2-pad om een uitgebreid en reproduceerbaar kader te bieden voor het bestuderen van door pesticiden veroorzaakte neurotoxiciteit en de modulerende effecten van antioxidantverbindingen zoals TQ.

Gezamenlijk benadrukt het hierboven samengevat bewijs de noodzaak van een geïntegreerde experimentele aanpak om de mechanismen achter DTM-geïnduceerde neurotoxiciteit te verduidelijken en potentiële beschermende interventies te evalueren. Door gedragsbeoordelingen te combineren met biochemische, histopathologische en moleculaire analyses van het Keap-1/Nrf-2-pad, maakt het huidige protocol een multidimensionale evaluatie van neuronale schade gerelateerd aan oxidatieve stress mogelijk. De interpretatie van de experimentele bevindingen binnen dit mechanistische kader benadrukt hoe TQ de redoxsignalering moduleert, weefselschade vermindert en gedragsuitkomsten verbetert in de context van subchronische DTM-blootstelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Institutionele Animal Experimentation Local Ethics Committee keurde het experimentele protocol goed onder registratienummer 68429034/35. De totale duur van het onderzoek was 32 dagen. Voorafgaand aan de experimenten werden dieren gewend aan standaard laboratoriumomstandigheden. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met institutionele en internationale richtlijnen voor dierenethiek. De experimentele materialen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

OPMERKING: Chemisch en biologisch afval werd afgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor laboratoriumveiligheid en afvalbeheer van de instelling. Zuren, basen en organische oplosmiddelen werden verzameld in aparte, gelabelde containers en afgeleverd bij de institutionele afdeling voor gevaarlijk afval. Biologische materialen en besmette verbruiksartikelen werden verzameld in biohazard-containers, gesteriliseerd en overgebracht naar de juiste institutionele faciliteit voor de definitieve verwijdering.

1. Experimenteel ontwerp

  1. Haal 24 volwassen mannelijke Wistar Albino-ratten van 250 ± 20 g uit het Animal Experiment Laboratory. Houd elke rat afzonderlijk in kooien op 24 ± 2 °C onder een licht/donker cyclus van 12 uur, met ad libitum toegang tot standaard rattenvoer en kraanwater.
  2. Verdeel de dieren willekeurig in vier groepen (n = 6 per groep): Groep 1: Controle (C), Groep 2: TQ, Groep 3: DTM, Groep 4: DTM + TQ.
  3. Los DTM (98% zuiverheid) op in maïsolie en dien 30 dagen in met een dosis van 1,28 mg/kg via intragastrische gave.
  4. Los TQ op in een dosis van 10 mg/kg in maïsolie en dien 30 dagen in via intragastrische gavage. Bereid alle medicijnoplossingen dagelijks vers voor en dien toe met een totaalvolume van 1 mL/kg.
  5. In de gecombineerde behandelgroep dient u direct na DTM TQ toe. Geef alleen maïsolie aan de controlegroep om rekening te houden met stress door gavage.
    OPMERKING: De DTM-dosis is geselecteerd op basis van eerdere literatuur om oxidatieve stress op te wekken zonder morbiditeit te veroorzaken en komt overeen met ongeveer 1/100 van de LD501.

2. Meting van lichaamsgewicht

  1. Meet het lichaamsgewicht op dag 1, 10, 20 en 30 van het onderzoek (Figuur 1).

3. Gedragsparameters

  1. Voer alle gedragstests uit onder gestandaardiseerde omstandigheden om consistentie te waarborgen. Neem zowel de Forced Swim Test (FST) als de Open Field Test (OFT) op met een bovenaanzichtcamera die een volledig overzicht van het testapparaat biedt. Houd de verlichting ongeveer 100–150 lux. Definieer immobiliteit als het ontbreken van actieve beweging, behalve minimale bewegingen die nodig zijn om houding en ademhaling te behouden. Maak alle testarena's tussen dieren schoon met 70% ethanol om reukeffecten te voorkomen.
  2. FST
    1. Voer FST uit op dag 32 om depressieachtig gedrag te evalueren. Voer 24 uur voor de 5 minuten durende testsessie een 15-minuten pre-test sessie uit om de dieren te laten wennen aan de wateromgeving en stress door nieuwigheid te minimaliseren. Voer geen gedragsbeoordeling uit tijdens de pre-testsessie.
    2. Plaats de ratten individueel in cilindrische containers (diameter: 35 cm, hoogte: 50 cm) met 30 cm water die 5 minuten op 25 ± 1 °C worden gehouden.
    3. Neem zwemmen, klimmen en immobiliteitsperiodes vast met een videocamera. Kwantificeer gedragsparameters in seconden uit video-opnamen10.
    4. Definieer gedragingen als volgt:
      Immobiliteit: Beschouw het dier als onbeweeglijk wanneer het blijft drijven zonder actieve bewegingen, waarbij slechts minimale bewegingen nodig zijn om zijn hoofd boven water te houden.
      Zwemmen: Definieer zwemmen als actieve horizontale beweging door de cilinder met gecoördineerde bewegingen van alle vier de poten.
      Klimmen: Definieer klimmen als krachtige, omhoog gerichte bewegingen van de voorpoten tegen de cilinderwand terwijl het dier in een verticale positie blijft.
    5. Als het dier volledig roerloos blijft, beoordeel het gedrag dan als immobiliteit volgens de vooraf gedefinieerde criteria.
    6. Pas tijdens de testsessie geen externe stimulatie of koerscorrectie toe. Laat het dier zich vrij gedragen gedurende de volledige periode van 5 minuten, tenzij er om veiligheidsredenen (bijv. verdrinkingsrisico) ingegrepen moet worden.
  3. VAAK
    1. Voer OFT uit op dag 31 om de locomotorische activiteit en angstachtig gedrag te beoordelen11. Registreer individuele bewegingen gedurende 5 minuten in een arena van 90 x 35 cm, verdeeld in 24 gelijke eenheden door zwarte lijnen.
    2. Kwantificeer de volgende gedragsparameters uit video-opnamen door een onderzoeker die blind is voor groepstoewijzing:
      Het aantal oversteekplaatsen met alle vier de poten (bewegingsactiviteit)
      Tijd doorgebracht in de midden- en perifere zones (angstachtig gedrag)
    3. Als een dier volledig stilblijft staan, noteer dan het gedrag als immobiliteit en ken geen overgangen toe voor die periode.
    4. Pas tijdens de testsessie geen externe stimulatie, herpositionering of koerscorrectie toe.
    5. Laat het dier zich vrij gedragen gedurende de hele periode van 5 minuten, tenzij er om veiligheidsredenen ingegrepen is.
    6. Maak de arena schoon met 70% ethanol tussen de dieren om geursignalen te elimineren.

4. Beoordeling van oxidatieve stressmarkers

  1. Voer alle procedures uit op dag 32. Diep verdoven ratten met intramusculaire xylazine (5 mg/kg) en ketamine (45 mg/kg). Bevestig diepe anesthesie door het ontbreken van de pedaalterugtrekkingsreflex. Verzamel ongeveer 3–5 mL bloed via een hartpunctie in EDTA-gecoate buizen.
  2. Volledige euthanasie door exsanguinatie onder diepe anesthesie en bevestig de dood vóór weefselverzameling. Centrifugeer bloedmonsters op 3.000 x g gedurende 10–15 minuten bij 4 °C. Verzamel voorzichtig plasma zonder de buffy coat te verstoren en bewaar aliquots bij −80 °C. Ontleed de hersenen snel op ijs. Scheid de linker hersenhelft en hippocampus voor biochemische analyses en vries in vloeibare stikstof (−80 °C opslag). Fixeer de rechterhersenhelft in 10% neutraal gepufferde formaline voor histologische evaluatie.
  3. Plasma-oxidatieve stressanalyses
    1. Plasma Lipid Peroxidatie (TBARS Assay)
      1. Centrifugeplasmamonsters (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Meng 0,5 mL plasma met 1 mL TCA–TBA–HCl-reagens (15% trichloorazijnzuur (TCA), 0,375% thiobarbiturzuur (TBA), 0,25 N zoutzuur (HCl)). Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 10 minuten en breng het supernatant over in glazen buizen. Voeg 50 μL 0,02% gebutyleerd hydroxytolueen (BHT) toe om kunstmatige oxidatie te voorkomen.
      2. Verwarm op 100 °C gedurende 15 minuten, koel af tot kamertemperatuur, centrifugeer op 1.000 x g gedurende 10 minuten, en meet de absorptie van supernatanten bij 532 nm10. Bereken de MDA-concentratie met behulp van de Beer–Lambert-wet
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm en worden uitgedrukt als nmol/mL plasma.
    2. Plasma Thiol (RSH) niveaus
      1. Meng 0,5 mL plasma met Tris-HCl-buffer (100 mM, pH 8,2) die 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 2 mM ethyleendiamintetraasynzuur (EDTA) bevat. Incubeer 5 minuten op 25 °C en centrifugeer (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Gebruik het supernatant voor analyse.
      2. Voeg 0,3 mM 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten. Meet de absorptie bij 412 nm10. Bereken RSH-concentraties met behulp van ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 en druk uit als μmol/L plasma.
    3. Plasma NOx-niveaus (Griessreactie)
      1. Deproteiniseer plasma met 0,3 M natriumhydroxide (NaOH) en 5% zinksulfaat (ZnSO₄). Centrifugeer op 20.000 x g gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant.
      2. Bereid nitraatvoorraadoplossingen voor (100, 10 en 1 mmol/L) en genereer een standaardcurve (1–100 μmol/L). Laad 100 μL supernatant (duplicaatputten) in een microplaat.
      3. Voeg 100 μL vanadium(III)chloride (VCl₃) toe, gevolgd door 50 μL sulfanilamide en 50 μL N-(1-naftyl) ethylenediamine. Incubeer 30–45 minuten op kamertemperatuur en meet de absorptie bij 540 nm10. Bepaal NOx-concentraties uit de standaardcurve en druk uit als μmol/L plasma.
  4. Weefseloxidatieve stressanalyses
    1. Gebruik ongeveer 100 mg weefsel van de linkerhersenhelft voor alle biochemische analyses.
    2. Weefsellipideveroxidatie (TBARS Assay)
      1. Homogeniseer weefsel (1:10 w/v) in ijskoude 10% TCA. Voeg een gelijk volume van 0,67% TBA toe en verwarm op 100 °C gedurende 15 minuten. Koel af en centrifugeer (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Meet de absorptie van supernatanten bij 535 nm. Bereken MDA met ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 en druk uit als nmol/g nat weefsel.
    3. Weefselglutathion (GSH) niveaus
      1. Homogeniseer weefsel in 10% TCA (1:10 w/v) en centrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Meng 0,5 mL supernatant met 2 mL DTNB-oplossing (0,4 mg/mL in 1% natriumcitraat)10. Meet onmiddellijk de absorptie op 412 nm. Bereken GSH met behulp van ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 en druk uit als μmol/g nat weefsel.
    4. Weefsel-NOx-niveaus (Griess-reactie)
      1. Homogeniseer weefsel in fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS) (1:5 w/v) en centrifuge (2.000 x g, 5 min). Deproteiniseer supernatant met 0,3 M NaOH en 5% ZnSO₄. Centrifugeer (3.000 x g, 20 min) en verzamel het heldere supernatant.
      2. Bereid nitraatstandaarden voor (1–100 μmol/L). Laad 100 μL supernatant in dubbele putten. Voeg VCl₃ en Griess-reagentia toe zoals hierboven beschreven. Incubeer 45 minuten bij 37 °C en meet de absorptie bij 540 nm10. Bepaal concentraties uit de standaardcurve en druk uit als μmol/g weefsel.
        VOORZICHTIG: Procedures met gevaarlijke chemicaliën, waaronder TCA, HCl, NaOH en organische oplosmiddelen, werden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische dampafzuigkap. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals laboratoriumjassen, chemisch bestendige handschoenen, beschermende brillen en, indien nodig, gezichtsschermen, werden in alle experimenten gebruikt. Alle chemicaliën werden behandeld volgens institutionele veiligheidsrichtlijnen en relevante materiaalveiligheidsgegevensbladen (MSDS).

5. Bepaling van Keap-1 en Nrf-2 niveaus door middel van Western blot-analyse

  1. Snijd hippocampaal weefsel in stukken van 50 mg en plaats het in homogenisatiebuizen met 500 μL RIPA-buffer aangevuld met een proteaseremmercocktail.
  2. Voeg een passende hoeveelheid magnetische kralen toe en homogeniseer op 1.000 x g gedurende twee cycli. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Breng het supernatant over naar het reinigen van microcentrifugebuizen en centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Houd monsters op ijs en bepaal de eiwitconcentraties.
  4. Meet eiwitconcentraties met een fluorometer met de Protein BR Assay Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Bereid 10% SDS–PAGE gels voor elektroforese. Stel de eiwitconcentratie aan naar 30 μg/μL.
  6. Voeg 4x Laemmli-buffer toe in een verhouding van 3:1 en vul aan met 10% β-mercaptoethanol. Verwarm monsters op 95 °C gedurende 5 minuten, en centrifugeer dan kort.
  7. Laad 5 μL eiwitmarker en 30 μg eiwit per baan. Gebruik gels op 110 V gedurende 60–90 minuten.
  8. Activeer PVDF-membranen in 100% methanol gedurende 3–5 minuten, en evenwichtig in 1× overdrachtsbuffer voor 10 minuten bij kamertemperatuur voordat je wordt overgebracht.
  9. Gebruik nat filterpapier en sponzen met transferbuffer en stel de transfer sandwich zorgvuldig samen, zodat luchtbellen volledig worden verwijderd. Voer eiwitoverdracht uit met een nat transfersysteem op 100 V gedurende 90 minuten bij 4 °C (constante spanning).
  10. Blokkeer membranen in 3% Bovine Serum Albumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker. Breng membranen 's nachts uit bij 4 °C met primaire antilichamen verdund in 3% BSA (Keap-1 en Nrf-2, 1:3.000; β-actine, 1:1.000).
  11. Was membranen 5 keer gedurende 5 minuten met 1 × Tris-gegebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 wasmiddel (TBS-T). Incubeer met een secundair antilichaam (1:15.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  12. Wasmembranen zoals beschreven en incubeer met een versterkt chemiluminescentiesubstraat (ECL) substraat (bijv. luminol-gebaseerd HRP-substraat) volgens de instructies van de fabrikant (gelijke volumes reagens A en B direct voor gebruik mengen). Breng voldoende substraat aan om het membraanoppervlak volledig te bedekken (ongeveer 1 mL per membraan) en incubeer 1–2 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Detecteer chemiluminescente signalen met behulp van een digitaal beeldvormingssysteem dat is uitgerust voor chemiluminescentiedetectie (geen specifieke excitatiegolflengte vereist, aangezien lichtemissie het gevolg is van HRP–luminol-reactie). Neem beelden met automatische belichtingsinstellingen en zorg dat de banden niet verzadigd zijn. Houd identieke belichtingsparameters voor alle monsters binnen dezelfde blootstelling.
  14. Voer densitometrische analyse uit met beeldanalysesoftware onder identieke ROI-selectie, achtergrondaftrekking en normalisatieparameters. Normaliseer de intensiteiten van de Keap-1- en Nrf-2-banden naar het bijbehorende huishoudelijk eiwit β-actine. Exporteer genormaliseerde waarden als .csv bestanden voor statistische analyse.

6. Histopathologische analyse

  1. Fixeer de rechterhersenhelft in 10% neutraal formaline gedurende 72 uur. Dehydrateer via een gegradueerde ethanolserie (70%–100%), inbed in paraffine en sectie bij 5 μm.
    Verkry coronale hersendoorsneden op het niveau van de hippocampale en entorhinale cortex volgens de stereotaxische coördinaten gedefinieerd in Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Gebruik de interactieve rathersenatlasviewer (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas om anatomische lokalisatie te verifiëren en te verfijnen11.
  2. Bereid vier opeenvolgende coronale doorsneden (5 μm dikte) voor van paraffine-ingebed hersenweefsel met behulp van standaard histologische procedures. Kleur de secties met hematoxyline en eosine (H&E) volgens conventionele protocollen12. Bekijk alle preparaten onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 200×. Zorg ervoor dat de histologische evaluatie wordt uitgevoerd door een blinde onderzoeker om waarnemersbias te minimaliseren13.
    OPMERKING: Deze procedure zorgde voor consistente anatomische vergelijking tussen groepen.
  3. Semikwantitatief wordt neuronaal verlies, cellulair oedeem, nucleaire pyknoose, inflammatoire infiltratie en vasculaire congestie beoordeeld in 10 willekeurige velden per sectie.
  4. Bereken de gemiddelde scores voor elke parameter per groep. De scorecriteria waren als volgt: 0 (geen, <5%), 1 (mild, <33%), 2 (matig, 33–66%) en 3 (ernstig, >66%; Tabel 1).

7. Immunohistochemische analyse van de reactiviteit van Nrf-2 en Keap-1 in de hippocampus en de entorhinale cortex

  1. Bereid 5 μm dikke secties voor uit de hippocampus en de entorhinale cortex en monteer deze op glazen glaasjes.
  2. Deparaffineer en hydrateer de secties, en spoel vervolgens in fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur.
  3. Incubeer secties met 3% waterstofperoxide gedurende 5 minuten om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Was secties met PBS
  4. Voer antigeenophalen uit door de glaasjes te verwarmen in een natriumcitraatbuffer (pH 6,0) gedurende 10–15 minuten. Laat de glaasjes 30 minuten afkoelen en was daarna met PBS.
  5. Incubeer opnieuw secties met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten om volledige remming van peroxidase te garanderen. Was secties met PBS.
  6. Breng 10 minuten een blokkeringsoplossing aan om niet-specifieke bindingen te verminderen. Incubeer de secties 's nachts bij 4 °C met primaire antistoffen tegen Nrf-2 (1:100 verdunning) en Keap-1 (1:200 verdunning). Was de secties na de incubatie met PBS.
  7. Incubeer secties met een geschikt secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was secties met PBS.
  8. Breng streptavidine–peroxidase aan op de secties en breng 20 minuten uit bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer (houd 95–100% relatieve luchtvochtigheid met een afgesloten incubatiedoos met bevochtigd filterpapier). Was de secties met PBS na de incubatie.
  9. Breng DAB-chromogeen aan en monitor de kleurontwikkeling onder een lichtmicroscoop met 100× vergroting. Stop de reactie door de glaasjes af te spoelen met kraanwater.
  10. Contrastkleur de secties met hematoxyline verdund 1:9 gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Spoel grondig af met PBS en gedestilleerd water. Bevestig de secties met een permanent montagemedium.
  11. Bekijk de gekleurde secties onder een lichtmicroscoop. Leg fotomicrografieën vast met ×400 vergroting uit 16 representatieve velden per sectie.
  12. Kwantificeer Nrf-2 en Keap-1 immunoreactiviteit met behulp van beeldanalysesoftware. Leg de gekwantificeerde gegevens vast en analyseer deze voor verdere statistische evaluatie.
  13. Voor immunohistochemische analyse opent u de afbeeldingen in ImageJ en kalibreert u met de Set Scale-tool. Converteer alle beelden naar 8-bits grijswaarden om intensiteitsmetingen te standaardiseren. Definieer handmatig interessegebieden (ROI's) voor positief gekleurde gebieden en aangrenzende achtergrondgebieden en sla deze op in de ROI Manager.
  14. Kwantificeer de kleuringsintensiteit met consistente H-DAB kleurdeconvolutie, gevolgd door identieke drempelparameters over alle monsters. Meet de gemiddelde grijswaarde, optische dichtheid en het percentage positieve gebied.
  15. Voor celgebaseerde analyse segmenteren we drempelbeelden met behulp van het Watershed-instrument en kwantificeren we positieve cellen met Analyze Particles. Alle gegevens werden geëxporteerd als .csv bestanden voor statistische analyse.

8. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met SPSS versie 29.0. Voer ruwe gegevens in in het tabblad Data View, waarbij elke rij een individueel dier vertegenwoordigt en variabelen gedefinieerd in het tabblad Variabelenweergave; de experimentele groep werd gecodeerd als een categorische variabele (Control, TQ, DTM en DTM+TQ).
  2. Beoordeel de normaliteit van de data met de Shapiro–Wilk-test door te kiezen voor Analyseren > Beschrijvende Statistieken > Verkennen, uitkomstvariabelen toe te wijzen aan de Afhankelijke Lijst en Groep aan de Factorenlijst, en Normaliteitsplots met tests in te schakelen. Voor normaal verdeelde variabelen voert groepsvergelijkingen uit met eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) via Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA, met beschrijvende statistieken en Levene's test voor homogeniteit van varianties ingeschakeld onder Opties.
  3. Wanneer een significant hoofdeffect is gedetecteerd, pas dan de post hoc-test van Tukey toe via het Post Hoc-menu om verschillen in paargewijze groepen te identificeren. Gebruik de testresultaten van Levene om variantiehomogeniteit te bevestigen (p > 0,05).
  4. Voor histopathologische scoregegevens die niet aan parametrische aannames voldeden, voer je niet-parametrische analyse uit met de Kruskal–Wallis-test door te kiezen voor Analyseren > niet-parametrische tests > Legacy Dialogen > K onafhankelijke monsters, gevolgd door Dunns post hoc-test met Bonferroni-correctie met de niet-parametrische testmodule Independent Samples.
  5. Exporteer statistische outputs en samenvattende tabellen als .xls of .csv bestanden, resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), en een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Lichaamsgewichtmetingen
Het lichaamsgewicht werd gemeten op dag 1, 10, 20 en 30. Ratten in de C- en TQ-groepen vertoonden een progressieve toename van hun lichaamsgewicht gedurende de experimentele periode, zonder significant verschil tussen deze groepen op dag 30. Daarentegen vertoonden ratten die aan DTM werden blootgesteld een significante vermindering van het lichaamsgewicht vergeleken met controles. Gelijktijdige toediening van TQ verminderde het gewichtsverlies ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont aan dat subchronische orale blootstelling aan DTM consistente gedrags-, biochemische, moleculaire en histopathologische veranderingen bij ratten veroorzaakt en dat TQ deze effecten effectief vermindert wanneer het gelijktijdig wordt toegediend. Door gestandaardiseerde gedragstests te integreren met oxidatieve stressprofilering, pathway-niveau analyse van Keap-1/Nrf-2 signalering en histopathologische evaluatie, biedt het protocol een robuust en reproduceerbaar kader voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten of concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek kreeg geen externe financiering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Thermo Scientific  69-78-3 
Benchtop centrifuge NF048Nüve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, United States7D2C10
BSA solution  Proteintech, United States)66201-1-Ig
Butylated hydroxytolueneSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatör Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM  Bayer TR01426058O
Hematoxylin–eosin Bio OpticaW01030708
Hydrochloric acidMerck7647-01-0
Image J software program NIH; Washington, U.S.A.https://imagej.net/ij/
Immunohistochemical staining kit Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Germanyhttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-autocut/
Light microscope Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)ethylenediamineThermo Scientific 1465-25-4
Nano Microplate ReaderBMG LABTECHSPECTROstar Nano
phosphate-buffered saline MerckP4417
Primary antibodies Keap-1 ProteintechCat No. 10503-2-AP, 1:200
Primary antibodies Nrf-2 ProteintechCat No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Assay Kit ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
sodium citrateMerck03-04-6132
Sodium Dodecyl SulfateThermo Scientific 151-21-3
sodium hydroxideMerck1310-73-2
Sodium nitrateMerck7631-99-4
Streptavidin Peroxidase Thermo Scientific SHRP248-B
sulfanilamideThermo Scientific  63-74-1 
thiobarbituric acid Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Tricarballylic acid, 99%Thermo Scientific Chemicals 139360500
Trichloroacetic acidThermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific  1185-53-1 
Vanadium(III) chlorideSigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750 Thermo Fisher Scientific systemhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1&gad
_campaignid=16224184202&gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-&gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Zinc sulfate solutionMerck7733-02-0

Referenties

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Effecten van thymochinonblootstelling aan deltamethrinantioxidatieve strategie ngedragsbeoordelingopenveldtestgeforceerde zwemtestWestern blottingimmunohistochemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.